戊二醛固定液的配制
多聚甲醛-戊二醛固定液说明书 - Coolaber
多聚甲醛-戊二醛固定液说明书产品编号：SL1580X保存条件：-20℃保存，一年有效。
4℃保存，一个月有效。
产品内容：产品组成SL177XX%戊二醛固定液10mL/100mL/500mL说明书1份产品简介：1.对于较大的动物要做电镜，灌注固定，选择4%多聚甲醛+（0.5-2%）戊二醛的混合固定液，这两种固定剂优缺点可以互相补充。
2.多聚甲醛与戊二醛相比，其渗透力强、固定迅速、价格低廉，它对细胞基质保存不如戊二醛，但对酶的活性保存好。
如果做免疫电镜或者电镜的细胞化学，则戊二醛浓度要低一些为好。
3.而且取材后固定的时间，方法也有讲究。
如果是个体较大的动物，也需要在具体试验中做一些处理，比如兔子，就可以只灌注头颈部。
小白鼠，数量也不多，做常规透射电镜，也可以用4%戊二醛灌注。
固定液成分选择：1、多聚甲醛+5%戊二醛：溶解2g多聚甲醛于25ml双蒸水中，80℃水浴，摇动使之溶化后加1-3滴1M NaOH，使溶液澄清。
冷却后加10ml25%戊二醛，再加15ml0.2PB,调pH备用。
此固定液中含多聚甲醛4%，戊二醛5%，属高渗液，但固定效果不错，尤其对细胞内的微管保存较好。
2、2%多聚甲醛+2%戊二醛：溶解1g多聚甲醛于25ml双蒸水中，80℃水浴，摇动使之溶化后加1-3滴1M NaOH，使溶液澄清。
冷却后加4ml25%戊二醛，再加21ml0.2PB,调pH备用。
常规固定选用这种配方。
3、4%多聚甲醛+0.5%戊二醛：溶解2g多聚甲醛于25ml双蒸水中，80℃水浴，摇动使之溶化后加1-3滴1M NaOH，使溶液澄清。
冷却后加1ml25%戊二醛，再加24ml0.2PB,调pH备用。
推荐用作免疫电镜标本固定剂，对于抗原较强的标本，可将浓度降低到2%多聚甲醛+0.25%戊二醛。
第1页共1页。
电镜生物样品前处理固定液配方
固定液配方一、戊二醛固定液:市售戊二醛为25%or50%水溶液，一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸盐溶液配制成所需浓度的固定液0.1mol/L 二甲砷酸钠缓冲液A液：二甲砷酸钠•3H2O 4.28g加双蒸水至100mlB液：HCL(36-38%) 1.66ml 加双蒸水至100ml按下表比例混合A、B液以配制0.2M二甲砷酸钠母液（在通风橱配制），加1倍双蒸水即得0.1M二甲砷酸钠缓冲液Na2HPO4•2H2O 35.6gNa2HPO4•4H2O 53.63gNa2HPO4•7H2O 71.64g100mlB液：NaH2PO4溶液NaH2PO4 24.0g/ NaH2PO4 •H2O 27.6g/ NaH2PO4 •2H2O 31.21g 加双蒸水至100ml二、四氧化饿固定液1、2%四氧化饿水溶液将0.5 or 1.0g装四氧化饿安踣瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶，在排毒柜5内将安踣瓶敲破，立刻加入双蒸水，配制成2%四氧化饿水溶液，盖上盖子，溶解1d.2、用0.1M磷酸缓冲液配制成四氧化饿固定液0.1M磷酸缓冲液5ml2%四氧化饿水溶液5ml三、karnovsky 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液1、10%多聚甲醛水溶液多聚甲醛2g双蒸水20ml2、固定液配制0.2M磷酸缓冲液50ml25%戊二醛10ml 双蒸水加至100ml10%多聚甲醛水溶液20ml染色液配方一、超薄切片染色液1、柠檬酸铅（Re ynolds’）溶液硝酸铅 1.33g柠檬酸三钠 1.76g切片染色时间5-10min 双蒸水30mlNOTICE:该溶液易与空气中CO2作用而产生沉淀，故使用与保存时，应尽量减少与空气接触，若稍有白色沉淀即舍弃2、醋酸双氧铀-50%饱和溶液醋酸双氧铀2g50%乙醇100ml切片染色时间15-30min（室温），延迟时间or提高温度可加反差NOTICE:溶液呈鲜黄色，若变淡则表示失效。
二、负染色液1、磷钨酸负染色液（PTA）磷钨酸1-2g双蒸水100ml2、醋酸双氧铀负染色醋酸双氧铀双蒸水3、钼酸铵负染色（AM）钼酸铵2g双蒸水。
戊二醛固定液的配制
戊二醛固定液的配制Step 1:0.2M磷酸缓冲液的配制：---------------------磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6克磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)29克双蒸馏水加至500毫升pH调至7.4Step 2:戊二醛固定液的配制：---------------------25% 戊二醛1ml双蒸馏水4ml0.2mol/L磷酸缓冲液5ml戊二醛最终浓度 2.5%pH值7.3-7.4戊二醛固定剂的配方：（a）磷酸缓冲液的配方：A液：0.2M磷酸氢二钠贮备液：Na2HPO4·9H2O 17.81 克或：Na2HPO4·7H2O 26.83 克或：Na2HPO4·7H2O 35.82克加双蒸水至500毫升B 液：0.2M磷酸二氢钠贮备液NaH2PO4·H2O 13.8 克或：NaH2PO4·2H2O 15.61 克加双蒸水至600毫升使用时将A液40.5毫升和B液9.5毫升混合成0.2M磷酸缓冲液。
（PH7.4）（b） 2.5﹪戊二醛固定液的配方：0.2M磷酸缓冲液50毫升25﹪戊二醛溶液10毫升加双蒸水至100毫升具体步骤如下：离心收集细胞，PBS漂洗两遍，双醛固定（2％多聚甲醛＋2.5％戊二醛。
双醛固定对免疫电镜更加适合。
）30min，PBS漂洗两遍，1％锇酸固定1h，PBS清洗3遍，用小的样品勺取出一点标本，置包埋板或小的离心管中，然后常规梯度脱水，浸透，包埋。
把细胞离心取沉淀细胞,,然后拿PBS液漂洗两遍后,倒去上清,直接加2.5%戊二醛固定后,送电镜室脱水、包埋、切片后置透射电镜下观察。
TEM电镜样品制作程序(新)
TEM电镜样品制作程序一、试剂1．磷酸缓冲液（Milloning p buffer）A液：2.53％NaH2PO4.2H2O水溶液41.5mlB液：2.52％NaOH水溶液8.5ml （0.3M, 50ml, pH7.3）2. 固定液1). 戊二醛（4％）：25％戊二醛原液16ml＋DDW 50ml，摇匀后加p buffer 50ml，终pH7.0~7.42).锇酸（四氧化锇）：配原液：1g＋50ml DDW 2％配固定液：2％原液/p buffer＝1/13.4. 染色液1).醋酸铀饱和乙醇溶液：醋酸铀5g,乙醇50ml2).柠檬酸铅染液：硝酸铅1.33g，柠檬酸钠1.76g，DDW 30ml二、常规操作步骤【第一天】取材取各组小白鼠♀♂各一只，处死后立即取小肠（消化管取材不应斜切，剪开管腔使之成片状，平铺，黏膜面朝上，最好将其四边固定，用生理盐水漂洗黏膜表面『注意：快，准，轻，小，冷』固定（前固定）戊二醛固定3～4h(可在戊二醛中长期保存--几周甚至1~2个月)『注意：固定液的酸碱度必须与被固定的组织的酸碱度基本保持一致，大多数动物组织酸碱度的平均值是7.4』用p buffer洗一次，共3次，后过夜【第二天】固定（后固定）向样品中加入0.2ml p buffer和0.2ml锇酸(共0.4ml,可事先在通风厨内配好)，2h后用p buffer清洗样品(在通风厨内操作)『样品可在p buffer中保存』配包埋剂(大约需1h，每加入一种试剂需搅拌15min)脱水（丙酮系列）30％，50％，70％，80％，90％（各一次，15min/次），无水丙酮（2次，10min/次）『注意：脱水要彻底；若当天不能完成浸透、包埋操作，应将样品停留在4℃，70％乙醇或丙酮中过夜；脱水动作尽量要快，特别是100％脱水剂，更要注意样品块不要在空气中停留时间过长，否则会造成样品干燥』配下一步浸透用的丙酮/树脂(1/1,1/2)浸透（丙酮－树脂）丙酮/树脂＝1/1，浸透1h（0.2ml,0.2ml）丙酮/树脂＝1/2，浸透1h（0.2ml,0.2ml+0.2ml）纯树脂，浸透（2h后即可包埋，也可隔夜再包埋）包埋树脂加满样品槽，呈凸面，标签纸放中间，样品放两边『注意：包埋剂用前不能搅拌，以免产生气泡。
最新复方戊二醛溶液
复方戊二醛溶液------------------------------------------作者xxxx------------------------------------------日期xxxx复方戊二醛溶液本品含戊二醛(C5H802)应为14.0％-16.0％(g/ml)，含烃铵盐以C22H40ClN计应为9.0％～10.0％(g／m1)。
[处方][制法][性状] 本品为琥珀色的澄清液体，有特臭。
[鉴别][检查] 相对密度本品的相对密度(附录33页)为1.030～1.040。
酸度取本品20.0ml，加水10ml与溴麝香草酚蓝指示液8滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液由橙黄色变为黄色，消耗氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)不得过3.0ml。
[含量测定] 戊二醛取本品适量(约相当于戊二醛0.2g)，。
精密称定，精密加6.5％三乙醇胺溶液20ml与盐酸羟胺的中性溶液(取盐酸羟胺17.5g加水75ml 溶解，加异丙醇稀释至500ml，摇匀，加0.04％溴酚蓝乙醇溶液15ml，用6.5％三乙醇胺溶液滴定至溶液显蓝绿色)25ml，摇匀，放置l小时，用硫酸滴定液(o.25mol／L)滴定至溶液显蓝绿色。
并将滴定的结果用空白试验校正。
另取本品，同时测其相对密度，将供试品量换算ml数。
每1ml硫酸滴定液(0.25mol/L)相当于25.03mgC5H802。
苯扎氯铵取本品适量(约相当于苯扎氯铵0.5g)，精密称定，置含有35ml水的250m1分液漏斗中，加0.1mol／L氢氧化钠溶液10ml与氯仿25ml，精密加入新制的5％碘化钾溶液10ml，振摇，静置使分层，水层用氯仿提取3次，每次10m1，弃去氯仿层，用水约15ml淋洗分液漏斗上部，加盐酸40ml，放冷，用碘酸钾滴定液(0.05mol／L)滴定至淡棕棕，加氯仿5ml，继续滴定并剧烈振摇至氯仿层无色，并将滴定的结果用空白试验校正。
扫描电镜细菌制样方法
细菌样品前处理取液体或固体培养基中培养20h左右、旺盛生长的菌体。
(1)收集菌体:①液体培养基中的菌体,可取培养液8000rpm离心3~5min,弃上清,倒入2.5%戊二醛固定液;②固体培养基上的菌体,可在菌落外表滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落(注意不要刮下培养基)。
将菌液吸入小离心管,离心后换入新鲜戊二醛固定。
(2)固定,脱水按常规方法。
2.5%戊二醛,2~4h→磷酸缓冲液清洗3次→1%锇酸4~6h→缓冲液清洗3次→乙醇梯度脱水,30%,50%,70%,85%,95%各一次,100%乙醇2次,15~20min/次→乙酸异戊酯置换2次,20min/次(注意:每步均需离心,8000rpm,3~5min,弃上清,倒入下一种试剂,滴管来回吸几下,打散菌块)。
(3)临界点枯燥: 普通定性滤纸裁成35mm×18mm的纸条,将长边35mm平均分成3份,对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状。
将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用钉书器将另一端钉牢。
放入临界点枯燥器样品室,进展CO2临界点枯燥。
一般每次可同时处理10~20种不同菌样(注意,需用液态CO2置换2~3次)。
(4)离子溅射金:沿两端书钉剪开滤纸包,将枯燥后粉末状纯菌体倒入平皿,轻摇尽量分散菌体。
碳导电胶带一面粘在1/4盖玻片上,另一面倒扣轻压在菌体粉末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。
离子溅射金后,即可进展扫描电镜观察。
细菌样品特殊制备方法；1，固体培养基中的菌体用镊子夹一小块盖玻片，轻轻放在旺盛生长的菌体上，粘附一定的细菌。
然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁，在棕色瓶内参加适量1%锇酸，盖上含有样品的瓶盖，熏蒸固定2h以上。
然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金，进展扫描电镜观察。
2，液体培养基中的菌体取一定的培养液，8000rpm离心3~5min，弃上清液，参加2.5%戊二醛固定2h，pH 7.2磷酸盐缓冲液清洗，然后参加蒸馏水稀释，充分混合后用滴管取混合液一滴于小块盖玻片上，吸附2min，用滤纸吸去多余溶液。
戊二醛-银染法
戊二醛-银染法
（基于Heukeshoven和Dernick的方法，根据以下方案，用戊二醛作为敏化剂进行硝酸银染色）
1.固定
凝胶电泳后，将凝胶在125mL 固定液中固定30分钟（固定液配方：40％EtOH / 10％HAc）
2.敏化
使凝胶在125mL敏化液中反应30分钟（敏化液配方：0.125％戊二醛/0.2％硫代硫酸钠/6.8％乙酸钠溶）
3.洗涤
用125mL去离子水洗涤三次，每次5分钟
4.银染
将凝胶用125mL银染液浸渍20分钟（0.015％甲醛和0.25％硝酸银溶液）
5.洗涤
随后用125mL去离子水洗涤两次，每次1分钟
6.显色
加入125ml显色液还原银离子（显示液配方：0.008％甲醛/3％碳酸钠溶）
7.终止
完成银离子还原后，将凝胶浸入125mL 1.5％EDTA中以停止显影
8.洗涤
用去离子水洗涤。
9.保藏
将染色的凝胶储存在去离子水中或在滤纸上在真空下在65℃下干燥40分钟。
电镜材料固定方法
1、固定液固定（固定液体积是固定材料的十倍以上）
3%戊二醛in 0.1M PBS ,ph7.2，室温5-6h，后4°C保存
（取材：先整个材料放入固定液中，之后用锋利的双面刀片分割，不能撕扯材料，分割成小块后1*1mm，置于固定液中，抽气~20min，让材料沉入固定液中）
2、0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
3、1%锇酸固定in 0.1M PBS，4°C overnight
4、0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
5、乙醇系列脱水：30%-50%-70%（4°C, overnight,可以停下）
-80%-90%-95%-100%-100%（每级20-30分钟，不同材料时间不同）
注意：100%乙醇时不要吸干，防止材料干了。
用丙酮置换乙醇：
乙醇：丙酮=1：1，纯丙酮2次，每级20-30分钟
6、丙酮：树脂=2：1，1：1（可以停下了，overnight），1：2 2-3h/级
纯树脂12h，
换纯树脂12h （从进入树脂开始就要防潮！）
7、包埋
8、聚合60°C 24hr
注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，固定液可以是25%戊二醛+1.25%多聚甲醛in 0.1M PBS Ph 7.2。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Step 1:
0.2M磷酸缓冲液的配制：
---------------------
磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6克
磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 29克
双蒸馏水加至500毫升
pH调至7.4
Step 2:
戊二醛固定液的配制：
---------------------
25% 戊二醛1ml
双蒸馏水4ml
0.2mol/L磷酸缓冲液5ml
戊二醛最终浓度 2.5%
pH值7.3-7.4
戊二醛固定剂的配方：
（a）磷酸缓冲液的配方：
A液：0.2M磷酸氢二钠贮备液：
Na2HPO4·9H2O 17.81 克或：Na2HPO4·7H2O 26.83 克
或：Na2HPO4·7H2O 35.82克
加双蒸水至500毫升
B 液：0.2M磷酸二氢钠贮备液
NaH2PO4·H2O 13.8 克
或：NaH2PO4·2H2O 15.61 克
加双蒸水至600毫升
使用时将A液40.5毫升和B液9.5毫升混合成0.2M磷酸缓冲液。
（PH7.4）（b） 2.5﹪戊二醛固定液的配方：
0.2M磷酸缓冲液50毫升
25﹪戊二醛溶液10毫升
加双蒸水至100毫升
具体步骤如下：
离心收集细胞，PBS漂洗两遍，双醛固定（2％多聚甲醛＋2.5％戊二醛。
双醛固定对免疫电镜更加适合。
）30min，PBS漂洗两遍，1％锇酸固定1h，PBS清洗3遍，用小的样品勺取出一点标本，置包埋板或小的离心管中，然后常规梯度脱水，浸透，包埋。
把细胞离心取沉淀细胞,,然后拿PBS液漂洗两遍后,倒去上清,直接加2.5%戊二醛固定后,送电镜室脱水、包埋、切片后置透射电镜下观察。