透射电镜样品制备固定液配方
透射点镜的生物样本的制样过程
透射电镜生物样品制作过程透射电镜生物样品制作过程大致经过取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤。
一. 取材取材时要注意的要点是：快、小、冷、净、准、避免机械损伤。
取材方法：将固定液滴在冰台上的卡片上，在麻醉后的动物身上快速用剪刀剪取一块组织，用预冷的过的缓冲液将剪下的组织洗净，迅速放到卡片上的固定液中，用刀片切去被镊子夹到和剪刀剪过的组织，后按实验的目的将组织切成0.5~1mm2的立方或横截面为1mm2的长方体。
用牙签将切好的组织块转移到装有固定液的小瓶中，贴好标签并置于4℃的冰箱中。
二．固定以下操作尽可能在4℃的环境下，使用的溶液也要保存在4℃的冰箱中。
1、戊二醛固定：用镊子轻轻的将组织块从固定液中取出，放在卡片上的固定液中，利用双面刀片把组织块切成小块状，放进盛有1~1.5ml的0.1%的戊二醛的固定液的细管中，将吸管放进真空箱中，将大气压抽到760托后取出，使组织块在戊二醛溶液中固定1小时。
2、漂洗：经戊二醛固定的组织块要用1~1.5ml的0.1%PBS缓冲溶液漂洗，漂洗的次数为5次，在漂洗到第四次时可以将组织留在PBS漂洗液中过夜，放入4℃的冰箱中。
第二天早晨再进行第五次漂洗。
3、四氧化锇固定：向漂洗过的组织中加入0.5ml的0.1%四氧化锇固定液，固定时间为2个小时。
由于四氧化锇具有毒性，因此操作在通风橱里进行。
4、漂洗四氧化锇：用0.1%PBS缓冲溶液漂洗剩余的四氧化锇，然后再漂洗两次，其时间间隔为10min。
三．脱水为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。
1、酒精脱水:用浓度梯度依次为30%、50%、70%、90%的酒精，依次浸泡组织，其浸泡的时间一般为10min。
当在70%梯度的酒精时，样品可以放置过夜。
2、丙酮脱水：用浓度梯度为90%、100%的丙酮浸泡组织，在纯丙酮中浸泡三次。
透射电镜样品制备
（2）浸透、包埋具体步骤：
① 浸透： a、包埋液与环氧丙烷1：1，37℃或常温1小时。 b、包埋液与环氧丙烷3：1，37℃或常温5小时或过夜。 c、纯包埋液37℃5小时，摆床或振荡器上浸透。
② 包埋与固化： 组织块用牙签挑入包埋管中，注满包埋液，置温箱
中 固 化 。 37℃ 、 12 小 时 后 ， 移 入 45℃ ， 24 小 时 ， 60℃，24小时。
5．超薄切片
（1）制备超薄切片的准 备
1）金属载网：
耐高温，无磁性；平整； 网孔大小合适，孔间距小， 价格便宜。 (一般直径3mm， 内有网孔200～300个)
50%→70%→80%→90%→无水乙醇（或丙酮）（2～3次） 每步10～20分钟（培养细胞时间可短些，致密组织时间长些）， 除无水乙醇（或丙酮）在室温下进行外，其余均应在4℃下进行。
可在70%乙醇中加2%铀盐块染：电子染色。
4．浸透与包埋：
是将组织块制成能进行超薄切片的硬块。
（1）包埋液的组成：
捞片——染色
6．超薄切片染色（正染）
染色的目的： 利用重金属盐与组织细胞的不同成份呈不同程
度的结合或吸附，从而造成这些成份对电子散射 能力的差异，散射电子多的结构在荧光屏上的图 像深暗，称电子密度高;反之即为浅亮，电子密度 低，从而起到增强图像反差的作用。
6．超薄切片染色（正染）
重金属盐有铀盐（如醋酸双氧铀）和铅盐（枸 椽酸铅）等。
【2】常用固定剂的特点
（1）戊二醛（Glutraldehyde） 1）2.5%戊二醛固定液的配制（见书） 2）固定原理及优缺点
电镜取样及固定液配制
固定方法：现在磷酸戊二醛固定液中固定24小时，然后换用新的磷酸戊二醛缓冲液永久固定
工具：手术刀两把，镊子两把，锋利的刀片，100ml蓝盖瓶8个
根茎叶取样：最后成熟稳定期取野生型和突变型的根茎叶组织
根：野生型和突变型取相同部位根的相同部位，根尖偏上部位
茎：野生型和突变型取茎相同节间的中间部位（例如第5节茎中间部位），用锋利的刀片切成1cm×0.2cm方块
叶：野生型和突变型取相同叶片的相同部位（例如第5片叶的中间部位），3cm×1cm
磷缓戊二醛固定液：以下两步配成
一、磷酸盐缓冲液配方
A液：0.2M磷酸氢二钠贮备液
磷酸氢二钠Na2HPO4·2H2O 35.61g
或Na2HPO4·7H2O 53.65g
或Na2HPO4·12H2O 71.64g
加双蒸水至1000ml
籽粒取样:
大粒野生型和小粒突变型授粉后分三个时期取样：5天，15天，35天
取样部位：野生型和突变型三个时期各自选取三株，每株取穗轴中部籽粒5-10粒
取样方法：将各个时期所取籽粒的左右两侧和上下两头切掉一部分，留中间部位，切成0.5cm×0.2cm大小（另外可以将各个时期取的样品保留3-5粒种子完整不切开存放在固定液）
B液：0.2M磷酸二氢钠贮备液
磷酸二氢钠NaH2PO4·H2O 27.60g
或NaH2PO4·2H2O 31.21g
加双蒸水至1000ml
C液：0.2M磷酸盐缓冲液:
pH(25℃)
A液
B液
7.2
36ml
14ml
二、磷缓戊二醛固定液配方
C液50mlPH
25%戊二醛溶液10ml 7.2
ห้องสมุดไป่ตู้加蒸馏水至100ml 7.2
电镜制片
一．取材： 组织块小于1立方毫米 二．固定： 2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或 更长时间。 用0.1M磷酸漂洗液漂洗 15分 三次 1%锇酸固定液固定 2-3小时 用0.1M磷酸漂洗液漂洗 15分 三次
三．脱水： 50%乙醇 15-20分 70%乙醇 15-20分 90%乙醇 15-20分 90%乙醇 90%丙酮（1：1） 15-20分 90%丙酮 15-20分 以上在4度冰箱内进行 100%丙酮 室温 15-20分三 纯丙酮+包埋液（2：1）室温 3-4小时 纯丙酮+包埋液（1：2）室温 过夜 纯包埋液 37度 2-3小时 五．固化： 37度烘箱内 过夜 45度烘箱内 12小时 60度烘箱内 24小时 六．超薄切片机切片 50-60 nm 七．3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色 八．透射电镜观察。拍片
包埋剂
环氧树脂(Epon)包埋剂: Epikote812 (Epon 812) 162ml DDSA(十二烷基琥珀酸酐)100ml(软化剂) MNA(甲基丙次甲基邻苯二甲酸 酐)89ml(硬化剂) DMP ～30(2,4,6,二甲氨基甲基苯酚) 3～ 4滴 60℃条件下,聚合48小时.
制刀机
半薄切片机
超薄切片机
透射电镜
透射电镜制样流程
透射电镜样品制备过程
组织取材（60s内），体积<1mm3，之后进行如下步骤
1）前固定：3%戊二醛2h或过夜。
2）漂洗：磷酸缓冲液，3次，10min/次。
3）后固定：1%锇酸固定液，2h。
4）漂洗：（同上）。
5）梯度脱水：50%丙酮，70%丙酮，80%丙酮，90%丙酮两次，各10min 。
100%丙酮两次，各15min。
6）渗透：丙酮/包埋剂（1:1,1:2），室温各1h。
丙酮/包埋剂1:3, 4度过夜。
纯包埋剂，4度过夜。
7）包埋：纯包埋剂（37度,45度,60度各24h）。
取出包埋块，进行超薄切片，片厚70nm。
分别采用醋酸双氧铀对切片进行染色30min，双蒸水漂洗3-5次，之后用柠檬酸铅
染色10min，双蒸水漂洗3-5次。
待切片干燥后，透射电镜观
察。
切片机型号：Leica UC7 超薄切片机，速度1mm/s.
透射电镜型号：日立高新HT7700，电压80kv 电流10μa.。
电镜缓冲液、固定液、染液配方
固定液配方一、戊二醛固定液:市售戊二醛为25%or50%水溶液，一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸盐溶液配制成所需浓度的固定液0.1mol/L 二甲砷酸钠缓冲液 A 液：二甲砷酸钠•3H 2O 4.28g加双蒸水至100ml B 液：HCL(36-38%) 1.66ml 加双蒸水至100ml按下表比例混合A 、B 液以配制0.2M 二甲砷酸钠母液（在通风橱配制），加1倍双蒸水即得0.1M 二甲砷酸钠缓冲液0.1mol/L 磷酸缓冲液 A 液：Na 2HPO 4溶液 2.84g Na 2HPO 4 / 3.161g Na 2HPO 4 •H 2O / 3.56g Na 2HPO 4 •2H2O /5.363g Na 2HPO 4 •4H2O / 7.164g Na 2HPO 4 •7H2O加双蒸水至100mlB 液：NaH 2PO 4溶液 2.40g NaH 2PO 4/ 2.76g NaH 2PO 4 •H 2O/ 3.121g NaH 2PO 4 •2H 2O 加双蒸水至100ml按下表比例混合A 、B 液以配制0.2M 磷酸缓冲液，加1倍双蒸水即得0.1M 磷酸缓冲液二、四氧化饿固定液 1、2%四氧化饿水溶液将0.5 or 1.0g 装四氧化饿安踣瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶，在排毒柜内将安瓿瓶敲破，立刻加入双蒸水，配制成2%四氧化饿水溶液，盖上盖子，溶解1d. 2、用0.1M 磷酸缓冲液配制成四氧化饿固定液 0.1M 磷酸缓冲液 5ml2%四氧化饿水溶液 5ml 三、karnovsky 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液 1、10%多聚甲醛水溶液 多聚甲醛 2g 双蒸水 20ml 2、固定液配制0.2M 磷酸缓冲液 50ml25%戊二醛 10ml 双蒸水加至100ml 10%多聚甲醛水溶液 20ml染色液配方一、 透射电镜正染色液1、柠檬酸铅（Re ynolds’）溶液 硝酸铅 1.33g 柠檬酸三钠 1.76g 切片染色时间5-10min 双蒸水 30mlNOTICE:该溶液易与空气中CO 2作用而产生沉淀，故使用与保存时，应尽量减少与空气接触，若稍有白色沉淀即舍弃 2、醋酸双氧铀-50%饱和溶液 醋酸双氧铀 2g 50%乙醇 100ml 切片染色时间15-30min （室温），延迟时间or 提高温度可加反差 NOTICE:溶液呈鲜黄色，若变淡则表示失效。
透射电镜生物样品前处理步骤
电镜样品制备步骤1、取材：放入2.5%戊二醛溶液中固定2-4h(4℃可保存1-2周，冷冻可保存2年)注：不可用自来水冲洗，被钳、镊夹取造成机械损伤的组织不可部分可取较大面积，但厚度必须小于1mm（戊二醛固定能力小于0.5mm）2、漂洗：牙签取出样品至新的1.5ml离心管，用0.1M pH7.0磷酸缓冲液（PBS）漂洗样品三次（摇床），每次15min3、锇酸固定与再漂洗：1%锇酸溶液固定样品1-2h（临用前计算用量≤50ul/样，用0.1M PBS将2%锇酸稀释至1%，通风橱操作），吸出固定液，用0.1M pH7.0 PBS漂洗样品三次，每次15min注：漂洗以清除固定液，避免产生沉淀物干扰结构观察4、脱水剂梯度脱水：用梯度浓度（50%，70%，80%，90%和95%）乙醇溶液对样品进行脱水处理，每个浓度处理15min再用100%乙醇处理20min （乙醇细胞内抽提少，但与包埋剂相容性差）最后用纯丙酮处理20min（若包埋剂为Epon改用环氧乙烷置换）注：脱水以清除游离水以便包埋剂均匀渗透；脱水剂易吸收空气中水分，密封，置换时应该迅速由低到高逐级脱水而不能急剧脱水，更换溶液时应迅速，以免组织内外产生气泡。
5、包埋剂梯度渗透：①用包埋剂丙酮混合液（V/V=1/1）处理样品1h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)②用包埋剂丙酮混合液（V/V=3/1）处理样品3h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)③纯包埋剂渗透样品过夜：将样品移至干燥的新离心管中，常温过夜(所用器具均应干燥)注：样品周围不能有气泡6、加热聚合：牙签取出经渗透处理的样品至0.5ml干燥离心管（预先装入约300ul包埋剂），加热聚合仪70℃加热过夜。
7、莱卡EM UC 7超薄切片仪修快、切片（50-70nm）8、正染色：塑料包埋模具（刀划几道缝隙），染色时温度低影响染色效果，冬天空调醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液100ul染色（15min-1h），双蒸水冲洗柠檬酸铅100ul染色15min（极易吸收空气中CO2产生PbCO3,染色时毋对着说话、呼吸，同时放置数块NaOH）9、日立H-7650透射电镜观察spurr包埋剂配制：ERL 2.5gNSA 5.2 g 混合均匀后再加入催化剂DMAE，搅拌30min；低温干燥保存DER 2.5 gDMAE 0.1g宜新鲜配制但由于使用期限长(3-4天)，混合物可在使用前一天制备。
透射电镜制样流程
透射电镜制样流程
透射电镜制样流程如下：
组织取材（60s内），体积<1mm3，之后进行如下步骤：
1、前固定：3%戊二醛2h或过夜。
2、漂洗：磷酸缓冲液，3次，10min/次。
3、后固定：1%锇酸固定液，2h。
4、漂洗：（同上）。
5、梯度脱水：50%丙酮，70%丙酮，80%丙酮，90%丙酮两次，各
10min。
100%丙酮两次，各15min。
6、渗透：丙酮/包埋剂（1:1,1:2），室温各1h。
丙酮/包埋剂1:3, 4度过夜。
纯包埋剂，4度过夜。
7、包埋：纯包埋剂（37度,45度,60度各24h）。
取出包埋块，进行超薄切片，片厚70nm。
分别采用醋酸双氧铀对切片进行染色30min，双蒸水漂洗3-5次，之后用柠檬酸铅染色10min，双蒸水漂洗3-5次。
待切片干燥后，透射电镜观察。
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0.2M磷酸缓冲液一系列PH值的配方：
磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2M）
pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml
5.8 8.0 92.0
5.9 10.0 90.0
6.0 12.3 8
7.7
6.1 15.0 85.0
6.2 18.5 81.5
6.3 22.5 7
7.5
6.4 26.5 73.5
6.5 31.5 68.5
6.6 3
7.5 62.5
6.7 43.5 56.5
6.8 49.5 51.0
6.9 55.0 45.0
7.0 61.0 39.0
7.1 67.0 33.0
7.2 72.0 28.0
7.3 77.0 23.0
7.4 81.0 19.0
7.5 84.0 16.0
7.6 87.0 13.0
7 .7 89.5 10.5
7.8 91.5 8.5
7.9 93.0 7.0
8.0 94.7 5.3
Na2HPO4·2H2O分子量＝178.05 0.2M溶液含35.61g/L
Na2HPO4·12H2O分子量＝358.22 0.2M溶液含71.64g/L
NaH2PO4·H2O分子量＝138.01 0.2M溶液含27.6g/L
NaH2PO4·2H2O分子量＝156.03 0.2M溶液含31.21g/L
电镜实验用２．５％戊二醛固定液及其制备方法
申请号/专利号：201010185630
本发明公开了一种电镜实验用２．５％戊二醛固定液及其制备方法，包括以下步骤：１、磷酸盐缓冲液配制：Ａ液：磷酸氢二钠＊１２个结晶水７１．６４克加蒸镏水至１０００ｍｌ；Ｂ液：磷酸二氢钠＊２个结晶水３１．２１克加蒸镏水至１０００ｍｌ；将Ａ液３６ｍｌ＋Ｂ液１４ｍｌ配置成０．２ｍｏｌｐＨ７．２的磷酸盐缓冲液；２、固定剂戊二醛配制：将步骤１配置好的０．２ｍｏｌｐＨ７．２磷酸盐缓冲液５０ｍｌ，加入５０％戊二醛５ｍｌ，然后加蒸镏水至１００ｍｌ，加入活性炭２ｇ
1、0.2M磷酸缓冲液的配制
磷酸二氢钠(NaH2PO4.H2O) 2.6g
磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 29g
重蒸馏水加至500ml
调pH至7.4
2、戊二醛固定液
0．1M磷酸缓冲液配制的戊二醛固定液如下
（A）（B）（C）
25%戊二醛（ml）0.4 1 1.6
重蒸馏水（ml）4.6 4 3.4
0．2M缓冲液（ml）5 5 5
戊二醛最终浓度(%) 1 2.5 4
配制后的固定液pH应为7.3-7.4。
3、回答提出的三个问题：
A 若我只有50%戊二醛溶液, 是不是只需将其5ml与50ml P
B 定容到100ml, 我不明白缓冲液的作用?量为什么不变!
答：50%戊二醛？我好像只看到过25%的戊二醛，当然，非电镜用的可能有50%的戊二醛，记住，电镜用的戊二醛包装上面应该有电镜专用几个字。
其次，0.2M缓冲液的量当然不变，都是最后量的一半，这样固定液的浓度就是0.1M，能够维持固定液的pH值和渗透压。
将固定液的pH值和渗透压维持在生理状态，可防止由于固定液和组织液的渗透压或pH值不同而引起的细胞收缩和肿胀等人为损伤。
B 为什么要4度保存? 固定时也要4度吗? 50%戊二醛要不要4度保存?
答：4度保存的目的有二：方便固定的时候温度为4度，可以减少组织的自溶；其次，可以防止固定液里面的成分挥发，包括水，从而导致pH值和渗透压的变化。
至于原装的戊二醛，应为封口严密，所以没必要4度保存，但好像需要避光。