常用的组织固定液及配制
常用固定液配制
1. 福尔马林-醋酸-酒精固定液(FAA)50%或70%酒精90ml + 冰醋酸5ml + 福尔马林(37%~40%甲醛)5ml可用作固定植物的一般组织,但不适用于单细胞及丝状藻类,也不适宜作细胞学研究。
幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，可防止材料收缩。
若材料坚硬，可略减冰醋酸，略增福尔马林。
若材料易收缩，可稍增加冰醋酸。
久置时另加入5ml甘油以防蒸发和材料变硬。
此液又可作保存液。
固定时间最多10h。
如果用在植物胚胎的材料上，改用下面的配方，效果较好：50%酒精89ml + 冰醋酸6ml + 福尔马林5ml2. 福尔马林-丙酸-酒精固定液（FPA）福尔马林5ml + 丙酸5ml + 50%酒精90ml固定一般的植物组织，通常固定24h，可长久保存。
3. 酒精-醋酸-氯仿固定液（卡诺固定液，Carnoy fixative）配方Ⅰ：纯酒精3份+ 冰醋酸1份配方Ⅱ：纯酒精6份+ 冰醋酸1份+ 氯仿3份适用于植物组织和细胞学材料，为研究细胞分裂和染色体的优良固定液。
固定时间不宜过久。
4. 酒精-福尔马林固定液福尔马林2~6（6~10）ml + 70%酒精100ml固定植物一般组织，尤其适用于萌发的花粉管的固定。
通常固定24h，亦可长久保存。
5. 酒精-福尔马林-甘油固定液95%酒精150ml + 5%福尔马林100ml + 甘油50ml此液也可长期储存材料。
6. 铬酸-醋酸固定液根据固定对象的不同，可分为强、中、弱3种配方：（1）弱液配方：10%铬酸2.5ml + 10%醋酸5ml + 蒸馏水92.5ml（2）中液配方：10%铬酸7ml + 10%醋酸10ml + 蒸馏水83ml（3）强液配方：10%铬酸10ml + 10%醋酸30ml + 蒸馏水60ml弱液配方用在固定较柔软的材料，如藻类、苔藓和蕨类的原叶体等。
固定时间较短，一般为数小时，最长可固定12~24h，但藻类和蕨类的原叶体可缩短到几分钟至1h。
常用固定液的配制
常用固定液的配制常用固定液的配制1. 福尔马林-醋酸-酒精固定液(FAA)50%或70%酒精90ml + 冰醋酸5ml + 福尔马林(37%~40%甲醛)5ml可用作固定植物的一般组织,但不适用于单细胞及丝状藻类,也不适宜作细胞学研究。
幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，可防止材料收缩。
若材料坚硬，可略减冰醋酸，略增福尔马林。
若材料易收缩，可稍增加冰醋酸。
久置时另加入5ml甘油以防蒸发和材料变硬。
此液又可作保存液。
固定时间最多10h。
如果用在植物胚胎的材料上，改用下面的配方，效果较好：50%酒精89ml + 冰醋酸6ml + 福尔马林5ml2. 福尔马林-丙酸-酒精固定液（FPA）福尔马林5ml + 丙酸5ml + 70%酒精90ml固定一般的植物组织，通常固定8~24h，可长久保存。
3. 酒精-醋酸-氯仿固定液（卡诺固定液，Carnoy fixative）配方Ⅰ：纯酒精3份+ 乙酸1份配方Ⅱ：纯酒精6份+乙酸1份+ 氯仿3份配方Ⅲ：甲醇6份+乙酸1份+ 氯仿3份适用于植物组织和细胞学材料，为研究细胞分裂和染色体的优良固定液。
固定时间不宜过久。
4. 酒精-福尔马林固定液福尔马林2~6（6~10）ml + 70%酒精100ml固定植物一般组织，尤其适用于萌发的花粉管的固定。
通常固定24h，亦可长久保存。
5. 酒精-福尔马林-甘油固定液95%酒精150ml + 5%福尔马林100ml + 甘油50ml此液也可长期储存材料。
6. 铬酸-醋酸固定液根据固定对象的不同，可分为强、中、弱3种配方：（1）弱液配方：10%铬酸2.5ml + 10%醋酸5ml + 蒸馏水92.5ml（2）中液配方：10%铬酸7ml + 10%醋酸10ml + 蒸馏水83ml（3）强液配方：10%铬酸10ml + 10%醋酸30ml + 蒸馏水60ml弱液配方用在固定较柔软的材料，如藻类、苔藓和蕨类的原叶体等。
固定时间较短，一般为数小时，最长可固定12~24h，但藻类和蕨类的原叶体可缩短到几分钟至1h。
病理组织常用固定液的配制
病理组织常用固定液的配制（免疫组化）一、常规固定液的配制（1）10%甲醛液浓甲醛 10ml蒸馏水 90ml(2 ) 缓冲中性甲醛液浓甲醛10mlPBS缓冲液（Ph7.2）90ml(3 ) 10%中性甲醛液浓甲醛10ml蒸馏水90ml碳酸钙加至饱和(4 ) Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液75 ml甲醛2 ml冰醋酸5 ml该固定液中的冰醋酸，对胶原纤维等组织有膨胀作用，而甲醛对组织有收缩作用，两种试剂的混合使用，用以抵消彼此间的副作用，使组织固定达到优良的固定水平。
（5）醛糖钙固定液甲醛100ml蔗糖300ml乙酸钙20g蒸镏水90ml先将蔗糖和乙酸钙溶于蒸镏水，后加入甲醛。
该固定液对于做酶的组织化学的研究效果较好，组织固定后，做冰冻切片，再给予显示。
当前国内外基本上都还是要用甲醛来固定组织。
从免疫组织化学的角度来说，甲醛固定的组织大部分都可以用免疫组化的手段来检测，据多人认为，它对lgA ，lgM，J链，K 链和λ链的标记效果较好，且背景清晰。
但美中不足的是：经它固定的组织，可与蛋白形成醛交联蛋白，这种醛键可封闭抗原。
固此，在免疫组化实际检测中，应根据不同的要求和需要，采用酶消化或者其它抗原修复如微波、高压等的方法，以便破坏醛键重新暴露抗原。
（6）Zenker氏固定液：重铬酸钾25g升汞50g蒸馏水1000ml冰醋酸50ml先将重铬酸钾和升汞溶于水中，尢其是重铬酸钾，应用热水或加温的方法将其溶解，然后过滤贮存于带盖的玻璃瓶中，如暴露于空气中，该溶液将会被慢慢氧化而便颜色加深，导致失效。
临用时，取贮存液950ml，加入50ml的冰醋酸，即可使用。
应用该固定液固定的组织，一般不要超过24h，取出组织，流水冲冼12小时以上，然后保存于75%-80%的酒精中，在切片染色前，必须用碘除去汞盐的沉着。
应用该固定液的组织，细胞核及细胞浆染色十分清晰，特别是要显示骨骼肌的横纹时，应用本液可获得满意的结果，但由于其含有醋酸，故不能用于保存细胞颗粒，红细胞及含铁血黄素。
固定液
1．经过固定的组织可保持在10%福尔马林或70%乙醇中。
2．染色前脱掉组织中的苦味酸①自来水冲洗②50%乙醇③或70%乙醇饱和碳酸锂
乙醇BOUIN’S液（DUBOSCQ-BRAZIL FLUID）
用途：用于固定肾活检，组织学制备固定液。
试剂：
乙醇Bouin’s贮存液:
80%乙醇750.0ml
甲醛300.0ml
步骤：
1．活检标本要立即放入Hollande’s固定剂中，标本容器上注明时间。
2．标本完成固定后保持在70%乙醇中。
3．不能让Hollande’s液固定的标本与磷酸缓冲福尔马林接触，否则会出现蓝色沉淀。
ORTH’S液
用途：用于证实肾上腺胞浆中嗜络微粒，这种证明可能对嗜络细胞瘤的诊断很重要。不是一种好的多用途的固定剂。
苦味酸5.0g
充分混合，液体稳定性2年，标明配制日期。
工作液：
贮存液70.0ml14.0ml
醋酸5.0ml10.0ml
使用前加醋酸。
固定时间：1～4小时。
步骤：
1．把新鲜组织标本放进乙醇Bouin’s工作液中。
2．充分固定后把组织移到70%的乙醇中。
HOLLANDE’S固定液
用途：作为胃肠和前列腺活检基本固定剂，这种固定剂让H.E染色更清晰，它“软化”组织避免切片脆裂。苦味酸会溶解掉红细胞。
ZENKER’S液
用途：Zenker’s液是一种核固定剂。该液是细胞学及病理学常用的固定剂，对细胞核固定最好，最适合于造血和网状内皮组织的固定。也常作为三色染色的组织固定剂，在三色染色中还作为媒染剂使用。但对于含血量较多的组织标本尽量不要选Zenker’s液固定。
试剂：
Zenker’s贮备液：
组织固定包埋
石蜡切片组织固定与包埋
1. 配制或准备组织固定液。
固定组织时，必须有足够的固定液，一般为组织块体积的10～15倍。
固定用的容器必须足够大，组织材料不要太多，避免组织中的水分渗出而影响固定液的浓度。
我们一般在10ml 试管中盛放8ml 固定液。
10% Neutral Buffered Formalin (最常用的)
固定液种类
Bouins fixative （picric acid ：formalin ：Acetic Acid =15：5：1）
2. 剪取小鼠组织或器官，务必要保证其完整性，然后放入对应固定液中固定24h （4操作要迅速，防止组织收缩变形，并发生自溶现象）。
3. 蒸馏水冲洗3次。
4. 脱水
可4℃过夜或更长
) 80%EtOH 90%EtOH 5.
透明
Xylene ：
6.
浸蜡
Xylene ：
7. 包埋
8. 石蜡切片。
常用固定液的性质、用途
常用固定液的性质、用途和配置1．单一固定液的性质和用途（1）乙醇（C2H5OH）（ethylalcohol）：又名酒精，可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白，后者易溶于水，所以经酒精固定的标本对细胞核染色不良。
酒精可溶解脂肪、类脂体，所以不能用酒精固定脂肪。
酒精可沉淀肝糖，但仍可溶解于水，因此肝糖经酒精固定后不能在低于70％酒精中保存。
单独固定使用酒精的浓度应为95—100％。
无水酒精渗透力较差，并且能使组织收缩，在与醋酸、氯仿混合使用时，可增强它们的穿透力。
酒精除固定作用外，还具有硬化和脱水的作用，固定后的组织可保存于70％酒精中，所以酒精在制片过程中用途很大。
无水乙醇容易挥发，又容易吸收空气中的水分，所以瓶盖必须塞紧，为了吸去其中水分，最好在无水乙醇瓶内放入少量无水硫酸铜粉末。
酒精是一种还原剂，不能与重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合使用。
（2）甲醛（HCHO）（formeldehyde）：是一种气体，溶于水成为甲醛水溶液或称福尔马林，一般使用浓度为10％福尔马林（formalin）液，其配法是取市售的甲醛液10ml 与90ml 蒸馏水混合即可，实际上其含量只有4％甲醛。
这样的配法已成为一般实验室常用的惯例。
甲醛不能沉淀白蛋白及核蛋白，但能与蛋白质化合。
它是一种应用广泛，使用简单的固定液，具有穿透力强、固定均匀、组织收缩小、硬度适当，适用于一般器官组织的固定及保存。
尤其对脂肪、神经组织固定效果较好。
更适于病理组织的制片及大体积标本的保存，一般组织需固定24 小时以上，固定后的组织可移入50％酒精中逐步脱水。
甲醛是一种强还原剂，不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合，因极易被氧化为甲酸。
在配混合固定液时，如海利氏液等需临用前再加入，24 小时后失效。
甲醛由于长期贮存，特别是低温气候，容易产生多聚甲醛，即溶液中的白色沉淀，在高温下又成为甲醛。
不纯的甲醛易产生甲酸，使溶液变为酸性，影响核的染色。
所以在备用的福尔马林中加入小量的醋酸钙、碳酸镁或大理石作为中和剂。
显微鉴定显微化学反应常用试液的配制方法
附录一显微鉴定及显微化学反应常用试液的配制方法1．水合氯醛试液：取水合氯醛50 g，加蒸馏水l 5m1与甘油10m1使溶解，即得。
此为常用的透化剂，能使细胞组织透明清晰，能溶解淀粉粒，蛋白质。
挥发油、树脂、叶绿素等，但不溶解草酸钙或碳酸钙晶体等．它亦有使皱缩的细胞膨胀而恢复原状的作用。
2．稀甘油试液：取甘油33ml，加蒸馏水10ml，再加樟脑少许或液化苯酚1滴，即得。
本品为临时切片的常用封藏液之一。
经水合氯醛透化的显微标本滴加稀甘油封藏，可防止水合氯醛结晶析出而避免干扰观察。
3．甘油醋酸试液(斯氏溶液)：取甘油、50％醋酸、蒸馏水各等分，混合，即得。
此为常用的一种封藏剂，能在较长时间内保持淀粉粒的形状、大小，防止淀粉粒崩解，以便于显微观察和测量大小．4．间苯三酚试液：取间苯三酚1g，加95％乙解100ml使溶解，即得。
置棕色瓶内，在暗处保存。
样品加本试液2—3分钟后，再加浓盐酸或浓硫酸1滴，木质化细胞壁显红色，红色的深度与木质化的程度有关。
5.苏丹Ⅲ试液：取苏丹Ⅲ0.01g加90％乙醇5m1，溶解后，加甘油5m1，摇匀，即得。
应置棕色瓶中保存，在2个月内应用。
此液能使木栓化或角质化的细胞壁及脂肪油树脂等染成红色或桔红色。
6．氯化锌碘试液：取碘化钾8g，加水8.5ml使溶解，再加无水氯化锌2.5g溶解后，加适量碘使达饱和状态，即得。
本试液置棕色玻璃瓶内保存。
用于鉴别纤维素细胞壁和木化细胞壁，前者显蓝色或蓝紫色，后者呈黄色或棕色。
7．铜氨试液：取硫酸铜0.5g，加蒸馏水适量，置乳钵中研磨，再加浓氨水10ml 使溶解，即得。
本试液在使用时配制，贮存时间一般不得超过2个月。
能使纤维素细胞壁染成浅蓝色，并逐渐膨胀而溶解：半纤维素细胞壁与纤维素细胞壁反应同，但前者遇水强烈膨胀。
8．稀碘液：取碘化钾0.5g溶少量蒸馏水中，加碘lg，溶解后加水至100ml，即得，使用时，通常还要稀释至谈棕色或淡棕黄色。
置棕色玻璃瓶内保存。
缓冲液及组织固定液的配制
缓冲液及组织固定液的配制1、磷酸盐缓冲液的配制关于缓冲溶液PB的配制，好多参考书如生物技术实验的后面均附有缓冲溶液的配制配方，可以根据需要配制pH5.7～8.0的磷酸盐缓冲。
磷酸盐缓冲液称简PB，加NaCl（氯化钠）的称PBS，加KCl（氯化钾）、NaCl（氯化钠）的称KPBS。
S就是指氯化钠的含量，一般为0.85％，即是100ml里面加0.85克，这个时候的PBS的浓度是0.1M的。
一般在免疫组化洗涤中采用0.01M的PBS，pH7.0～7.4。
我们在实验中直接将0.1M的稀释十倍，即可。
最好能现配现用。
母液4℃可以保持1～2周，影响不大。
成份分子量（MW）浓度（g/1000mL）0.01M PBS①0.1M PBS0.1M PBNa2HPO4·12H2O 358.14 2.684 29.009 29.009NaH2PO4·2H2O 156.01 0.39 2.964 2.964NaCl 58.44 8.5 8.5~9 /pH值/ 7.4 7.4 7.4注：①配方来自网上。
2、组织固定液的配制2.1、4%多聚甲醛-0.1M磷酸缓冲液[1]（pH=7.3）：多聚甲醛40g，置于三角烧瓶中，加入500~800mL 0.1M的磷酸缓冲液（PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）至粉末完全溶解，通常需要滴加少许1N NaOH才能使溶液澄清，最后补足0.1M PB至1000mL，充分混匀。
该固定试剂适用于光镜免疫细胞化学研究，因较温和，适用于组织标本的较长期保存。
2.2、10%中性缓冲福尔马林固定液[2]：甲醛溶液（37~40%）100mL，蒸馏水900mL，NaH2PO4（磷酸二氢钠）4g，Na2HPO4（磷酸氢二钠）6.5g，混合摇匀后调pH至7.2~7.4。
2.3、10%福尔马林固定液配制[2]：甲醛溶液（37~40%）100mL，自来水900mL，混合后在溶液中加入碳酸钙使溶液呈中性或偏碱性。
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常用固定液及其配制
固定液分单纯固定液和混合固定液。
1甲醛（formaldehyde）
是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。
易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37％～40％得甲醛溶液，商品名为福尔马林（formalin）。
用作固定的浓度习惯为10％福尔马林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），实际含甲醛4％。
10％福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。
对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。
经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。
2 乙醇
无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。
固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。
3 中性甲醛液（混合固定液）
甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4?H2O）4g，磷酸氢二纳（Na2HPO4）13g。
此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。
4 AF液（混合固定液）
95％乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。
也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5ml。
此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脱水。
以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10％福尔马林，乙醇应尽量不用。
yzbai wrote:
（1）10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。
对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收缩。
能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。
经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。
（2）4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。
固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。
几种细胞固定方法
选择最佳固定液标准是：
（1）最好地保持细胞和组织的形态结构；
（2）最大限度地保存抗原的免疫活性。
一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用的；
（3）不要用可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，还有甲醛升汞固定液，会使上皮细胞产生非特异性荧光；
（4）固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果。
单纯固定液
（1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作（Job）。
中性甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%甲醛固定液。
此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。
甲醛（40%）100ml
无水磷酸氢二钠6.5g
磷酸二氢钠4.0g
蒸馏水900ml
（2）乙醇固定液：使用时以80%-95%的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，假如用于证实尿酸结晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定组织。
（3）4%多聚甲醛固定液：主要用于培养细胞的固定。
混合固定液
（1）乙醇-甲醛（乙醇-福尔马林，AF）固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定。
该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95%乙醇脱水。
甲醛（40%）100ml
95%乙醇900ml
（2）B5（醋酸钠-升汞-甲醛）固定液：多用于固定淋巴组织。
染色前应进行脱汞沉淀处理。
无水醋酸钠1.25g
升汞6.0g
蒸馏水90ml
使用前加入甲醛10ml
（3）Bouin固定液：非凡适用于睾丸活检组织的固定。
Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆。
需现配现用。
饱和苦味酸水溶液（约1.22%）75ml
甲醛25ml
冰醋酸5ml
（4）Carnoy固定液：穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，非凡适用于固定外膜致密的组织，也适用于糖原及尼氏小体的固定。
无水乙醇60ml
氯仿30ml
冰醋酸10ml
（5）Zenker固定液：经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清楚，但成本较高且需非凡处理汞。
该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。
升汞 5.0g
重铬酸钾 2.5g 硫酸钠 1.0g
蒸馏水（加至）100ml。