柱层析介绍..

（2）湿装法
基本方法与干装法类似，所不同的是，装柱前吸附剂需要预先用 溶剂调成淤浆状，在倒入淤浆时，应尽可能连续均匀地一次完成。如 果柱子较大，应事先将吸附剂泡在一定量的溶剂中，并充分搅拌后过 夜（排除气泡），然后再装。其优点是一般柱子装的比较结实，没有 气泡。 无论是干装法，还是湿装法，装好的色谱柱应是充填均匀，松紧 适宜一致，没有气泡和裂缝，否则会造成洗脱剂流动不规则而形成 “沟流”，引起色谱带变形，影响分离效果。
（二） 层析的基本概念

固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如 吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固 定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合 物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一 个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般 称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 系数K： 是物质在两相中的浓度比。K值大，则在固定相中 吸附牢，K值小吸附差。各物质间的K值差别大，则易被分 离。不同类型层析的K值含义不同，可视为吸附平衡常数， 分配常数或离子交换常数等。


（三） 层析的分类
1、按操作形式： 柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离； 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目
的；
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分
离和鉴定；
2、根据移动相种类的不同： 气固层析(GSC) 气层析
不同物质分配系数不同时
不 同 组 分 的 含 量
上部
中部
下部
不同组分在柱中的位置
(二) 几个基本概念
外水体积是指凝胶柱中凝 胶颗粒周围空间的体积， 也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。内水体积是 指凝胶颗粒中孔穴的体积， 凝胶层析中固定相体积就 是指内水体积。基质体积 是指凝胶颗粒实际骨架体 积。而柱床体积就是指凝 胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积是指将样品中某 一组分洗脱下来所需洗脱 液的体积。
层析柱分离物质的示意图
A B 32 16 16 8 16 4 12 2 8
C
D E
8
12 4
12
8 2
固定相为固体颗粒，装在层析柱内，高5cm，固定相周围充满液体流动相， 每厘米柱中液相体积为1cm3。若在柱顶加入1cm3溶剂,其中含32mg样品，同 时应有相同体积的溶剂从柱底流出，此时样品处于柱中A位置。若样品的分 配系数是1，则它在固相与液相间等量分配。若再有1cm3的溶剂加到柱上，A 部分中的溶剂带着16mg的物质向下移动到B，A和B中的物质都将发生再分配
柱 层 析 简单的介绍
引用：李 正 邦 2007-10.17
资料来源于粤东之窗（）
目 录

层析的基本原理
☆层析的基本原理 ☆层析的基本概念 ☆层析的分类

柱层析的基本操作
☆原理 ☆几个基本概念 ☆基本操作步骤 ☆ 硅胶柱、大孔吸附树脂柱、聚酰胺柱

柱层析常见问题与对策
☆吸附剂的选择 ☆洗脱剂的选择 ☆操作方式
一、层析的原理
(一) 层析的基本原理
层析法（chromatography）又称色谱法，是利 用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、 分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使 各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一 相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同， 从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
气液层析(GLC)
液液层析(LLC)
液相层析
3、按层析的机理： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定 的目的； 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之 分离； 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同； 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。
如上图有：Vt＝Vo＋Vi＋Vg， 由于Vg相对很小，可以忽略不 计，则有：Vt＝Vo＋Vi。
（三）基本操作步骤
装 柱
加 样
洗 脱 和 分 离
收 集 各 组 分
鉴 定 与 检 测
1、装柱
色谱柱的大小规格由待分离样品的量 和吸附难易程度来决定。一般柱管的直径 为0.5-10cm，长度为直径的10-40倍。填 充吸附剂的量约为样品重量的20-50 倍， 柱体高度应占柱管高度的3/4。柱子过于 细长或过于粗短都不好。装柱前，柱子应 干净、干燥，并垂直固定在铁架台上。将 少量洗脱剂注入柱内，取一小团玻璃毛或 脱脂棉用溶剂润湿后塞入管中，用一长玻 璃棒轻轻送到底部，适当捣压赶出棉团中 的气泡，但不能压得太紧，以免阻碍溶剂 畅流（如管子带有筛板，则可省略该步操 作）。再在上面加入一层约0.5cm 厚的洁 净细砂，轻扣击柱管，使砂面平整。
常用的装柱方法有干装法和湿装法两种
（1）干装法 在柱内装入2/3 溶剂，在管口上放一漏斗，打开活塞让溶剂慢慢地 滴入锥形瓶中，接着把干吸附剂经漏斗以细流状倾泻到管柱内，同时 用套在玻璃棒（或铅笔等）上的橡皮塞轻轻敲击管柱，使吸附剂均匀 地向下沉降到底部。填充完毕后，用滴管吸取少量溶剂把粘附在管壁 上的吸附剂颗粒冲入柱内，继续敲击管子直到柱体不再下沉为止。柱 面上再加盖一薄层洁净细砂，把柱面上液层高度降0.1~1cm，再把收 集的溶剂反复循环通过柱体几次，便可得到沉降得较紧密的柱体。
以上划分无严格界限，有些名称相互交叉，如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析，纸 层析是一种分配层析，柱层析可做各种层析。
液固层析(LSC)
二、柱层析的基本操作
（一） 原理
柱色谱一般有吸附色谱和分 配色谱两种。前者常用氧化铝和 硅胶作固定相，在分配柱色谱中 以硅胶、硅藻土和纤维素作为支 持剂，以吸收一定量的液体作固 定相，而支持剂本身不起分离作 用。实验室中最常用的是吸附色 谱。根据混合物中各组分对吸附 剂（即固定相）的吸附能力，以 及对洗脱剂（即流动相）的溶解 度不同将各组分分离。
2．加样
上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用 少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如 此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但 可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就 是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大 的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得 到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。加完后，用少量溶剂 把容器和滴管冲洗净并全部加到柱内，再用溶剂把粘附在管 壁上的样品溶液淋洗下去。慢慢打开活塞，调整液面和柱面 相平为止，关好活塞。如果样品是液体，可直接加样。