01-博士研究生课-高级生物化学与分子生物学-专题-mRNA分子的选择性剪接-黄东阳

剪接体的剪接
• 大部分剪接是依赖剪接体（spliceosome),这类内 含子称为剪接体内含子（spliceosomal introns)。 • 剪接体：由一些特殊的RNA-蛋白质复合体——小 核内核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoproteins，snRNP, 常发音为snurps) 与一些其它蛋白质构成。 • 每个snRNP含有一个100-200核苷酸长度的小核 内RNA（small nuclear RNAs, snRNAs)。 • 真核细胞细胞核内比较常见的剪接体snRNA有5 种，因富含U，故称U1,U2,U4, U5和U6。每种 snRNA至少与7个蛋白质亚单位（共约50种蛋白） 构成复合体snRNP ，这是一些从酵母到人类都高 度保守的核酸和蛋白质序列。
• 一个核糖2’-或3’羟基对RNA骨架中的磷 （phosphorus)发动亲核攻击（nucleophilic attack),原磷酸二酯键断开，形成新的磷酸二 酯键。 • Group I 剪接反应需要一个鸟嘌呤核苷即核 苷酸辅助因子（nucleotide cofactor )的3’羟 基作为剪接第一步的亲核基团 （nucleophile)，而不是作为能量。鸟苷3’羟 基与内含子的5’末端形成磷酸二酯键。露出 的外显子的3’羟基即可作为亲核基团去攻击 内含子的3’末端。最后导致内含子被精确切 除，外显子连接在一起。 • Group II内含子的反应形式与Goup I相似， 不同的是，第一步亲核攻击是由内含子当中 的adenosine (A)残基中的2’羟基担当并形成 一个分支的索套结构作为中间体。
• 原始转录本（primary transcript)：一个新合成 的RNA分子。真核生物的mRNA、tRNA分子和细 菌的tRNA分子的原始转录本受到广泛的修饰。 mRNA分子的原始转录本也称前体mRNA （precursor mRNA)，一般包含一个基因的全序 列，尽管编码多肽的序列可能是非连续的。 • 内含子（Intron）：一个转录本的分隔编码区域 的非编码序列。真核细胞基因的大部分都含有内 含子，但有少数例外，如：组蛋白基因(histone) 和酵母的一些基因。内含子长度一般在50-20,000 核苷酸之间。 • 外显子（exon):一个转录本的编码序列 （片段）。 真核生物的mRNA分子外显子的长度多在1000核 苷酸以下，以100-200核苷酸居多。 • 剪接（splicing)：将内含子从原始转录本移去并 将外显子连接在一起, 形成一个成熟的、功能性 RNA分子的过程。
SR蛋白质
• 因构成RNA的核苷酸仅有4种，5’，3’剪接位点或分支点等 关键序列以外，与之重复序列存在的可能性很大。因此， 正确的识别还需要许多其它蛋白因子，包括一类蛋白质家 族——SR蛋白的参与。SR蛋白结构特点是含有一个RNA 识别、结合区域和多个蛋白质相互反应区域， C端富含不 同长度serine-arginine的蛋白质，与剪接密切相关。 • 当与外显子的剪接增强子序列结合时，SR蛋白通过跨越 外显子的蛋白质相互作用网络，正确地介导U1 snRNP向 5’剪接位点，U2snRNP向分支点A结合。 • 在外显子上组装的SR蛋白质，snRNP和其它剪接因子 （U2AF等）的复合体称为跨越外显子识别复合体 （cross-exon recognition complex)。据此，可以对长长 的前体mRNA分子的外显子进行精确的特定。
• U2 snRNP配对、结合在分支点A附近（需 ATP），产生一个膨出，有助于活化分支点A的 2’-OH。 • U4、U5、U6附加（需ATP）形成非活性剪接体。 • 在ATP作用下剪接体内部重排，U1和U4离脱， U6同时与5’剪接位点和U2配对，剪接体活化。 • 完成剪接的第一步，内含子分支点中A的2’-OH 与内含子5’剪接位点的G的5’-磷酸基团通过第一 步转酯反应而结合，形成3’，5’-磷酸二酯键—— 构成套索（lariat)RNA结构。 • 内含子上游外显子刚刚游离的3’-OH与下游外显 子的第一个核苷酸的5’-磷酸基团进行第二步转酯 反应，形成3’，5’-磷酸二酯键，两个外显子相连。
• 现已发现的常见选择性剪接方式有以下几种： （1）外显子选择（optional exon):也称外显子跳跃 （exon skipping),是指在不同的剪接方式中，某 一个外显子（或几个外显子）可以在成熟的 mRNA中保留，也可以通过剪接过程被去掉。 （2）内含子选择（optional intron):内含子可以被完 全去掉，也可以有一个内含子被保留在成熟的 mRNA中。 （3）互斥外显子（mutually exclusive exon):一对 外显子中，在一种剪接方式中可在成熟的mRNA 中保留一个外显子，而在另一种剪接方式中在成 熟的mRNA中则只能保留另一个外显子。两个外 显子不能同时出现在同一个成熟的mRNA中。 （4）内部剪接位点（internal splice site):是通过对 外显子或内含子内部5’剪接供点或3’剪接受点的选 择，保留全部外显子或剪接掉某一外显子的部分 序列；或去掉全部内含子或保留某一内含子的部 分序列。
同一转录本在甲状腺产生降钙素，在脑则产生 降钙素基因相关肽（calcitonin-gene-related peptide, CGRP)
mRNA
Pre-mRNA
同种异型mRNA
人视黄醛还原酶mRNA的选择性剪接
剪接异常与疾病
• 最新的资料显示，至少有15%，可能多达50%的 人类遗传性疾病是由于共通剪接位点突变或更多 的辅助元件，如外显子内含子剪接增强子（ESEs 和ISEs)和沉默子（ESSs和ISSs)的突变。以至于 长期以来认为无害的蛋白质编码序列的同义变化 现在看来可以导致严重的剪接结果而遭致疾病。 • 大部分mRNA选择性剪接影响编码序列，其中一 半导致阅读框架的改变，1/3导致产物遭到NMD 清除。
RNA催化内含子剪接
• 有两种内含子（group I and group II)尽管剪接机 制在细节上有别，但共享一特点——自我剪接 （self-splicing)，没有蛋白质的参与。 • Group I 内含子存在于核、线粒体和叶绿体基因， 编码rRNA、mRNA和tRNA。 • Group II内含子多见于真菌、藻类和植物线粒体和 叶绿体mRNA的原始转录本。 • 偶尔也可在细菌中见到group I 和group II内含子。 • 两种剪接都不需要高能辅助因子如ATP等，但都 有两步转酯（基）反应（transesterification）。
• 外显子不仅编码蛋白质不同部分的氨基酸，而且含有SR蛋 白质结合的位点。发生突变时，即便不影响所编码氨基酸 的变化，但干扰了SR蛋白的结合，会导致该外显子被跳跃。 • 引起人类遗传性疾病的单一碱基对突变有15%干扰正常的 外显子界定，主要有三种情况：1）一些突变发生在5’或3’ 剪接位点，经常导致附近正常序列的隐性位点（cryptic site）被利用。因为正常的剪接位点缺失时，外显子识别复 合体识别这些替代位点；2）变异产生新的通用剪接位点代 替了正常剪接位点；3；像SMN2那样，变异干扰剪接相关 的蛋白与前体mRNA结合，从而增强或抑制剪接。 • 脊髓性肌萎缩（spinal muscle atrophy)是一种较常见的致 儿童死亡的遗传性疾病。它是由一对相近的基因复制 （gene duplication）产物，SMN1与SMN2所决定的。二 者编码同样的蛋白质，但正常SMN2基因的表达很低，因 为一个外显子发生沉默性突变，使得大部分产物发生外显 子跳跃而失去功能。小鼠仅有一个SMN拷贝，纯合子对于 生存是必须的。人类脊髓性肌萎缩是由于SMN1纯合子突 变导致失活，少量的SMN2仅能够维持胚胎期而不足以维 持儿童期发育而发病的。
初始转录本含有所有选择性加工途径所需 要的分子信号。
一种细胞偏好何种选择性加工途径取决于 加工因子——RNA结合蛋白的特异性。
选择性剪接可以被正负调节分子调节： 负调节：抑制蛋白质可以通过与原始转录本的结 合来防止剪接复合体切除内含子序列。
正调节：而不能正常剪接的剪接复合体可以在活 化蛋白的帮助下发挥剪接功能。
• 剪接体内含子在5’和3’末端一般分别含有双核苷 酸序列GU和AG，以决定内含子的剪接位点。 整个底物分子内含子中含有三个保守序列：（1） 5’端起始序列（GUAAGU),称为5’端剪接点，也 称剪接供体（splice donor);（2）内含子3’端末 尾序列：由(Py)nNPyAG组成，Py指嘧啶，n约 为10（这一段嘧啶称为嘧啶束 pyrimidine tract），N为任意碱基，3’端剪接点也称剪接受 体（splice acceptor);（3）在3’端序列的上游 18-40个核苷酸处也有一个保守的A，称为分支 点（branch point),酵母细胞是由UACUAAC组 成，保守性极强，哺乳动物分支点序列 （branch sequence) 保守性较差。 • U1 snRNA含有与核内mRNA内含子的5’剪接位 点互补配对序列, U1 snRNP与原始转录本的这 一区域结合。
5′加帽的作用在于：
①有助于保护mRNA免于被核糖核酸酶降解； ②协助 mRNA 的剪接。在剪接第一个外显子时， 剪接体的形成需要帽结合蛋白的参与； ③促进mRNA从细胞核运输到细胞浆； ④5′帽结合蛋白复合体参与 mRNA和核糖体的 结合来起始翻译过程 。
• 5’加帽、3’加尾以及剪接这三个步骤的加工 似乎不是分别单独进行，各自精巧的蛋白质 复合体有效地组织，相互连接并与磷酸化的 RNA聚合酶II（Pol II)C末端区域（Carboxyl termianl domain, CTD)连接，每个复合体影 响其它复合体的功能。 • 其它一些将mRNA转运至细胞浆的相关蛋白 也与mRNA 分子在核内相连，转录本的加工 与转运偶联。实际上，一个真核细胞的 mRNA分子刚一合成，就被包藏在由十几个 蛋白质组成的精巧的复合体中。复合体的组 成随着原始转录本的加工、转运到细胞浆乃 至派送到A的选择性剪接