【精品】ELISA基础知识及常见问题的处理汇总
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常见的免疫检测方法，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
Elisa的操作方法和常见问题对于熟练进行实验和解决实验中的问题都至关重要。
以下是Elisa的常见类型、实验标准操作方法以及常见问题的详细介绍。
一、常见类型：1. 间接Elisa：该方法利用抗体的特异性结合性质来检测特定抗原。
首先，在官网上涂上反应性抗原的试样，然后添加能与抗原结合的一抗，再加入与一抗结合的二抗和标记物，最后通过颜色变化来测定抗原的含量。
2. 直接Elisa：该方法利用特异性抗体与抗原的结合性质来检测特定抗原。
在官网上涂上反应性抗原的试样，然后加入能与抗原结合的标记抗体和标记物，最后通过颜色变化来测定抗原的含量。
二、实验标准操作方法：1.样品制备：收集要检测的样品，并进行必要的处理和制备，如离心、稀释等。
2.官网涂布：将样品或标准物质涂在官网上，并在适当的温度条件下孵育一段时间，使其抗原完全吸附到官网上。
3.阻断：用适当的阻断缓冲液或血清阻止非特异性结合。
4.添加（初级）抗体：加入特异性的初级抗体，让其与官网上的抗原结合。
5.洗涤：用缓冲液洗涤掉未结合的初级抗体。
6.添加（二级）抗体：加入特异性的二级抗体，使其与初级抗体结合，并将标记物引入实验系统。
7.洗涤：用缓冲液洗涤掉未结合的二级抗体。
8.底物添加：加入含有底物的溶液，使底物被标记物催化，产生颜色反应。
9.反应终止：加入适当的溶液将反应停止。
10.测定：通过检测底物催化反应产生的颜色变化，使用酶标仪等设备测量并分析光密度。
三、常见问题：1.如何选择合适的抗体和标记物？2.如何优化实验条件？在实验过程中，可以通过优化浓度和孵育时间等条件来提高实验的敏感性和特异性。
可以尝试不同浓度的抗体和试剂，并对孵育时间和温度进行调整。
3.如何处理实验结果？实验结果通常会通过测量光密度来表示。
典型的Elisa实验结果可以使用标准曲线进行定量，或者通过比较样品和对照组的光密度差异来进行定性判断。
ELISA 出现的问题及解决方法
ELISA试剂盒可能出现的问题及解决方法问题及现象原因解决办法1整块板最终反应未产生颜色或整体吸光度值偏低1.室温过低或试剂未回至室温。
2.试剂失效。
3.试剂过失效日期。
4.试剂开启时间过长，污染。
5.移液器吸量不足，移液抽吸排放太快，吸头内壁挂液太多或者内壁不清洁。
6.反应时间不足。
7.洗涤时冲击力太大，洗涤液浸泡时间太长，洗涤次数增加。
1.控制室温并确保试剂回至室温。
2.与我公司联系。
3.更换新批号的试剂盒。
4.试剂开启后尽快用完。
5.校正移液器，吸头要配套，每次装吸头要吻合紧密。
移液不宜过快，排放应完全。
吸头内壁要清洁，最好一次性使用。
6.准确计时。
7.减少洗涤冲击力，按说明书要求浸泡时间，准确记住洗涤次数8.蒸馏水水质有问题。
9.样品添加了防腐剂，抑制了酶的反应8.测定蒸馏水配剂对酶联免疫的影响9.样品中不能添加防腐剂2整行或整列板孔最终反应产生颜色深，无梯度10.手工洗板时相对应的吸头与移液器接触不严，导致未吸上洗涤用水或吸上的水量不够。
11.洗板机洗板时相对应的管路阻塞，导致未注入洗涤用水或水量不够。
10.洗板前检查吸头是否接牢固，是否高矮一致并且在一条直线上。
如果在安装吸头时感觉不易安装牢固请不要使用。
曾发现过有的国内厂商的吸头不直，不易安装牢固，请不要使用，避免造成实验失败。
11.检查管路是否阻塞，出水不畅并疏通，检查注水量是否充分。
3标准曲线不成良好的S型，请与盒中的质检报告曲12.加完酶标记物之后的手工洗板步骤失败。
洗涤用水被板孔中游离的酶标记物污染。
12.注意加洗涤水的移液器吸头尖必须置于微孔板上方约1厘米处打出洗涤水，绝对避免注入板孔中的液体接触到或溅到移液器管尖上而将板孔线对比13.加完酶标记物之后的洗板机洗板步骤失败。
洗涤次数不够及注水量不够。
14.洗板后未立即进行下一步操作，中间间隔过长。
15.当板孔中含有两种以上的试剂时未能充分混均。
中游离的酶标记物带回到洗涤用水中。
ELISA实验做不好？我们为您汇总了常见的30个问题！
ELISA实验做不好？我们为您汇总了常见的30个问题！ELISA（免疫酶联吸附实验）是免疫学基础实验之一，大部分生命科学领域的科研工作者对其都不陌生。
因为其特异性强，灵敏度高，可精确定量的特性，在基础科研和临床诊断中，ELISA技术都应用广泛，相信很多关注我们的小伙伴也都做过ELISA。
ELISA实验步骤少，流程短，购买的即用型试剂盒也都有指导性很强的操作说明书，单次实验3-6小时即可得到结果，实验小白也可以很快的上手。
但是，各位同学可不要轻视哦，ELISA和WB、IHC等基础免疫实验一样，都是易学难精，上手容易，但想要得到稳定的结果，还是要花一点心思的。
小编在这里汇总了一些做ELISA的客户咨询我们的问题，把其中有代表性的集中做成了FAQ，大家快看看这其中有没有困扰你ELISA实验的问题吧~Q: ELISA可以检测胞内蛋白么？A:可以的，大部分ELISA指标均为炎症因子、趋化因子等分泌类型蛋白，支持的样本类型也多为血清、血浆、细胞培养上清等液体样本。
如需检测胞内蛋白，首先需要确认待测指标是否在胞内表达，然后选用支持组织匀浆样本的ELISA试剂盒即可，将组织样品或细胞样品进行裂解，提取胞内蛋白后进行蛋白定量，保证每孔上样总蛋白量一致即可。
Q: ELISA可以测DNA的表观么？A:不可以，ELISA是利用免疫学原理，定量检测蛋白质表达的技术。
测DNA表观遗传学，主要是检测DNA甲基化，可以选用ChIP 技术。
Q:夹心法ELISA实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么？A:不是的，在双抗夹心法ELISA实验中，会同时用到捕获抗体和检测抗体，这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体，这样才可以同时结合抗原分子。
这也是双抗夹心法ELISA不适用与小分子抗原和半抗原等待测指标的原因。
Q:试剂盒里面有捕获抗体么？A:即用型ELISA试剂盒中，捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上，没有单独的捕获抗体提供，直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。
ELISA常见问题和处理
ELISA常见问题和处理问题可能原因解决方法1、无颜色试剂孵育的时间没有按说明书操作。
确定生物素化抗体，连接的HRP试剂或链霉亲和素-HRP使用的时间是否适当。
2、不同试剂盒或不同批号的试剂混用。
重新检查试剂的标签，确准所有组分都属于正使用的试剂盒中的。
不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。
3、漏加酶检查操作流程，注意不要漏加5、HRP酶污染了叠氮钠使用新配制的试剂，禁含叠氮钠标准品有问题(若在标本孔中有信号)按说明书检查标准品的制备使用1瓶新标准品某一容器未洗净,残留灭活酶物质尽可能用试剂盒内容器,另觅一定要洁净、可靠使用含血清的缓冲液配制/复溶抗体重新确认所选用的试剂.漏加显色剂A或B加显色剂后观察一下液面高度试剂配制/使用有误将实验重做；严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签。
缓冲液污染配制新新鲜的缓冲液显色弱超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。
检查产品的有效期加入试剂的体积和时间有误确定所使用的每一个试剂的体积正确的和加入的时间是适当的。
试剂、样品用前未能平衡用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右缩短孵育时间能使实验的信号变弱。
检查孵育的时间。
在温度变化的环境内孵育酶标板。
确定孵育的温度，应避免温度的变化。
使用了被污染的试剂检查试剂是否被污染。
标准品/标本制备方法不规范检查标准品/标本的制备，标准品应按说明书进行复溶和稀释。
低温贮存的标本避免反复冻融，严禁使用溶血标本。
样品用NaN3防腐,抑制了酶的反应显色底物制备不规范检查底物的制备，如体积是否正确，混合是否恰当充分。
检测时间不当是否在规定的时间内检测。
仪器设定不正确，滤光片不匹配。
仪器是否设定正确，滤光片的使用等。
高背景(本底)洗涤操作不规范洗板不充分，使用手工洗板常出现。
最好使用洗板机，或使用洗瓶洗涤。
每孔应完全充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。
若使用洗板机，应校准并设定足够充满每孔的体积量。
板的内侧不应接触设备。
检查每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确。
《教学分析》-ELISA基础知识和注意事项
ELISA的基本原理
➢ 抗原或抗体在体外结 合到某种固相载体表 面后，仍然能保持其 免疫学活性而能相互 特异性结合。
抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下 显色，颜色的深浅与特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定 量分析。
ELISA的分类
测抗原：竞争法（也可用于测抗体）、双抗 体夹心法。
室内质控：实验室内部使用控制实验结果可 靠性的一种质量控制。
室间质评：用于考核各个实验室结果可靠性 的一种考核，可分为国家级和地方级的室间 质评。可以理解为 “各个实验室的质量评 比”。
临界值（CUTOFF值）：临界值是判断阴阳 性或有临床意义水平的数值，临界值的确定 是测定大量数据后应用统计学方法确定的。 许多试剂都会给出临界值或临界值的计算方 法。
本底：就是底色。如ELISA HBsAg，阳性 显色，阴性不显色，本底就是整个阴性显色 的情况。ELISA 抗–HBcAb，阳性不显色， 阴性显色，本底就是整个阳性显色的情况。
灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示 检测下限的能力。
相对灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性） ×100%
测定方法及表示方法：灵敏度标准品、质控 血清、阳性标本稀释终点、血清盘 （pannel）及临床标本阳性率。
测抗体：间接法、捕获法、双抗原夹心法
竞争法elisa
竞争法ELISA原理——标本中的抗原和一 定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，标本 中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗 原越少，显色越浅。
要用于小分子抗原或半抗原的定量测定，也 可对抗体进行测定。
竞争法ELISA
A
1.加样
3.孵育
3.显色
明是操作
温育
温度 水浴箱 发硬板应漂浮于水上或水面应高于反应板
ELISA中常见问题及解决方法：
ELISA中常见问题及解决方法：ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。
我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。
下面分析Elisa试验操作中可能影响结果的原因，并给出相应的解决办法1 选择试剂选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。
2 加样可能原因：1)血清或血浆标本分离不好即进行加样；2)手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)；3)加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。
解决办法：1) 标本为血清：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。
2) 加样后及时放入孵箱。
3) 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
4) 如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。
5) 标本较多时，请分批操作。
3 孵育可能原因：1) 孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；2) 孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。
解决办法：1) 贴封片或加盖；2) 按说明步骤严格控制操作时间。
4 洗板可能原因：1) 采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。
2) 采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。
3) 反应板过多造成洗板等待时间长。
解决办法：1) 保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干；2) 合理安排，或多用几台洗板机。
ELISA基础知识和注意事项解读
2019/2/26
捕获法ELISA
1.加样 2.孵育 3.洗涤
4.加入抗原
5.加入二抗
孵育
孵育
6.显色
2019/2/26
区别理解
检测抗原？抗体？
包被什么？ 标记什么？
2019/2/26
间接法和捕获法比较
间接法：假阴性，假阳性
捕获法：酶标抗体的要求较高
2019/2/26
间接法的假阳性
2019/2/26
室内质控：实验室内部使用控制实验结果可 靠性的一种质量控制。 室间质评：用于考核各个实验室结果可靠性 的一种考核，可分为国家级和地方级的室间 质评。可以理解为 “各个实验室的质量评 比”。
2019/2/26
临界值（CUTOFF值）：临界值是判断阴阳 性或有临床意义水平的数值，临界值的确定 是测定大量数据后应用统计学方法确定的。 许多试剂都会给出临界值或临界值的计算方 法。 本底：就是底色。如ELISA HBsAg，阳性 显色，阴性不显色，本底就是整个阴性显色 的情况。ELISA 抗–HBcAb，阳性不显色， 阴性显色，本底就是整个阳性显色的情况。
2019/2/26
检测抗原
双抗体夹心法ELISA
1.加样 2.孵育 3.洗涤
4.加入二抗
5.孵育
6.显色
包被特异性抗体
酶标特异性抗体
2019/2/26
双抗原夹心法
双抗原夹心法ELISA——检测标本中的总 抗体（包括IgM和IgG型抗体） 。将特异 性抗原包被于固相载体表面，与标本中特异 性IgM和IgG型抗体结合，洗涤后加入酶 标的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后 加入底物显色
4
恒温箱温度过高
注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在37±0.5℃。
ELISA 出现的问题及解决方法
ELISA试剂盒可能出现的问题及解决方法问题及现象原因解决办法1整块板最终反应未产生颜色或整体吸光度值偏低1.室温过低或试剂未回至室温。
2.试剂失效。
3.试剂过失效日期。
4.试剂开启时间过长，污染。
5.移液器吸量不足，移液抽吸排放太快，吸头内壁挂液太多或者内壁不清洁。
6.反应时间不足。
7.洗涤时冲击力太大，洗涤液浸泡时间太长，洗涤次数增加。
1.控制室温并确保试剂回至室温。
2.与我公司联系。
3.更换新批号的试剂盒。
4.试剂开启后尽快用完。
5.校正移液器，吸头要配套，每次装吸头要吻合紧密。
移液不宜过快，排放应完全。
吸头内壁要清洁，最好一次性使用。
6.准确计时。
7.减少洗涤冲击力，按说明书要求浸泡时间，准确记住洗涤次数8.蒸馏水水质有问题。
9.样品添加了防腐剂，抑制了酶的反应8.测定蒸馏水配剂对酶联免疫的影响9.样品中不能添加防腐剂2整行或整列板孔最终反应产生颜色深，无梯度10.手工洗板时相对应的吸头与移液器接触不严，导致未吸上洗涤用水或吸上的水量不够。
11.洗板机洗板时相对应的管路阻塞，导致未注入洗涤用水或水量不够。
10.洗板前检查吸头是否接牢固，是否高矮一致并且在一条直线上。
如果在安装吸头时感觉不易安装牢固请不要使用。
曾发现过有的国内厂商的吸头不直，不易安装牢固，请不要使用，避免造成实验失败。
11.检查管路是否阻塞，出水不畅并疏通，检查注水量是否充分。
3标准曲线不成良好的S型，请与盒中的质检报告曲12.加完酶标记物之后的手工洗板步骤失败。
洗涤用水被板孔中游离的酶标记物污染。
12.注意加洗涤水的移液器吸头尖必须置于微孔板上方约1厘米处打出洗涤水，绝对避免注入板孔中的液体接触到或溅到移液器管尖上而将板孔线对比13.加完酶标记物之后的洗板机洗板步骤失败。
洗涤次数不够及注水量不够。
14.洗板后未立即进行下一步操作，中间间隔过长。
15.当板孔中含有两种以上的试剂时未能充分混均。
中游离的酶标记物带回到洗涤用水中。
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有气泡、或吸头内残留液体过
液器吻合。移液不宜过快，排
多。
放要完全。
7
显色剂加量不足，或加入顺序颠倒。 按照说明书要求，先加入A液、后加
入B液，并保证加入量。
8
样品用NaN3防腐，影响了酶的活性。 不可以使用NaN3防腐。
9
试剂、样品使用前未平衡至室温。 试剂、样品从低温保藏条件中拿出
来后，要先平衡至室温方可以
本底：就是底色。如ELISA HBsAg，阳性显色， 阴性不显色，本底就是整个阴性显色的情况。 ELISA 抗–HBcAb，阳性不显色，阴性显色， 本底就是整个阳性显色的情况。
阴性对照及阳性对照：阴、阳性对照若有正确 的结果，对试剂盒操作的结果可以有粗略的判 断。
空白对照：对ELISA试剂来说，空白对照实际 上是不加标本不加酶做对照。空白对照主要测 系统的吸光率。空白对照在单波长测量时显得 尤其重要。
使用。
10 试剂开启时间过长，污染。
试剂开启后应该在尽可能短的时间 内用完，在保证正确贮存的前 提最长不要超过。
12 不同批号试剂中混用
不同批号试剂不能混用
假阳性多，本底高甚至花板
序 原因 号
1
试剂过期
2
加样时污染
3
加酶时污染
解决方法
过期试剂不能使用
注意更换吸头。尽可能避免污染。
❖ 如果数批产品都通过了特异性参比测定，是否产品的特异 性就一样了呢？不一定。因为特异性参比品的数量不可能 很大（样本与整体的差异），引起非特异性的因素很多， 目前尚不完全清楚。质控血清盘也存在同样的问题。
有关名词简介
❖ 质控血清：质控血清是为了对实验结果进行控制 而配制的血清。质控血清可以是定值也可以是不 定值，可以购置也可以自配。自己配制时要注意 选用无脂血的血清或血浆，不能用试剂盒内的阳 性对照。若用稀释的血清作为质控血清，应考虑 稀释基质成分对结果的影响。因质控血清与临床 标本不一致，应该注意对结果的分析，应该注意 质控血清只能用于质控活动，不可用于标定仪器 或评价方法。用于室内质控的质控血清一般选取 CUTOFF值2-3倍的质控品。
ELISA基础知识及常见问题的处 理
ELISA检测方法
❖ 夹心法: 双抗原（抗体）夹心法是检测抗原最常用的方法，其检测方法：
双抗原夹心： 固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标抗原Ag* → AgAb-Ag* + 底物(TMB)→显色
双抗体夹心： 固相(包被)抗体Ab + 样品(抗原Ag) + 酶标抗体Ab * → AbAg-Ab* + 底物(TMB)→显色
❖ 以下为ELISA试剂盒常见问题处理对策：
显色浅 灵敏度低
序号 原因
解决方法
1
试剂盒运输时间过长，受高温天气影响，酶的 试剂运输过程加放足够冰袋并尽可能缩短运输
活性降低。
时间。
2
试剂盒（包括未用完的板条及其他组分）保藏 试剂盒内所有组分都应当在4℃冷藏，未使用完
条件不正确。
的板条要密封保存。
3பைடு நூலகம்
试剂盒使用时已超出有效期。
诊断试剂所用的质量指标及相互关系：
灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示检测下限的能力。
❖ 相对灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100% ❖ 测定方法及表示方法：灵敏度标准品、质控血清、阳性标
本稀释终点、血清盘（pannel）及临床标本阳性率。 ❖ 灵敏度标准品可以从卫生部临检中心购买，质控血清可以
4
温育时间不够。
5
恒温箱温度达不到37℃。
过期试剂盒不可以使用。
严格按照说明书操作。
注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在 37±0.5℃。尽量避免频繁开关恒温箱门。
经常注意水箱中合适的水位。 在保证水不没过酶标板的前提下，使水位尽量
高，以保证反应温度。
6
加样量不足；移液时抽吸排放过快， 经常校正移液器。注意吸头要与移
❖ 室内质控：实验室内部使用控制实验结果可 靠性的一种质量控制。
❖ 室间质评：用于考核各个实验室结果可靠性 的一种考核，可分为国家级和地方级的室间 质评。可以理解为 “各个实验室的质量评 比”。
临界值（CUTOFF值）：临界值是判断阴阳性 或有临床意义水平的数值，临界值的确定是测 定大量数据后应用统计学方法确定的。许多试 剂都会给出临界值或临界值的计算方法。
特异性： 真阴性标本的检出能力。
❖ 相对特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）×100% ❖ 测定及表示方法：质控血清、血清盘、临床标本阴性率。 ❖ 质控血清、血清盘可以从卫生部临检中心购买，也可以自
己配制。自己配制时注意阴性标本的在血清盘中的比例以 及代表性。临床标本阴性百分率是临床使用中对试剂盒特 异性的粗略的判断。
从卫生部临检中心购买，也可以自己配制。因为质控血清 不一定是原倍血清，或由于片段、亚型、位点等原因，评 定试剂盒的灵敏度都带有一定的片面性。 ❖ 阳性标本稀释终点的方法常用于不同试剂盒的比较，但也 有上述的片面性。阳性pannel有些可以从卫生部临检中心 购买，如HBsAg阳性pannel，也可以自己配制。临床标本 阳性率，是一种粗略的估计，但对临床很实用。
❖ 间接法
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记 的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗 原结合的受检抗体，故称为间接法。
其检测方法：
固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标二抗Ab* → Ag-Ab-抗Ab* + 底物(TMB)→显色
❖ 竞争法 其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固
相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的 酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应：
固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标抗体Ab* → Ag-Ab + 底物(TMB)→不显色(+)
固相(包被)抗原Ag + 样品(无抗体Ab) + 酶标抗体Ab* → Ag-Ab* + 底物(TMB)→显色(-)
ELISA 试剂常见问题及解答
❖ ELISA试剂的原理基础为抗原抗体免疫反应，在生 产、储存、运输、使用等各环节中，对其质量特性 产生影响的因素众多。此外，其显色系统中的过氧 化物酶在生物样品中普遍存在，故在客户使用过程 中经常会产生某种非期望的结果。对问题进行客观 的分析、有针对性的解决问题，不仅是用户的希望， 也是促进我们自身产品质量提高的关键。