大肠杆菌和农杆菌感受态的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理和操作步骤
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
大肠杆菌感受态的制作(农杆菌也行)
大肠杆菌DH5α感受态的制备：
采用《分子克隆实验指南》上所述的氯化钙二次重悬法（萨姆布鲁克等，2002）。
（1）吸取40µl E.coil菌液，接种于20 ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至OD600 = 0.5左右。
（2）吸取200 µl菌液转于另一新鲜的20 ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养约2.5～4 h至OD600 = 0.6左右，停止培养。
（3）培养液转入离心管中，冰浴10 min，4℃下5000 rpm离心6 min。
（4）弃上清液，用8 ml冰预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀，冰上放置30 min。
4℃下5000 rpm离心6 min。
（5）弃上清液，用2 ml冰预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀，冰上放置片刻后即制成感受态细胞悬液。
（6）感受态细胞悬液可在冰上放置，2～7小时内直接用于转化实验，也可加入15%高压灭菌过的甘油，混匀后，以每管100 µl分装于1.5 ml离心管中，置-80℃条件下保存备用。
农杆菌感受态细胞的制备
农杆菌感受态细胞的制备在科学的世界里，农杆菌这家伙可是个大明星，尤其是在植物基因工程中，简直就像是超级英雄一样的存在。
说到农杆菌，它是个很有趣的小家伙，特别是在我们想把新基因转移到植物里的时候，它的表现真是让人惊叹。
今天就来聊聊怎么准备感受态细胞，听起来有点高大上，其实就是让植物细胞准备好接受外来的基因，像小朋友期待新玩具一样，兴奋得不得了。
要准备的就是农杆菌的培养。
想象一下，咱们要给这些小家伙开个派对，当然要先让它们有个好环境。
选个合适的培养基，像是给它们铺一张舒适的床。
然后，温度、pH值、氧气这些条件也得一丝不苟，不能马虎。
温度太高，农杆菌可受不了，像人一样，热得直冒汗；温度太低，它们又会懒洋洋的，没精神。
要是培养基里的营养不够，嘿，那简直就是饿肚子的小朋友，没啥干劲。
就得让这些小家伙进入生长期，哈哈，听起来像在养宠物。
等它们长到合适的密度，咱们就准备好收割成果啦。
这时候，得小心翼翼地把它们从培养基里取出来，别把它们给弄伤了，像捧着刚出生的小宝宝一样。
取出的细胞要经过洗涤，洗去多余的培养基，确保它们干净得像新洗的衣服。
用生理盐水轻轻地重悬这些细胞，调成合适的浓度，让它们准备好迎接“客人”。
这里有个小窍门，嘿嘿，增加细胞的感受性。
可以用一些特殊的化合物，比如PEG，这玩意儿就像催化剂，能帮助细胞更好地接受外来的DNA。
想象一下，像是给小朋友加了点魔法，立马变得更加活泼，更有好奇心。
然后，得把想要转移的DNA和这些感受态细胞混合。
这个过程就像搭积木，得小心翼翼，别让它们散架。
把这个混合物在特定的条件下静置一段时间，让细胞慢慢适应，就像在等待一场盛大的聚会。
期间，要保持适宜的温度和环境，让它们尽情享受这个过程。
就要进行转化了。
这一步就像是给这些细胞送去了新玩具，兴奋得不得了。
把细胞和DNA一起放到农杆菌中，轻轻搅拌，别太猛，怕把小家伙们给搅晕了。
静置一段时间后，它们就会开始接受这些新基因，像在参加一场欢迎会一样。
大肠杆菌感受态制备及转化
大肠杆菌感受态制备及转化大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，常见于土壤、水体、人和动物的肠道等地方。
由于其易于培养和操作，成为生物学研究中常用的实验材料。
本文将介绍大肠杆菌的感受态制备及转化的过程。
感受态制备是指将大肠杆菌细胞从冻存状态恢复到活跃状态的过程。
为了保证感受态制备的成功，首先需要准备培养基和细菌菌种。
常用的培养基有LB培养基和SOC培养基，其中LB培养基适用于大肠杆菌的一般培养，SOC培养基则适用于感受态制备和转化实验。
培养基的配制需按照实验要求进行，注意消毒措施，避免污染。
感受态制备的过程一般包括以下几个步骤。
首先，将冻存的大肠杆菌菌种转移到预先加热的LB培养基中，进行孵育培养。
培养温度和时间根据实验需要进行调整，通常为37摄氏度下培养12-16小时。
其次，将培养物进行稀释，使其浓度适合后续实验操作。
最后，将稀释后的细菌液进行离心，去除上清液，沉淀后的菌体即为感受态大肠杆菌。
感受态大肠杆菌的转化是指将外源DNA导入到大肠杆菌细胞中的过程。
转化的前提是大肠杆菌细胞处于感受态，即细胞膜对外源DNA具有较高的通透性。
转化的关键是选择合适的质粒载体和转化方法。
常用的质粒载体有pUC19、pGEM-T等，这些载体具有含有抗生素抗性基因的特点，可以通过抗生素的选择来筛选转化成功的细菌。
质粒载体通常通过限制酶切与外源DNA进行连接，形成重组质粒。
将重组质粒与感受态大肠杆菌进行转化后，通过培养在含有抗生素的培养基上筛选，即可得到含有目标基因的转化菌落。
转化的方法有热激法、电穿孔法和化学法等。
热激法是将感受态大肠杆菌与重组质粒混合后，在高温条件下进行短暂的热冲击，使细菌细胞膜通透性增加，促进外源DNA的摄入。
电穿孔法是利用电场作用使细菌细胞膜产生孔隙，使外源DNA通过孔隙进入细胞。
化学法则是利用化学试剂改变细菌细胞膜的性质，增加其对外源DNA的吸收能力。
转化后的菌落需要进行筛选，常用的方法是通过抗生素选择。
大肠杆菌感受态的制备
大肠杆菌感受态的制备
标题：大肠杆菌感受态的制备
正文：
大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道菌群中的细菌，对于人类和动物的健康具有重要意义。
为了研究大肠杆菌的感受态及其在生物学过程中的作用，制备大肠杆菌的感受态成为了研究的重要一环。
首先，制备大肠杆菌感受态需要选择合适的培养基。
一般情况下，以富含营养物质的LB培养基作为基础培养基，通过添加适量的抗生素和其他所需的营养物质来促进感受态的形成。
此外，培养基的pH 值和温度也需要控制在适宜的范围内。
其次，制备大肠杆菌感受态需要在培养过程中引入外部刺激物，如温度变化、pH变化、营养限制等。
这些刺激物能够激活大肠杆菌的感受态，并促进其进一步的生长和适应环境。
在实验室中，可以通过改变培养条件来制备大肠杆菌的感受态。
例如，在培养基中添加一定浓度的抗生素，使得大肠杆菌进入感受态，以适应抗生素的压力。
此外，通过改变培养基的pH值和温度，也可以引发大肠杆菌的感受态。
需要注意的是，在制备大肠杆菌感受态的过程中，不得涉及版权等侵权争议。
所有实验数据和研究结果应遵守学术道德规范，并确保实验过程的透明和可重复性。
总之，制备大肠杆菌感受态是一个重要的研究方向，对于理解大肠杆菌的适应性和生物学过程具有重要意义。
在制备过程中，需要注意选择合适的培养基，引入适当的刺激物，并遵守学术道德规范，确保研究结果的可信性和可重复性。
感受态细胞制备的几种方法
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化，是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。
当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。
所以称这种现象为α-互补现象。
由互补产生的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。
所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法方法一：细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。
用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。
农杆菌感受态细胞的制备方法
实验一农杆菌感受态细胞的制备［目的及要求］了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
［实验原理］在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。
［实验仪器、材料和试剂］一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。
利福平（Rif）储液：50mg/ml20mM CaCl2，高压灭菌。
［实验步骤］1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；3、取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；4、加入1000µl 20mM CaCl25、13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500µl预冷的20mMCaCl，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr内使用，或液氮中速冻1min，置-70℃2保存备用。
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A 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第38页）
1 材料、设备及试剂
1.1材料
大肠杆菌DH5α、BL21、Rossette、JM109菌株
1.2试剂
LB液体培养基：
蛋白胨10g/L
酵母提取物5g/L
NaCl 10g/L
NaOH（1mol/L）1mL/L
400mL 0.1M/L预冷的CaCl2溶液（高温高压灭菌）
50%甘油
75%酒精
95%酒精
液氮
1.3 实验设备
接种环、酒精灯，打火机，75%酒精，95%酒精，50mL灭菌三角瓶4个，250mL灭菌的三角瓶4个，移液抢（5mL、200μL，1000μL），灭菌的枪头（5mL、200μL，1000μL），离心管（1.5mL，50mL）恒温摇床,灭菌锅，紫外分光光度计，超净工作台，制冰机，冰盒，高速冷冻离心机。
2 实验步骤
1、从新鲜培养的大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落，接种于5mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。
2、培养12～16h，取1ml培养物加入到100mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm 振荡培养至OD=0.4~0.6(3~4h)
3、在无菌条件下将菌液转移到250mL离心管中，置于冰上10min.
4、于4℃，3000rpm离心5～10 min，弃上清，收集菌体。
5、加入20mL预冷的0.1M/L CaCl2溶液重新悬沉淀，至于冰上30min（严格）
6、于4℃，3000rpm离心5～10 min，弃上清，收集菌体。
7、加入4 mL0.1M/L CaCl2溶液及15%(最终浓度)甘油（50%的甘油1.71428 mL），重悬沉淀。
8、以100μL每管分装于1.5mL冻存管中保存于液氮。
3 试验结果
4 注意事项
B 大肠杆菌DH5α感受态的制备（《褐飞虱胰蛋白酶基因的克隆、异源表达及产物的生化特性研究》第9页）
1、将置于液氮（-80℃）保存的大肠杆菌在LB平板上划线，37℃培养活化。
2、挑取经活化的大肠杆菌单菌落于NZY液体培养基，18℃，200-250rpm培养。
3、当OD600=0.7-1.0时，用预冷的50mL离心管，4℃，4000离心10min，收集菌体。
4、用-20℃预冷的TB Buffer重悬菌体,4℃，3000离心10min，收集菌体
5、重复步骤4
6、用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体,缓慢加入DMSO(二甲基亚砜)至浓度7%。
7、冰浴10min，分装保存于液氮中备用。
C E.coli DH5α感受态细胞的制备及转化
1 目的
学习掌握CaCl2法制备感受爱的原理和方法
学习掌握感受态细胞转化的原理和方法
把前面实验的两个连接反应结果和一种商品质粒进行转化实验
2 原理
2.1名词概念
感受态细胞：处于接受外源DNA的生理状态的细胞
细胞转化：从遗传学出发，转化是特指以质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌细胞，并使其生物学特性发生可遗传的变化。
细胞感染：指以噬菌体、病毒作为载体构建的重组DNA导入细胞的过程，使细胞发生可遗传的变异，它是与细胞转化概念相对而定义的
细胞致敏：用理化方法诱导细胞进入感受态的操作过程
2.2 原理
培养至对数生长期的E.coli DH5α菌在0摄氏度经过低渗CaCl2溶液致敏处理，就可成为高效的感受态细胞，这种感受态细胞与质粒混匀置0摄氏度30min，混合物中的DNA形成DNase羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，再经42摄氏度短时热激以促进质粒进入细胞实现转化，利用质粒上的遗传选择标记在LB平板上进行初步筛选转化菌落
3 材料、试剂和仪器
3.1 材料
菌株E.coli DH5α
质粒pBS
实验6的两个连接反应结果
3.2 试剂
LB液体培养基：
蛋白胨10g/L
酵母提取物5g/L
NaCl 10g/L
NaOH（1mol/L）1mL/L
固体LB培养基为在液体LB培养基中加1%琼脂粉
LB/Kan(50μg/mL)固体培养皿2个
LB/Amp(100μg/mL)固体培养皿3个
灭菌的0.1mol/L CaCl2
灭菌的去离子水
3.3 仪器用品
高速制冷离心机、超净台、42℃水浴、37℃培养箱、电子天平、制冰机、pH计、量筒（10mL,100mL,500mL,1000mL）烧杯（50mL,100mL,500mL,1000mL）、玻璃棒、镊子、微量移液器（1000μL，200μL）、吸头（1000μL，200μL）、1.5mL 离心管、平皿、灭菌锅及紫外分光光度仪等。
4 操作步骤
以下操作步骤要注意防止杂菌污染。
4.1
0~4℃保存菌种
↓
接种在LB,37℃250r/min,
↓
过夜菌：LB按1:30~100接种，37℃250r/min，活化培养2～3h，OD600=0.2~0.4
↓
加1.5mL菌液，放置冰上10min
↓
0~4℃，4000r/min，2min
↓
0~4℃，彻底弃上清的菌体
↓
加0.1mol/L CaCl20.6mL，缓和悬菌，放置冰上10min
↓
4000r/min，10min
↓
0℃彻底弃上清
↓
冰冷的0.1mol/L CaCl20.2mL，缓和悬菌，放置冰上待用
↓
分装在4个管中
冻融法制备农杆菌感受态（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第42页）
①制备YER液体培养基，使Rif终浓度分别为50mg/l,混匀后于4℃保存
②从YER平板挑取根癌农杆菌EHA105单菌落,接种于10ml YER液体培养基中，28℃，
200rpm振荡培养过夜。
取2ml培养液加到50ml YER液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至OD=0.5~1.0，冰浴30min.
4、在无菌条件下降菌液分装于40ml离心管中，于4℃，5000rpm离心5 min，弃上清，收集菌体。
5、用10ml冰冷的20mmol.L-1CaCl2溶液重悬菌体，于4℃，5000rpm离心5 min，弃上清，收集菌体。
6、用0.5ml冰冷的20mmol.L-1CaCl2（含15%甘油）重悬菌体。
7、以100微升每管分装到预冷的1.5ml冻存管中，-80℃保存。
农杆菌感受态的人制备（水稻MAPKK家族基因克隆及转基因研究第17页）
根癌农杆菌感受态细胞制备（OsMAPK4基因水稻突变体的培育及功能分析第16页）
1、挑取农杆菌LBA4404单菌落接种于5ml含有Sm50mg/L、Rif50mg/LYEB液体培养基中，28℃，200r/min振荡培养过夜（12小时）
2、取上述菌液按照1：10比例接种于50ml含有相应抗生素的YEB液体培养基中，200r/min 振荡培养5～6小时，至OD600为0.5左右，
3、将菌液冰浴30min
4、分装至1.5ml离心管中，5000rpm离心5 min，弃上清。
5、用100微升的预冷的20mmol.L-1CaCl重悬菌体，于4℃保存备用。