几种细胞固定方法-细胞固定液选择标准
细胞固定——精选推荐
用多聚甲醛固定悬浮细胞所有的固定方案必须做到：①防止抗原丢失；②透化细胞以便使抗体进入；③尽量使抗原保持能与抗体结合的状态；④维持细胞正常结构。
常用的固定剂种类很多，固定剂的正确选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性。
固定剂可分为两大类：有机溶剂和交联剂。
有机溶剂如乙醇和丙酮能够去除脂类物质使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上。
交联剂一般通过自由氨基基团把生物分子桥连起来，形成一个相互连接的抗原网。
两种方法均使蛋白质抗原部分变性。
因此，在细胞染色中，能够识别变性蛋白的抗体更加有用。
在某些情况下，只有用此类抗体才能得到满意的结果。
往往凭经验选择固定剂。
虽然许多人发现用交联剂固定细胞可以获得较好的结果，但没有通用规则可以参考。
可以试用两种方法，然后选择较好的一种。
悬浮细胞染色通常用于检测细胞表面抗原。
因为细胞呈悬浮状态，洗涤过程复杂，因此，应注意离心时间不要过长或转速太高。
1．所需溶液4％多聚甲醛(临用前配制)、PBS。
2．操作步骤(1)PBS配制4％多聚甲醛；(2)用PBS洗涤细胞2次，用200g离心5min；重悬细胞。
(3)小心用4％多聚甲醛溶液悬浮细胞，细胞浓度约为1X106／m1 15min，间或摇动；(4)200g离心5rain，用PBS重悬细胞，重复洗涤细胞2次；室温下静置(5)用含0．2％TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化细胞2min(室温)，有的抗原需15min，具体时间视抗原而定；(6)200g离心5rain，用PBS重悬细胞，重复洗涤细胞2次。
此时的细胞标本可用于后续的抗体检测。
4%的多聚甲醛溶液的配置方法：100ml双蒸水中加入8g多聚甲醛，然后在水浴锅中加热至50-60℃，加入几滴1mol/L的NaOH，边加边搅拌直至全部溶解，溶解后置于冰水中冷却至室温，加入100ml的2倍的PBS（注意是两倍的PBS），调节PH为7.4左右。
1、为什么在免疫组化中标本要进行固定？（1）防止标本从玻片上脱落；（2）除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；（3）固定的标本易于保存。
一些固定液及方法介绍
一些固定液及方法介绍前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1N NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4•2H2O16.88g蒸馏水300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1N NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
该固定剂较温和，适于组织的长期保存。
组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。
3．Bouin's液及改良Bouin's液试剂：饱和苦味酸40%甲醛250ml冰醋酸50ml配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。
病理制片中固定液的选择-2019年精选文档
病理制片中固定液的选择由于病理学诊断是诊断的金标准，是辅助临床诊断的主要把关口，也是最后的宣判性诊断。
做好病理诊断，层层步骤就显得尤为重要，包括组织的取材，固定，脱水，浸蜡，包埋及染色。
组织的固定是一个关键的过程，因为没有好的固定就没有好的制片，没有好的制片就不会有好的成品，一张好的切片与固定有着密切的关系。
1固定的目的固定的概念是将采取的活体组织置于化学性溶媒（固定液）中，使其不发生自溶与腐败，保持被采取时的形态。
固定的目的是在于尽量使组织和细胞保持与生活时相仿的成分和形态，迅速防止组织、细胞的死后变化，防止自溶与腐败，使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶性物质，使组织中的各种物质沉淀和凝固起来，而产生不同的折射率，成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。
因此，固定的组织愈新鲜愈好，固定组织时，应使用足量的固定液。
其固定液的量一般小于组织块总体积的4 倍以上。
2固定液的选择固定液必需要有较强的渗透能力，能迅速地渗入组织内部，不会使组织过度收缩或膨胀，并且能使组织内易观察的成分可以凝固为不溶性物质，能使组织达到一定的硬度，获得较佳的折光率和对染料具有较强的亲和力。
组织细胞中不至于因固定引起人为的改变，因为在凝固原生质以后，增加了细胞对于各种穿透的抵抗力，不至于因以后的处理而使固定后的原生质变形，并尽可能地避免使组织膨胀或收缩，使细胞内的成分（蛋白质）凝固沉淀下来，由正常的半液体状（胶体）变为半固体状（凝胶），增加媒染作用和染色能力，使组织能够得到充分的固定，便于以后的蜡块保存。
固定液的种类很多，分为单纯固定液和混合固定液，其中混合固定液比较常用。
2.1 常用单纯固定液2.1.1 甲醛（formaldehyde）为非沉淀性固定剂，是一种约有40％重量溶于水的气体，易挥发，市售的为40％的甲醛水溶液，也称为福尔马林液（formalin）。
此液久存自行分解，形成白色沉淀为副醛（三聚甲醛或多聚甲醛）。
实验室做细胞常用的细胞固定及染色方法(详细)
实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。
为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。
在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。
能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。
1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。
2、用自来水冲洗5min。
3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。
4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。
5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min，振荡。
6、入60℃烤箱1 h，或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。
二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。
同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。
1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。
2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。
对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。
3.常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。
主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)。
另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。
组织细胞固定的原理、基本要求
组织细胞固定的原理、基本要求在病理学中，组织只有经过固定，才能完成随后的一系列制作过程，直至切片的最后完成。
每个医学研究者都能容易地把组织细胞固定起来，但是，要掌握组织固定的原理、过程及其意义是一件十分困难的事，下面我们将逐一阐述。
一、固定的作用组织经一系列的处理后，就必须进行固定，当然有的组织是先固定，再进行处理，然后再固定。
固定的作用，从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断。
二、固定的目的1、能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。
细菌无处不存在，它们随时都可污染腐蚀未经处理的组织。
固定液可以固定任何蛋白质，凡有生命的东西，都由蛋白质组成，蛋白质被固定，生命就停止，细菌也就失去了活力。
另者，在日常生活中，人们常可碰到这样的问题，一块肉不经处理放了几天后就会变质，这是为什么呢？除了细菌参与外，其本身也是很重要的。
因为组织离体后，供应这此组织的血液随之消失，细胞缺氧，细胞内溶酶体膜的结构受到破坏，破坏后释放出溶酶体酶，日常生活中常碰到的肉变质，就是细菌污染加组织自溶的结果。
2、保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖原等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。
细胞的固有物质，即细胞核、内质网、线粒体、高尔基器、溶酶体、过氧体，细胞骨架，组织液，抗原、糖元等。
这些物质，如果不将其及时固定，是很容易丧失的，尤其是溶酶体，很容易受到破坏，因此应特别小心。
3、使组织硬化，便于切块。
刚离体的组织，除了胃组织以外，都是柔软的组织，尤其是胃肠道的组织，如果在没有固定时就取材，效果就很差，不是取材不规整，就是厚薄不均，粘膜和肌层很容易分开，因此，要取得规整标致的材料，就必须将组织彻底固定，再行取材。
组织和细胞的固定方法
组织和细胞的固定方法组织和细胞的固定方法固定的目的是用人为的方法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞死后发生自溶和组织腐败。
固定还能增加组织块硬度，使其更简单切片，使不同的结构更简单染色。
固定方法有物理固定和化学固定两类，物理固定可采纳空气干燥（血涂片）、骤冷（在液氮中快速冷冻）或微波固定等；化学固定有浸润法（immersion method）和灌流法（perfusion method）。
灌流法适用于动物试验中对缺氧敏感的器官，如神经系统和胃肠等取材。
一、浸润法浸润法是组织化学和免疫组织化学常用的固定方法，一次要处理很多组织样品时也多用此法。
预先需估量固定剂的用量，并在取材前配好固定液，分装于小容器内，在容器上标记组别和取材时间。
容器内放人记录组织类型的纸条，以便包埋时辨认。
固定液的用量应是样品的40倍，以保证组织充分固定。
固定时间可依据所选固定液和组织类型而定。
若进行酶组织化学染色，应在4℃短时间固定，固定时间长会导致酶活性减弱，甚至消逝。
二、灌流固定法此法是经血管途径，将固定液灌注到欲固定的器官内，使生活的细胞在原位准时快速固定，取下组织之后再浸入相同的固定液内连续固定。
灌流固定时大动物多采纳输液方式，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，从另一侧切开静脉放血，输入固定液与放血同时进行。
固定液的输人量因个体不同而异，即500―2000ml不等。
小动物多采纳心脏主动脉灌流，如大鼠和小鼠，在吸人深度麻醉状况下，打开胸腔，纵向切快乐包膜，并用纱线在动脉弓下打一松结，然后用静脉输液针从左心室向主动脉方向刺人，针尖刺人后，随即将纱线扎紧固定，勿使其移动，再将右心耳剪开放血。
在灌注固定液前，先用含抗凝剂的37℃生理盐水灌流，冲洗血管内的血液，防止血液凝固堵塞血管。
抗凝剂常用肝素，剂量为40mg/L冲洗液。
肝脏颜色由鲜红变为浅白色时，即可灌流固定液，灌注速度为5～10ml/min，应在30分钟内结束灌注并取材，而后将组织浸入相同的固定液中1～3小时。
实验室做细胞常用的细胞固定及染色方法(详细)
实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。
为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。
在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。
能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。
1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。
2、用自来水冲洗5min。
3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。
4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。
5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min，振荡。
6、入60℃烤箱1 h，或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。
二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。
同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。
1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。
2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。
对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。
3.常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。
主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)。
另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。
免疫组化固定剂的选择(看到楼下有兄弟 这个问题)(固定剂,免疫组化,固定液,抗原)
免疫组化固定剂的选择（看到楼下有兄弟这个问题）(固定剂,免疫组化,固定液,抗原)相关疾病：脱水固定是免疫组化的第一步，很多人都忽视了这一步，认为用福尔马林就行，其实学问也挺大的用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。
1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。
有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。
关键词: 固定液固定剂抗原甲醛免疫组化冰醋酸戊二醛固定是免疫组化的第一步，很多人都忽视了这一步，认为用福尔马林就行，其实学问也挺大的用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。
1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。
有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。
（1）10%钙-福尔马林液（浓甲醛10ml，饱和碳酸钙90ml）。
（2）10%中性缓冲福尔马林液（浓甲醋10ml，0.01mol/l pH7.4 PBS 90ml）。
（3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液pH7.4（多聚甲醛40g,0.1mol/L PBS液pH7.4500ml，两者混合加热至60℃，搅拌并滴加1n NaOH至清晰为止，冷却后加PBS液至总量1000ml）。
（4）戊二醛-甲醛液（戊二醛1ml，浓甲醛10ml，蒸馏水加至100ml）。
戊二醛是二醛基化合物，交联结合力比甲醛大，Bullock认为交联过强，可出现组织改变和空间遮蔽现象，影响组织的抗原性。
但McDonald等认为，该试剂用于PAP法免疫酶标记效果仍满意。
（5）甲醛升汞固定液（即B5固定液。
浓甲醛10ml，氯化汞6g,醋酸钠1.25g ,蒸馏水90ml）。
有人认为此固定液悬液是较理想的固定液，标记IgA、IgM、IgG等抗原效果良好。
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几种细胞固定方法
选择最佳固定液标准是：
（1）最好地保持细胞和组织的形态结构；
（2）最大限度地保存抗原的免疫活性。
一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用的；
（3）不要用可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，还有甲醛升汞固定液，会使上皮细胞产生非特异性荧光；
（4）固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果。
单纯固定液
（1）4%中性甲醛固定液：
最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作（Job）。
中性甲醛是以的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%甲醛固定液。
此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。
（2）乙醇固定液：
使用时以80%-95%的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，假如用于证实尿酸结晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定组织。
（3）4%多聚甲醛固定液：
主要用于培养细胞的固定。
混合固定液
（1）乙醇-甲醛（乙醇-福尔马林，AF）固定液：
适用于皮下组织中肥大细胞的固定。
该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95%乙醇脱水。
（2）B5（醋酸钠-升汞-甲醛）固定液：
多用于固定淋巴组织。
染色前应进行脱汞沉淀处理。
（3）Bouin固定液：
非凡适用于睾丸活检组织的固定。
Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆。
需现配现用。
（4）Carnoy固定液：
穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，非凡适用于固定外膜致密的组织，也适用于糖原及尼氏小体的固定。
（5） Zenker固定液：
经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清楚，但成本较高且需非凡处理汞。
该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。