Carnoy固定液使用说明
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
组织固定液的使用
谈谈固定液的使用作者: liza3(站内联系TA)发布：2013—01-11当前，应用于固定试剂的种类较多,它们对于固定不同的组织成分起着不同的作用，因此我们在使用时应该了解不同固定剂的效能,才能合理的固定组织。
根据Bencroft的分类法，将不同的固定剂分为四种类型:Ⅰ类:醛类，甲醛，戊二醛,多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等.Ⅱ类:氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾,重铬酸钾等。
Ⅲ类：蛋白变性类,甲醇，乙醇，醋酸等.Ⅳ类：其他,氯化汞，苦味酸等.上述四种类型的固定剂，最常使用的是甲醛，其余的也在其它病理技术方面中用到。
下面根据使用的需要，将着重介绍几种常用的固定剂。
(1）甲醛甲醛商品名为福尔马林，一般市售的含甲醛37-40%，由甲醛气体饱和于水而成,比重为1。
12。
它也可以稳定的固体形式存在,它的成分为高分子量的聚合体，称为多聚甲醛。
甲醛溶液较难纯化，在每批市售商品中，都含有不少的杂质如甲醇,这种在组织化学方法当中，能使酶钝化,影响其反应。
甲酸,它可使固定液变酸，在陈列标本或长时间固定的组织，由于酸的作用，往往细胞核染色欠佳。
甲醛有效固定作用的要点是，在蛋白质末端基团之间形成交联链。
参与甲醛固定蛋白质的基团，主要为氨基，亚氨基及酰氨基，肽，胍基，羟基，SH和芳香环.甲醛与组织蛋白类的反应是多样和复杂的，因为它能和多种不同的功能基团结合，在多数情况下在其间形成桥键。
甲醛有这种交联的功能,也是它的缺点，在用甲醛固定过的组织中,需要做免疫组化的，往往提倡用酶消化或热抗原修复法来使蛋白与甲醛交联的醛键断裂开，以利于后来的染色.甲醛可配成简单的或混合的固定液，最简单和最容易掌握的方法,就是取10ml甲醛液，加水90ml，这就是10％的福尔马林。
当然,现在使用的固定液要求较为严格些,最好是使用缓冲福尔马林固定液,这将有利于后来的免疫组化染色的需要.从组织学的观点来说,甲醛是一种良好的固定剂,它有很多的优点:1. 组织收缩较少,损伤少，保存固有物质好。
常用固定液的配制
常用固定液的配制1. 福尔马林-醋酸-酒精固定液(FAA)50%或70%酒精90ml + 冰醋酸5ml + 福尔马林(37%~40%甲醛)5ml可用作固定植物的一般组织,但不适用于单细胞及丝状藻类,也不适宜作细胞学研究。
幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，可防止材料收缩。
若材料坚硬，可略减冰醋酸，略增福尔马林。
若材料易收缩，可稍增加冰醋酸。
久置时另加入5ml甘油以防蒸发和材料变硬。
此液又可作保存液。
固定时间最多10h。
如果用在植物胚胎的材料上，改用下面的配方，效果较好：50%酒精89ml + 冰醋酸6ml + 福尔马林5ml2. 福尔马林-丙酸-酒精固定液（FPA）福尔马林5ml + 丙酸5ml + 70%酒精90ml固定一般的植物组织，通常固定8~24h，可长久保存。
3. 酒精-醋酸-氯仿固定液（卡诺固定液，Carnoy fixative）配方Ⅰ：纯酒精3份+ 乙酸1份配方Ⅱ：纯酒精6份+乙酸1份+ 氯仿3份配方Ⅲ：甲醇6份+乙酸1份+ 氯仿3份适用于植物组织和细胞学材料，为研究细胞分裂和染色体的优良固定液。
固定时间不宜过久。
4. 酒精-福尔马林固定液福尔马林2~6（6~10）ml + 70%酒精100ml固定植物一般组织，尤其适用于萌发的花粉管的固定。
通常固定24h，亦可长久保存。
5. 酒精-福尔马林-甘油固定液95%酒精150ml + 5%福尔马林100ml + 甘油50ml此液也可长期储存材料。
6. 铬酸-醋酸固定液根据固定对象的不同，可分为强、中、弱3种配方：（1）弱液配方：10%铬酸2.5ml + 10%醋酸5ml + 蒸馏水92.5ml（2）中液配方：10%铬酸7ml + 10%醋酸10ml + 蒸馏水83ml（3）强液配方：10%铬酸10ml + 10%醋酸30ml + 蒸馏水60ml弱液配方用在固定较柔软的材料，如藻类、苔藓和蕨类的原叶体等。
固定时间较短，一般为。
1h，但藻类和蕨类的原叶体可缩短到几分钟至12~24h数小时，最长可固定中液配方用于固定根尖、茎尖、未成熟子房和胚珠等。
组织固定液
组织固定液组织固定液北京华越洋生物------------------------------------------------------AAF固定液500ml 固定液40% 室温,避光,12个月组织化学中细胞或组织切片的固定。
主要由乙醇、冰乙酸、甲醛等组成。
常用于快速脱水和固定以及冷冻切片的快速固定。
AAF固定液5L 固定液40% 室温,避光,12个月组织化学中细胞或组织切片的固定。
主要由乙醇、冰乙酸、甲醛等组成。
常用于快速脱水和固定以及冷冻切片的快速固定。
Davidson's fixative 100ml 固定液40% 室温,避光,12个月Davidson's fixative 500ml 固定液40% 室温,避光,12个月Bouin's固定液100ml 固定液40% 室温,避光,6个月活检标本的固定、媒染剂、适用于脂肪较多的组织标本。
主要由PA溶液、甲醛、乙酸组成。
Bouin's固定液500ml 固定液40% 室温,避光,6个月活检标本的固定、媒染剂、适用于脂肪较多的组织标本。
主要由PA溶液、甲醛、乙酸组成。
改良乙醇Bouin固定液100ml 固定液40% 室温,避光,12个月固定肾活检组织,组织学制备固定液,亦可以很好的保存糖原主要由乙醇、甲醛、乙酸乙酯等组成。
改良乙醇Bouin固定液500ml 固定液40% 室温,避光,12个月固定肾活检组织,组织学制备固定液,亦可以很好的保存糖原主要由乙醇、甲醛、乙酸乙酯等组成。
Carnoy固定液100ml 固定液40% 室温,避光,12个月又称卡诺氏固定液,RNA\DNA染色的固定,糖原的固定,能清除血性标本,可以用于细胞学固定Carnoy固定液500ml 固定液40% 室温,避光,12个月又称卡诺氏固定液,RNA\DNA染色的固定,糖原的固定,能清除血性标本,可以用于细胞学固定Carnoy固定液Ⅱ100ml 固定液40% 室温,避光,12个月又称卡诺氏固定液,RNA\DNA染色的固定,糖原的固定,能清除血性标本,可以用于细胞学固定Carnoy固定液Ⅱ500ml 固定液40% 室温,避光,12个月又称卡诺氏固定液,RNA\DNA染色的固定,糖原的固定,能清除血性标本,可以用于细胞学固定BS固定液500ml 固定液40% 室温,6个月细胞核染色固定,尤其适用于DNA染色。
卡诺氏固定液
北京雷根生物技术有限公司
卡诺氏固定液
简介：
Carnoy 固定液(Carnoy's Fluid)又称卡诺氏固定液，主要由乙醇、乙酸等混合而成。
适用于一般动植物组织和细胞的固定，常用于动植物压片及石蜡切片等，有极快的渗透力，固定最多不超24h 。
其特点是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
推荐用于RNA 和DNA 染色的组织固定，亦可用于糖原染色的组织固定，能够使糖原呈细微颗粒状。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 一般小块组织固定30～40min 。
2、 稍大块组织2～4h 。
3、 如果组织块大，可适当延长固定时间，但不宜超过24h 。
注意事项：
1、 Carnoy 固定液对人体有一定的损害，请小心操作。
不宜用于固定脂类染色的组织。
2、 组织取材的厚度不同，固定时间也不同。
3、 温度对固定的影响很明显，提高温度可以加速固定作用，但温度不宜过高。
4、 取出新鲜组织后，应及时固定，无法及时固定时，应保存于生理盐水中及时送检。
5、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
编号 名称 DF0019 DF0019 Storage Carnoy Fluid 100ml 500ml RT 避光
使用说明书 1份。
卡诺氏固定液
固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称的卡诺氏固定液是效果良好的固定液。
Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15分钟至24小时，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
水稻根尖染色体标本制备作者: biozxp 发布日期: 2006-4-04 查看数: 22 出自: 1.取材：选取水稻种子，充分浸种后，将它们摆在铺有滤纸的培养皿内，在约28℃条件下发芽培养，当胚根长至1～1.5cm时，剪下备用。
2.预处理压片法：采用0.1％秋水仙素处理2h左右去壁低渗法可采用以下四种方法处理处理方法0.002mol/L8-羟基喹啉α－溴萘饱和溶液低温（－4℃）卡诺氏Ⅰ固定液处理时间（h）1 24 24 24注：卡诺氏Ⅰ固定液乙醇：冰醋酸（3：1）3.固定卡诺氏Ⅰ固定液，固定时间以不超过24h为宜。
经过固定的材料如不及时使用，可经90％酒精换到70％酒精各半小时，再换入一次70％酒精，在0～4℃冰箱内备用。
去壁低渗法a.将3固定的材料用DDW洗净后，0.075mol/LKCL溶液室温条件下处理约30min。
b.酶解去壁吸取低渗液，加入1％混合酶液（1％果胶酶与1％纤维素酶的混合液，均为Sigma公司），28℃左右，酶解4.5～5h.酶解过程中，将材料瓶轻轻摇动1～3次，使材料与酶液充分接触。
c.后低渗吸取酶液,用DDW冲洗材料2～3次，然后在DDW中停留30min。
d.重固定吸取低渗液后,加入新配制的卡诺氏Ⅰ固定液，固定时间约20min。
e.标本制备吸取固定液后，将根尖捣碎,再滴入新鲜固定液3～5滴，制成细胞悬液，充分搅匀。
7. 细胞生物学实验七 DNA的Feulgen染色法
三、试剂
1. 1. Carnoy固定液 ：3份95%酒精加入1份冰醋酸。 2. 1mol/LHCL ：准确量取86.2ml浓盐酸（比重1.18）加入到 93.8ml蒸馏水中。 3. Schiff试剂：称1g碱性品红于200ml煮沸的重蒸馏水中，5 分钟后断电使其冷却至55～50℃，过滤到一个棕色的试剂 瓶中，加入1mol/L HCl 20ml，继续冷却至25℃，加入1g 偏亚硫酸氢钠，摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口，置黑暗低 温处或冰箱内（4℃左右），18～24小时后检查，试剂如透 明无色或呈浅黄色时即可使用，这就是Schiff试剂溶液。如 有不同程度的红色未褪，可加入1g活性炭，强烈震荡一分 钟，仍在低温下静置过夜，然后用滤纸过滤后使用。密封 瓶口，包以黑纸，在5℃以下冰箱内可以保存半年。
（四）0.5%的固绿染色1 min（要快），取出用蒸 馏水（或自来水）流水冲洗干净。
（五） 压片法 取一根尖置于载玻片上，用切下生 长区部位（染成紫红色），加盖玻片，用拇指或 铅笔的橡皮头轻压使细胞分散均匀，镜检。 （六）对照组预先用5%三氯醋酸（90℃）处理 15min，用70%酒精浸泡2~3min，蒸馏水浸泡一 下。然后再依次进行实验步骤（二） （三） （四） （五） 。
（3）后期：姊妹染色体分别向细胞两极移动，染色体达到 两极时染色体紧缩成团，染色体的轮廓逐渐变得不清楚， 细胞质中间部位（细胞的赤道板）形成细胞板。 （4）末期：盘绕变粗的染色体又伸展开，此时，核仁、核 膜又重新出现。 此外，间期细胞的细胞核有下述特点：核膜清楚，核内 结构均匀，除异染色质外，可见1－2个着色较深的核仁。 而在进入细胞分裂期的细胞核，一般均大于间期细胞核。
4. Schiff试剂的作用 Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是 schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们 实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明 “DNA染色反应用” 的碱性品红才行。此外，Schiff试剂 的配制方法也可影响DNA的染色反应。 配好的Schiff试剂 须在5℃以下冰箱内避光保存。
常用固定液的性质、用途
常用固定液的性质、用途和配置1．单一固定液的性质和用途（1）乙醇（C2H5OH）（ethylalcohol）：又名酒精，可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白，后者易溶于水，所以经酒精固定的标本对细胞核染色不良。
酒精可溶解脂肪、类脂体，所以不能用酒精固定脂肪。
酒精可沉淀肝糖，但仍可溶解于水，因此肝糖经酒精固定后不能在低于70％酒精中保存。
单独固定使用酒精的浓度应为95—100％。
无水酒精渗透力较差，并且能使组织收缩，在与醋酸、氯仿混合使用时，可增强它们的穿透力。
酒精除固定作用外，还具有硬化和脱水的作用，固定后的组织可保存于70％酒精中，所以酒精在制片过程中用途很大。
无水乙醇容易挥发，又容易吸收空气中的水分，所以瓶盖必须塞紧，为了吸去其中水分，最好在无水乙醇瓶内放入少量无水硫酸铜粉末。
酒精是一种还原剂，不能与重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合使用。
（2）甲醛（HCHO）（formeldehyde）：是一种气体，溶于水成为甲醛水溶液或称福尔马林，一般使用浓度为10％福尔马林（formalin）液，其配法是取市售的甲醛液10ml 与90ml 蒸馏水混合即可，实际上其含量只有4％甲醛。
这样的配法已成为一般实验室常用的惯例。
甲醛不能沉淀白蛋白及核蛋白，但能与蛋白质化合。
它是一种应用广泛，使用简单的固定液，具有穿透力强、固定均匀、组织收缩小、硬度适当，适用于一般器官组织的固定及保存。
尤其对脂肪、神经组织固定效果较好。
更适于病理组织的制片及大体积标本的保存，一般组织需固定24 小时以上，固定后的组织可移入50％酒精中逐步脱水。
甲醛是一种强还原剂，不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合，因极易被氧化为甲酸。
在配混合固定液时，如海利氏液等需临用前再加入，24 小时后失效。
甲醛由于长期贮存，特别是低温气候，容易产生多聚甲醛，即溶液中的白色沉淀，在高温下又成为甲醛。
不纯的甲醛易产生甲酸，使溶液变为酸性，影响核的染色。
所以在备用的福尔马林中加入小量的醋酸钙、碳酸镁或大理石作为中和剂。
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Carnoy固定液
Carnoy Fixative Solution
编号名称规格单位
北京华越洋WG04553Carnoy固定液100ml，500ml瓶
Carnoy固定液用途：
Carnoy氏液是由乙醇，氯仿和乙酸按6:3:1的比例混合而来的混合型固定液。
该液渗透快速，固定只需1-2小时。
固定后可以直接用95%乙醇脱水，固定核酸和糖原的效果最好，常用于组织化学。
保存条件：RT，避光保存，有效期一年。
Carnoy固定液固定时的注意事项：
(1)固定液量：20倍于材料的体积，以免固定液被稀释。
(2)选择合适的固定液：渗透力强的固定液既可以迅速进入组织中，又不使组织过度收缩或膨胀。
(3)固定的时间要合适：
与材料的大小和温度有关：材料大则时间长，材料小则时间短；温度高则时间短，温度低则时间长。
经固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，再换入一次70%酒精，在0-4℃冰箱内可保存半年。
经过较长时间保存的材料进行观察前可以换新的固定液再处理一次，效果较好。
Carnoy固定液固定的条件：
(1)迅速渗入组织，杀死原生质。
在杀死的短时期中，细胞形态不致有所变化。
(2)必须具有渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。
(3)尽可能避免使组织膨胀或收缩。
(4)使细胞内的成分凝固或沉淀。
(5)增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。
(6)增加媒染作用和染色能力。
(7)使组织变硬，具有一定的硬度。
(8)固定以后能起到保存的作用。
(9)在凝固原生质以后，增加细胞对于各种穿透的抵抗力，不致于因以后的处理而使固定的原生质变形。
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