第三章高效液相色谱分析
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第三章 液相色谱法
2010/3/29
流动相脱气方法
• 1.超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器 放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较 简便，又基本上能满足日常分析操作的要求， 所以，目前仍广泛采用。 2.惰性气体鼓泡吹扫脱气： 将气源（钢瓶）中 的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的 流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶 替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小， 微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。
2010/3/29
2010/3/29
2010/3/29
2010/3/29
2010/3/29
四、注意事项
1. 流动相要过滤、脱气 2. 样品要过滤 3. 检测器要匹配 4. 进样前要注意系统是否平衡 5. 使用梯度洗脱时，进样前系统要回到 初始状态 • 6. 注意柱压 • • • • •
2010/3/29
第三章 液相色谱分析法
第一节 高效液相色谱法
一、高效液相色谱法 的特点 二、流程及主要部件 三、高效液相色谱法 的主要分离类型
2010/3/29
液相色谱仪（1）
2010/3/29
液相色谱仪（2）
2010/3/29
液相色谱仪（3）
2010/3/29
液相色谱仪（4）
2010/3/29
一、高效液相色谱法的特点
2010/3/29
流动相脱气方法
• 3.真空脱气装置： 将流动相通过一段由多孔性合成树 脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵 工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二 氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。
2010/3/29
色谱方法选择
2010/3/29
Polarity (极性）
Non-polar
流动相脱气方法
• 1.超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器 放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较 简便，又基本上能满足日常分析操作的要求， 所以，目前仍广泛采用。 2.惰性气体鼓泡吹扫脱气： 将气源（钢瓶）中 的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的 流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶 替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小， 微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。
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四、注意事项
1. 流动相要过滤、脱气 2. 样品要过滤 3. 检测器要匹配 4. 进样前要注意系统是否平衡 5. 使用梯度洗脱时，进样前系统要回到 初始状态 • 6. 注意柱压 • • • • •
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第三章 液相色谱分析法
第一节 高效液相色谱法
一、高效液相色谱法 的特点 二、流程及主要部件 三、高效液相色谱法 的主要分离类型
2010/3/29
液相色谱仪（1）
2010/3/29
液相色谱仪（2）
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液相色谱仪（3）
2010/3/29
液相色谱仪（4）
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一、高效液相色谱法的特点
2010/3/29
流动相脱气方法
• 3.真空脱气装置： 将流动相通过一段由多孔性合成树 脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵 工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二 氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。
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色谱方法选择
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Polarity (极性）
Non-polar
第三章液相色谱法
7/22/2020
反相色谱法
一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入 甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节 保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相 色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用 于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离， 常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的 pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH 值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。
7/22/2020
例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液， 于流动相中加入与待测离子X+有相反电荷的离子Y-
X+水相 + Y-水相
X+Y-有机相
由于离子对XY具有疏水性，因而被非极性固定 相提取。其它待测离子A1，A2...因与B离子间的 成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使 得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离 的目的。
7/22/2020
• ①流动相传质阻抗Hm＝Cmdp2u/Dm，Cm为常数。这是由于在一个流 路中流路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较 慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡 就随流动相前移，因而产生峰展宽。
• ②静态流动相传质阻抗Hsm＝Csmdp2u/Dm，Csm为常数。这是由于溶 质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起 峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定 相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。所 以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效 的关键。
反相色谱法
一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入 甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节 保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相 色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用 于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离， 常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的 pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH 值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。
7/22/2020
例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液， 于流动相中加入与待测离子X+有相反电荷的离子Y-
X+水相 + Y-水相
X+Y-有机相
由于离子对XY具有疏水性，因而被非极性固定 相提取。其它待测离子A1，A2...因与B离子间的 成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使 得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离 的目的。
7/22/2020
• ①流动相传质阻抗Hm＝Cmdp2u/Dm，Cm为常数。这是由于在一个流 路中流路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较 慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡 就随流动相前移，因而产生峰展宽。
• ②静态流动相传质阻抗Hsm＝Csmdp2u/Dm，Csm为常数。这是由于溶 质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起 峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定 相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。所 以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效 的关键。
高效液相色谱法教程
由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗
全多孔型固定相
粒很细（5~10m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。 二、流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选 择性。 （2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选 用检测器波长比溶剂的紫外截止波长 要长。所谓溶剂
第二节 高效液相色谱仪
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。
第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时， 溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不 透明的，它严重干扰组分的吸收测量。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较 大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。 （3）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也 要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪 峰”。
固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0108~1.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相
1从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液 相
解:液相色谱中提高柱效的途径主要有: 1.提高柱内填料装填的均匀性; 2.改进固定相
减小粒度; 选择薄壳形担体; 选用低粘度的流动相; 适当提高柱温 其中,减小粒度是最有效的途径.
4. 液相色谱有几种类型?它们的保留机理是什么? 在这些类型 的应用中,最适宜分离的物质是什么?
解:液相色谱有以下几种类型:液-液分配色谱; 液-固吸附色谱; 化学键合色谱;离子交换色谱; 离子对色谱; 空间排阻色谱等.
毛细管凝胶电泳(CGE) 是毛细管内填充凝胶或其他筛分介质， 如交联或非交联的聚丙烯酰胺。荷质比相等，但分子的大小不 同的分子，在电场力的推动下在凝胶聚合物构成的网状介质中 电泳，其运动受到网状结构的阻碍。大小不同的分子经过网状 结构时受到的阻力不同，大分子受到的阻力大，在毛细管中迁 移的速度慢；小分子受到的阻力小，在毛细管中迁移的速度 快，从而使它们得以分离。这就是CGE的分离原理．
解:在离子色谱中检测器为电导检测器,以电解质溶液作为流动 相,为了消除强电解质背景对电导检测器的干扰,通常除了分析 柱外,还增加一根抑制柱,这种双柱型离子色谱法称为化学抑制 型离子色谱法.
例如为了分离阴离子,常使用NaOH溶液为流动相，钠离子的干 扰非常严重，这时可在分析柱后加一根抑制柱，其中装填高容 量H+型阳离子交换树脂，通过离子交换，使NaOH转化为电导 值很小的H2O，从而消除了背景电导的影响．
二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸 点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只要试 样能够制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、 相对分子量大的限制。
2.液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比 较, 有哪些主要不同之处?
减小粒度; 选择薄壳形担体; 选用低粘度的流动相; 适当提高柱温 其中,减小粒度是最有效的途径.
4. 液相色谱有几种类型?它们的保留机理是什么? 在这些类型 的应用中,最适宜分离的物质是什么?
解:液相色谱有以下几种类型:液-液分配色谱; 液-固吸附色谱; 化学键合色谱;离子交换色谱; 离子对色谱; 空间排阻色谱等.
毛细管凝胶电泳(CGE) 是毛细管内填充凝胶或其他筛分介质， 如交联或非交联的聚丙烯酰胺。荷质比相等，但分子的大小不 同的分子，在电场力的推动下在凝胶聚合物构成的网状介质中 电泳，其运动受到网状结构的阻碍。大小不同的分子经过网状 结构时受到的阻力不同，大分子受到的阻力大，在毛细管中迁 移的速度慢；小分子受到的阻力小，在毛细管中迁移的速度 快，从而使它们得以分离。这就是CGE的分离原理．
解:在离子色谱中检测器为电导检测器,以电解质溶液作为流动 相,为了消除强电解质背景对电导检测器的干扰,通常除了分析 柱外,还增加一根抑制柱,这种双柱型离子色谱法称为化学抑制 型离子色谱法.
例如为了分离阴离子,常使用NaOH溶液为流动相，钠离子的干 扰非常严重，这时可在分析柱后加一根抑制柱，其中装填高容 量H+型阳离子交换树脂，通过离子交换，使NaOH转化为电导 值很小的H2O，从而消除了背景电导的影响．
二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸 点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只要试 样能够制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、 相对分子量大的限制。
2.液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比 较, 有哪些主要不同之处?
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
仪器分析 第三章高效液相色谱分析
主要分离机理
吸附能，氢键 疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力 立体效应 生化特异亲和力
主要分析对象或应用领域
异构体分离、族分离，制备 各种有机化合物的分离、分析与制备 高分子分离，分子量及其分布的测定 无机离子、有机离子分析 手性异构体分离，药物纯化 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
同时消耗样品少。
2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
（1）速度快-通常分析一个样品在15～30 min，有些样 品甚至在5 min内即可完成。 （ 2 ）分辨率高 - 可选择固定相和流动相以达到最佳分离 效果。 （3）灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学 检测器可达0.1pg。 （ 4 ）柱子可反复使用 - 用一根色谱柱可分离不同的化合 物。 （ 5 ）样品量少，容易回收 - 样品经过色谱柱后不被破坏， 可以收集单一组分或做制备。
基本要求： ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定 量的准确性至关重要；②流量准确可调，0.1～10 ml/min， ③输出压力高，一般应能达到 150 ～ 300kg/cm2 ；④液流稳 定，无脉动；⑤ 死体积小，要求小于0.5ml。⑥密封性能好， 耐腐蚀。
泵的使用及注意事项： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂 质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预 先过滤除去流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连接 砂滤棒。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动 相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况 下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏， 甚至只是由于溶液的静臵，就可能析出盐的微细晶体，这 些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。 因此，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于 色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶 固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
大学 师范类 化学专业 仪器分析学科 第三章高效液相色谱法
HPLC
阳离子交换
- + M++ RSO3 H
H+ + RSO3 M+
-
阴离子交换
Cl X RNR+ + 3
阳离子交换树脂
RNR3 X + Cl-
+
-
3、流动相
水相缓冲液+有机溶剂
调节选择性的 主要参数
盐种类及浓度 pH值
各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：
2 2 2 柠檬酸离子 SO4 C 2O4 I NO3 CrO4 Br
( BH+ RSO3 )m ( BH+ RSO3 ) s
离子对
+ + 通式 B+ + A ( ) ( B B A A )s m 疏水性离子对不易在水中离解而迅速进入有机相中， 存在下述萃取平衡：
X+水相+ Y-水相
[B A ]s [ B A ]s KB A [B ]m [B ]m [A ] m
故要减小He，提高柱效，应采用小颗粒固定 相并填充均匀。
HPLC
2、分子扩散相Hd（纵向扩散项）
cd Dm Hd u
cd ：常数
Dm ：分子在流动相中的扩散系数
u :
流动相流速
Dm 一般很小，当u较大时，Hd很小，Hd可忽略
HPLC
3、传质阻力项
HPLC
（1） 固定相传质阻力项
Hs Cs d f Ds u
硅烷化反应
硅胶
十八烷基 氯硅烷
ODS(C18)键合相 非极性
键合固定相类 型 疏水基团 烷烃（C8和C18）、苯基等 极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
阳离子交换
- + M++ RSO3 H
H+ + RSO3 M+
-
阴离子交换
Cl X RNR+ + 3
阳离子交换树脂
RNR3 X + Cl-
+
-
3、流动相
水相缓冲液+有机溶剂
调节选择性的 主要参数
盐种类及浓度 pH值
各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：
2 2 2 柠檬酸离子 SO4 C 2O4 I NO3 CrO4 Br
( BH+ RSO3 )m ( BH+ RSO3 ) s
离子对
+ + 通式 B+ + A ( ) ( B B A A )s m 疏水性离子对不易在水中离解而迅速进入有机相中， 存在下述萃取平衡：
X+水相+ Y-水相
[B A ]s [ B A ]s KB A [B ]m [B ]m [A ] m
故要减小He，提高柱效，应采用小颗粒固定 相并填充均匀。
HPLC
2、分子扩散相Hd（纵向扩散项）
cd Dm Hd u
cd ：常数
Dm ：分子在流动相中的扩散系数
u :
流动相流速
Dm 一般很小，当u较大时，Hd很小，Hd可忽略
HPLC
3、传质阻力项
HPLC
（1） 固定相传质阻力项
Hs Cs d f Ds u
硅烷化反应
硅胶
十八烷基 氯硅烷
ODS(C18)键合相 非极性
键合固定相类 型 疏水基团 烷烃（C8和C18）、苯基等 极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
第3章+高效液相色谱分析
不同待测离子与反离子形成离子对的能力不同， 分配系数存在差异，导致在固定相中滞留时间不同， 从而实现色谱分离。
离子对的容量因子k可表示为：
VS 1 k DX K XY [Y ]水相 VM
则组分的保留时间：
L 1 t R (1 K XY [Y ]水相 ） u
分析实例：
§3-4 液相色谱的流动相
当固定相选定时，流动 相的种类、配比能显著地影 响分离效果，因此流动相的 选择很重要。
1.选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相（防止微量杂质长 期累积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加) 。 （2）避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度。 （4）溶剂的黏度小些为好。 （5）流动相同时还应满足检测器的要求。比如当使用 紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
子或反离子)，加到流动相中与溶质离子结合形成疏
水性离子对，从而控制溶质离子的保留行为。 阴离子分离：对离子常用烷基铵类，如氢氧化十 六烷基三甲铵。 阳离子分离：对离子常用烷基磺酸(己烷磺酸钠)。 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C18 柱)， 含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样
离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-。
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。小分子 可以扩散到凝胶空隙中通过，出 峰最慢；中等分子只能通过部分 凝胶空隙，中速通过；而大分子 被排斥在外，出峰最快；溶剂分 子小，故在最后出峰。 相对分子质量在100～105范围 内的化合物按质量分离。
空间排阻色谱固定相
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构。 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶。 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性 溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；如可控孔径玻璃微球，具有 恒定孔径和窄粒度分布。 化学稳定性，热稳定性好，机械强度大，流动相性质 影响小，可在较高流速下使用。
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永久性气体
低、中、高沸点有机 化合物
离子型无机化合物 热不稳定化合物
生物活性分子
总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相 色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的 发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物 学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核 酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物 等物质的分离和分析。
而高效液相色谱只需要样品能制成溶液，不需汽化，不 受样品挥发性的限制．特别适用于高分子化合物，易热降 解的物质及生物活性物质的分离，因此应用面比气相色谱 要高得多．
应用范围 分离效果
选择性
温度 灵敏度 (g/ml)
气相色谱（GC）
高效液相色谱 （HPLC）
占有机物的20% 占有机物的80%
高
更高
流动相是气体，只 能选择固定相
高效液相色谱法 （分析型） 特殊规格 3~20 <5% 10~30 0.1~0.5 20~300 104~105 10-7~10-2 0.05~0.5 仪器化
2．高效液相色谱法与气相色谱法
气相色谱法对挥发性样品是非常有效的分离方法．但是， 对分子量超过300的组分及热分解产品都不适用．由于样品 在工作温度下必须汽化这个特点限制了它的应用．为此， 人们不得不通过柱前衍生法使样品能够汽化，这样大大加 重了分析前处理的复杂性和数据的准确性．
色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可 以收集单一组分或做制备。
第三章 高效液相色谱 分析法
主要内容
• 3-1 HPLC的发展 • 3-2 HPLCE与经典液相色谱法和GC的差
异 • 3-3液相色谱法的原理和特点 • 3-4高效液相色谱的分类和原理 • 3-5液相色谱仪 • 3-6液相色谱的固定相与流动相 • 3-7影响分离的因素与操作条件的选择
3-1 HPLC的发展
对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径 0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出 20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。 又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯 度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.
固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱入口压强（kg/cm2） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
经典液相色谱法
一般规格 75~500 20~30% 10~100
2~5 0.01~1 10~100 1~10 1~20 非仪器化
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分 配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
特点：
高压——压力可达150～350 x105Pa。色谱柱每米降压为
75 kg/cm2以上。 高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份 可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样 品少。
现代液相色谱
现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅 是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操 作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱 效低，分析周期长。
而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压 输送;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使 柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）； 同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因 此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这 是它的主要缺点。
3-3液相色谱法的原理和特 点
液相色谱分离原理
原理：是指流动相为液体的色谱技术
液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰 性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动 相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根 据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换 作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分 子（溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作 用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
流动相是液体，流 动相、固定相都可 选择。选择性广。
高温
常温（分离效果好）
10-12
10-9
项目
气相色谱法
高效液相色谱法
进样方式 样品需气化或裂解
样品制成溶液
流动相
惰性气体
溶液
分离原理 检测器
吸附和分配
吸附、分配、筛析、亲 和等
TCD、FID、ECD
等
UVD、PDAD、RID等
应用范围
低沸点有机化合 物
(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度 高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效
液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：
第一位认识到色谱法是一种有效的分离方法的科学 家是俄国植物学家Tswett.他1903年发表的文章描述 了用100多种不同吸附剂得到的实验结果。 1931年 Kuhn和Lederer用氧化铝和碳酸钙做吸附剂 分离了植物色谱。
按照不同的相可以分为气-固色谱法，气-液色谱法 （GLC），临界状态色谱法，液-固色谱法，液-液 色谱法。
3-2 HPLCE与经典液相色 谱法和GC的差异
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高 速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比 经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出 速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高 可达 103cm·min-1.
低、中、高沸点有机 化合物
离子型无机化合物 热不稳定化合物
生物活性分子
总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相 色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的 发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物 学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核 酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物 等物质的分离和分析。
而高效液相色谱只需要样品能制成溶液，不需汽化，不 受样品挥发性的限制．特别适用于高分子化合物，易热降 解的物质及生物活性物质的分离，因此应用面比气相色谱 要高得多．
应用范围 分离效果
选择性
温度 灵敏度 (g/ml)
气相色谱（GC）
高效液相色谱 （HPLC）
占有机物的20% 占有机物的80%
高
更高
流动相是气体，只 能选择固定相
高效液相色谱法 （分析型） 特殊规格 3~20 <5% 10~30 0.1~0.5 20~300 104~105 10-7~10-2 0.05~0.5 仪器化
2．高效液相色谱法与气相色谱法
气相色谱法对挥发性样品是非常有效的分离方法．但是， 对分子量超过300的组分及热分解产品都不适用．由于样品 在工作温度下必须汽化这个特点限制了它的应用．为此， 人们不得不通过柱前衍生法使样品能够汽化，这样大大加 重了分析前处理的复杂性和数据的准确性．
色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可 以收集单一组分或做制备。
第三章 高效液相色谱 分析法
主要内容
• 3-1 HPLC的发展 • 3-2 HPLCE与经典液相色谱法和GC的差
异 • 3-3液相色谱法的原理和特点 • 3-4高效液相色谱的分类和原理 • 3-5液相色谱仪 • 3-6液相色谱的固定相与流动相 • 3-7影响分离的因素与操作条件的选择
3-1 HPLC的发展
对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径 0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出 20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。 又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯 度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.
固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱入口压强（kg/cm2） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
经典液相色谱法
一般规格 75~500 20~30% 10~100
2~5 0.01~1 10~100 1~10 1~20 非仪器化
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分 配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
特点：
高压——压力可达150～350 x105Pa。色谱柱每米降压为
75 kg/cm2以上。 高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份 可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样 品少。
现代液相色谱
现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅 是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操 作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱 效低，分析周期长。
而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压 输送;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使 柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）； 同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因 此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这 是它的主要缺点。
3-3液相色谱法的原理和特 点
液相色谱分离原理
原理：是指流动相为液体的色谱技术
液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰 性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动 相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根 据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换 作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分 子（溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作 用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
流动相是液体，流 动相、固定相都可 选择。选择性广。
高温
常温（分离效果好）
10-12
10-9
项目
气相色谱法
高效液相色谱法
进样方式 样品需气化或裂解
样品制成溶液
流动相
惰性气体
溶液
分离原理 检测器
吸附和分配
吸附、分配、筛析、亲 和等
TCD、FID、ECD
等
UVD、PDAD、RID等
应用范围
低沸点有机化合 物
(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度 高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效
液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：
第一位认识到色谱法是一种有效的分离方法的科学 家是俄国植物学家Tswett.他1903年发表的文章描述 了用100多种不同吸附剂得到的实验结果。 1931年 Kuhn和Lederer用氧化铝和碳酸钙做吸附剂 分离了植物色谱。
按照不同的相可以分为气-固色谱法，气-液色谱法 （GLC），临界状态色谱法，液-固色谱法，液-液 色谱法。
3-2 HPLCE与经典液相色 谱法和GC的差异
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高 速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比 经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出 速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高 可达 103cm·min-1.