有机酸发酵
有机酸工艺学-柠檬酸发酵微生物与发酵机制2
1-扇形划线法 2-分区划线法 3-方格划线法 4-连续划线法
■ 该法简单、快速、易行、理想的单菌落获得率较低。
（2）稀释平板分离纯化培养
■ 取已经灭菌的装有9mL无菌水试管数支，做好标 号，另用无菌吸管吸取上述玻璃珠振荡而制得的悬 浮液少许，注入1号试管内，充分的摇匀，吸取此 悬浮液1mL注入第二支试管中，以此类推，直至最 后一支试管，每稀释一管，必须更换一支无菌吸管。 再从最后2-3支无菌试管中吸取1mL倒入融化冷却 至42-45℃的麦芽汁培养基中，充分摇匀，静置凝 结成平板。倒置于恒温箱中，于35～37 ℃下培养 40～48h，挑取单个菌落，移接到斜面试管培养基 中，待检。
■ 在柠檬酸产酸期，也存在HMP途径的酶，其比率为 EMP/HMP=4:1，即80%的葡萄糖由酵解途径代谢的。 HMP途径主要存在于孢子形成阶段，因为它提供合成核酸 所需的前体物质。
五、黑曲霉积累柠檬酸基本条件： 耐受高浓度柠檬酸（20%以上） 耐受高浓度葡萄糖，粉浆浓度18%-20% 对磷、锰、铁、锌等无机盐耐受
（2）发酵过程pH值的变化
■ 在发酵过程中，随着菌种对培养基种碳、氮源的利用，随着有机酸和氨基 酸的积累，会使pH值产生一定的变化。
■ ①生长阶段：菌体产生蛋白酶水解培养基中的蛋白质，生成铵 离子，使pH上升至碱性；随着菌体量增多，铵离子的消耗也增 多，另外糖利用过程中有机酸的积累使pH值下降。
■ ②生产阶段：这个阶段pH值趋于稳定。 ■ ③自溶阶段：随着养分的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中
浓度范围
u2+
高浓度Mn2+将刺激乙酰辅酶A，造成草酰乙酸浓度下降，不利 于合成柠檬酸。
高浓度Zn2+抑制柠檬酸合成酶，不利于合成柠檬酸。当培养基 中 Zn2+浓度低时, 黑曲霉的生长受到抑制从而进入柠檬酸积累 阶段。
有机酸发酵工艺
有机酸发酵工艺有机酸发酵工艺是一种利用微生物进行发酵过程产生有机酸的技术。
有机酸是一类重要的化学品，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。
有机酸发酵工艺的研究和应用，对于提高有机酸的产量和质量，促进产业发展具有重要意义。
有机酸发酵工艺的基本原理是利用微生物的代谢特性，将底物（如糖类、脂类等）通过发酵过程转化为有机酸。
发酵过程中，微生物通过分解底物并产生酶类，将底物转化为有机酸。
有机酸发酵工艺的关键在于选择适合的微生物菌株和优化发酵条件。
选择适合的微生物菌株至关重要。
常用的有机酸生产菌株包括乳酸菌、醋酸菌、柠檬酸菌等。
不同的菌株对于底物的选择和发酵条件的适应性不同，因此在选择菌株时需要考虑到产酸效果和耐受性。
优化发酵条件是提高有机酸产量和质量的关键。
发酵过程中，温度、pH值、氧气供应等因素都会对发酵效果产生影响。
合理调控这些因素，可以提高微生物的代谢活性，促进有机酸的合成和积累。
有机酸发酵工艺的应用十分广泛。
在食品工业中，乳酸、柠檬酸等有机酸被广泛用于调味品、酸奶、果汁等产品的生产中，不仅能够增加食品的口感和风味，还具有抑菌和保鲜的效果。
在医药工业中，有机酸被用作药物的原料和媒介，可以提高药物的稳定性和生物利用度。
在化妆品工业中，有机酸被用于调节化妆品的pH值，保持产品的稳定性和品质。
然而，有机酸发酵工艺也面临一些挑战。
首先，有机酸发酵工艺的发酵周期相对较长，需要耐心等待。
其次，发酵过程中会产生大量的废水和废气，对环境造成一定的压力。
此外，微生物的生长和代谢受到很多因素的影响，如污染物、抗生素等，这些因素都会对发酵工艺产生影响。
为了克服这些挑战，研究人员正在不断改进有机酸发酵工艺。
通过选择更具酸产能的菌株、优化发酵条件、改进废水处理技术等手段，可以提高有机酸的产量和质量，减少对环境的影响。
有机酸发酵工艺是一项重要的技术，对于有机酸的生产和应用具有重要意义。
通过选择适合的菌株和优化发酵条件，可以提高有机酸的产量和质量，促进产业发展。
有机酸工艺学-柠檬酸发酵微生物与发酵机制
上海工微所 东酒2号 N-588 Co827 T419
初糖浓度18-19%，60-90h,产酸率19%，转化率 97%.
川柠-17-66（四川食品研究所），8668（黑龙江轻工 所），产酸14%，生长特性粗放，抗金属离子能力强， 以甘蔗糖蜜不需要黄血盐预处理。
葡萄糖： r-130 薯渣固态发酵： G2B2, 川柠1-1，Co827，T419
• 顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬 酸：=90：3：7的平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋 向于合成柠檬酸，而柠檬酸分解活力低，一旦柠檬酸浓 度升高到某一水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶的活力，从 而进一步促使柠檬酸的自身积累，PH降至2.0以下，顺乌 头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的 积累并排出体外。
丙酮酸激酶（PK）
• 变构酶 • 1,6-二磷酸果糖活化 • ATP和丙氨酸抑制 • 受柠檬酸或ATP抑制 • 被NH4+ ，K+激活
• 丙酮酸脱氢酶系的调节
• ATP/ADP,NADH/NAD+
• 产物抑制 • 乙酰COA，NADH抑制酶活性，
COASH,NAD+解除抑制 • 能荷调控 • GTP抑制，AMP活化
• 由于严格限制供给锰离子，从而解除了柠檬酸和ATP对PFK酶的反馈抑 制，使EMP途径的代谢流增大。
和线粒体中的依赖于NAD+的异柠檬酸脱氢酶均表达下调。
2020407 思考题
• 黑曲霉柠檬酸发酵过程中为什么控制MN2+浓度，与柠檬酸合成过程中 的酶调控有什么关系，请阐述机理。
• MN2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑，当培养基中MN2+缺乏时，微生 物体内积累几种氨基酸(GA、GLU、ARG、OIN等)，这些氨基酸的积 累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受 到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。 NH4+能有效 的解除柠檬酸、ATP对PFK酶的抑制作用
有机酸发酵工艺
有机酸发酵工艺一、介绍有机酸是一类具有重要应用价值的化学品，广泛用于食品、医药、化妆品等领域。
有机酸发酵是利用微生物在合适条件下将底物转化为有机酸的过程。
本文将就有机酸发酵工艺进行全面、详细、完整且深入地探讨。
二、有机酸发酵的微生物在有机酸发酵中，微生物起着关键的作用。
常见用于有机酸发酵的微生物有以下几类：1. 乳酸菌乳酸菌是广泛应用于乳制品工业中的微生物，在乳酸发酵中能将糖类转化为乳酸。
乳酸发酵工艺中常用的乳酸菌有乳酸杆菌、乳酸链球菌等。
2. 醋酸菌醋酸菌能将醇类、醛类和糖类等底物进行醋酸发酵。
其主要产物是醋酸，因此常用于醋的生产过程中。
3. 丙酸菌丙酸菌能将底物转化为丙酸，常用于丙酸的生产过程中。
丙酸菌有一定的耐受性和适应能力，能在不同环境条件下进行发酵。
三、有机酸发酵的工艺有机酸发酵的工艺包括底物选择、菌种选用、发酵条件等多个方面。
1. 底物选择底物选择是有机酸发酵中的关键步骤。
不同微生物对底物的需求和适应能力不同，因此在选择底物时需要考虑微生物的特性和产酸能力。
常用的底物有糖类、醇类、脂肪类等。
2. 菌种选用菌种的选用直接影响到有机酸发酵的效果。
在选用菌种时，需要考虑菌种的产酸能力、发酵稳定性、产酸速度等因素。
同时，菌种的保存和培养也是发酵过程中的重要环节。
3. 发酵条件发酵条件包括温度、pH值、氧气供应以及营养物质等。
合理调控发酵条件可以提高产酸效果和产酸速度。
不同的有机酸发酵过程对发酵条件的要求有所差异，需要根据具体情况进行调整。
4. 发酵过程监控发酵过程的监控是保证有机酸发酵稳定进行的重要环节。
通过监测有机酸产量、底物消耗、pH值变化等指标，可以及时调整发酵条件，保证发酵效果。
四、有机酸的应用有机酸在食品、医药、化妆品等领域有广泛的应用。
1. 食品工业有机酸常用于食品的酸化处理和防腐。
例如，乳酸广泛应用于酸奶、酸黄瓜等食品的制作中；柠檬酸常用于饮料和果汁中，起着增酸的作用。
2. 医药工业有机酸在医药领域有重要的应用价值。
有机酸发酵工艺
有机酸发酵工艺
有机酸发酵工艺是指以微生物为媒介，将含有可发酵的有机物质转化为有机酸的一种生产工艺。
有机酸发酵工艺可以分为单一微生物发酵和多菌种共同发酵两种方式。
单一微生物发酵指的是利用单一种类的微生物，如乳酸菌、醋酸菌等，通过发酵将有机物转化为有机酸。
这种方式的优点是操作简单，发酵过程容易控制，但也存在微生物的特异性限制，只能利用特定的微生物进行发酵。
多菌种共同发酵则是利用多种微生物的协同作用，共同完成有机物质的转化。
这种方式可以利用微生物的互补作用，提高发酵效率和产量，但同时也需要控制不同微生物之间的竞争关系，以避免不良反应的发生。
有机酸发酵工艺在食品、饲料、医药等领域都有广泛应用。
例如，乳酸菌发酵可制备酸奶、酸乳等乳制品；醋酸菌发酵可制备醋；柠檬酸菌发酵可制备柠檬酸等酸味剂。
此外，某些有机酸还具有一定的保健功能，如乳酸可以调节肠道菌群平衡、增强免疫力等。
有机酸发酵工艺的发展趋势是向高效、高产、低耗、绿色化方向发展，同时也要考虑微生物的资源可持续利用和环境保护等因素。
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生化工艺 第七章 典型产品生产工艺 第二节有机酸的生产工艺
第七章
典型产品生产工艺
第一节 抗生素生产工艺 第二节 有机酸生产工艺 第三节 氨基酸生产工艺 第四节 啤酒生产工艺 第五节 其他产品的生产工艺 第六节 发酵过程经济评价
第二节 有机酸的生产工艺
有机酸发酵工业是生物工程领域中的一个重要且较 为成熟的分支,在世界经济发展中,占有一定的地位。有 机酸在传统发酵食品中早已得到广泛应用,以微生物发酵 法生产且达到工业生产规模的产品已有十几种。
（2）柠檬酸的提取 从柠檬酸发酵液制备结晶柠檬酸一般 包括三个步骤：
①去除菌丝和其它固形物得到滤液； ②用各种物理和化学方法处理滤液，得到初步纯化的柠 檬酸溶液； ③初步纯化的柠檬酸溶液经精制后浓缩得到结晶柠檬酸。
第二节 有机酸的生产工艺
柠檬酸的提取方法有五种：钙盐法、溶剂萃取法、 电渗析法、液膜法和逆向渗透法。
表7-1 一些常用发酵法生产的有机酸的来源和用途
有机酸名称 柠檬酸 乳酸
来源
黑曲霉、酵母等 德氏乳杆菌、赖氏乳杆菌、米根菌等
用途
食品工业和化学工业的酸味剂、 增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂、除 腥脱臭剂、鳌合剂、纤维媒染剂、 助染剂等 食品工业的酸味剂、防腐剂、还 原剂、制革辅料等
醋酸 葡萄糖酸
衣糠酸 苹果酸
用微生物发酵法生产有机酸,以代替从水果和蔬菜等 植物中提取有机酸,是近年来由于社会及市场的需要而开 发出的方法。由于食品、医药、化学合成等工业的发展， 有机酸需求骤增，发酵法生产有机酸逐渐发展成为近代 重要的工业领域。
第二节 有机酸的生产工艺
一、有机酸的来源与用途
柠檬酸、乳酸、醋酸、葡萄糖酸、衣糠酸和苹果酸等有 机酸是重要的工业原料，在食品工业、化学工业等领域有重 要的作用。在现代有机酸的生产过程中，发酵法生产有机酸 占有重要的地位，表7-1是一些常用发酵法生产的有机酸的 来源和用途。
《有机酸发酵生产》课件
基于化学方法的生产 方法
使用化学催化剂和合成反应， 实现高效有机酸的合成。
基于混合方法的生产 方法
将生物法和化学法相结合，既 充分利用微生物发酵产酸的能 力，又提高了产量和纯度。
发展趋势及前景
市场需求分析
随着生物技术和环保意识的提高，对有机酸的需求逐渐增加。
发展趋势预测
有机酸生产技术将更加成熟和高效，市场规模将继续扩大。
发展前景展望
有机酸生产具有巨大的经济和环保潜力，将在多个领域发挥重要作用。
结论
1 经济、环保的生产方 2 生物技术将提高生产 3 前景广阔的市场
法
效率和质量
有机酸生产市场前景广阔，
发酵生产有机酸是一种经
发展生物技术将进一步提
未来的发展潜力可期。
济、环保的生产方法，对
高有机酸生产的效率和质
可持续发展具有重要意义。
有机酸生产的三种方法
1 发酵法
利用微生物进行发酵反应生成有机酸。
3 混合法
结合发酵法和化学法进行有机酸的生产。
2 化学法
通过化学反应合成有机酸。
发酵生产原理
1 发酵生产的基本原理
通过微生物代谢产生有机酸，如乳酸、醋酸、丙酮酸、柠檬酸等。
2 发酵微生物的分类和特性
微生物的选择和调控对发酵生产有机酸的效率和产量有重要影响。
3 发酵过程的调控
温度、pH值、氧气供应等因素对发酵过程的控制十分关键。
发酵生产流程
1
原料准备
选择和处理适宜的原料，如各种碳源和
发酵罐装置
2氮源。选择合适的发酵 Nhomakorabea和系统，提供合适的
环境条件。
3
控制系统
使用自动化控制系统监测和调节发酵过
有机酸工艺学-其它有机酸发酵工艺-苹果酸
刘建军等人从土壤中分离出几株直接利用糖质原料生产L-苹 果酸的黄曲霉菌株，经紫外线、亚硝基胍 ,Co60,硫酸二乙脂 等诱变处理、高酸和高渗透压平板分离，获得一株L-苹果酸 高产突变株黄曲霉HA5800，以100g/L的葡萄糖为碳源, 35℃ , 200r/min摇瓶发酵120h,L-苹果酸产率稳定在72g/L以 上，糖酸转化率达74.23%。传代实验证明该菌株产酸性能稳 定
苹果酸的水溶液在Fe2+催化下与H2O2反应生成草酰 乙酸。
苹果酸在三氯化硼催化下，可与醇发生酯化反应， 形成苹果酸酯。
与多元醇，芳香多元羧酸作用，可形成树脂类产品， 如醇酸聚树脂。
苹果酸酯在氨的醇溶液中能形成苹果酸酰胺。
4.2.2.2苹果酸的用途
苹果酸得最大用途在食品加工业，其次在医药行业 和化学工业也有应用。
直接发酵生产苹果酸
中国科学院北京微生物研究所研究了固定化皱褶假 丝酵母(Candida rugosa)的苹果酸生产技术。
福建省三明真菌研究所研究了L-苹果酸的霉菌固体 发酵。
1981年起无锡轻工大学金其荣等，普查了261株各 种曲霉的苹果酸生产能力，并对菌种进行了诱变处 理和发酵最佳条件的探讨，选出了优良菌株黄曲霉 (Aspergillus flavus)UVT3，并在昆山味精厂协作 下完成了500L罐中试，糖酸转化率稳定在68%左右。
其他行业的应用：
苹果酸具有抗氧化和较强的螯合作用，作为保色剂和增效剂， 广泛用于染料工业；
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有机酸中柠檬酸的发酵概况班级：生工（2）姓名：周誉学号：0802012040【摘要】:有机酸是指一些具有酸性的有机化合物。
最常见的有机酸是羧酸，其酸性源于羧基(-COOH)。
磺酸(-SO3H)、亚磺酸(RSOOH)、硫羧酸(RCOSH)等也属于有机酸。
有机酸可与醇反应生成酯。
羧基是羧酸的官能团，除甲酸(H-COOH)外，羧酸可看做是羟分子中的氢原子被羧基取代后的衍生物。
可用通式(Ar)R-COOH表示。
羧酸在自然界中常以游离状态或以盐、酯的形式广泛存在。
羧酸分子中羟基上的氢原子被其他原子或原子团取代的衍生物叫取代羧酸。
重要的取代羧酸有卤代酸、羟基酸、酮酸和氨基酸等。
有机酸发酵工业是生物工程领域中的一个至要且较为成熟的分支，在世界经济发展中，占有一定的地位。
有机酸在传统发酵食品小早已得到广泛应用。
以微生物发酵法生产且达工业生产规模的产品已达十几种。
用微生物发酵法生产有机酸，以代替从水果和蔬菜等植物中提取有机酸，是近年来由于社会及市场的需要而开发出的方法。
由于食品、医药、化学合成等工业的发展，有机酸需求骤增，发酵生产有机酸逐渐发展成为近代重要的工业领域。
有机酸发酵历史悠久。
早在远古时代,人们就巧妙地酿造出不同风味的酒醋,如葡萄酒醋、米醋和蜜醋等。
随着微生物的研究进展,陆续发现霉菌和细菌可以利用葡萄糖等碳水化合物生战各种有机酸,如丙酸、乳酸。
本世纪中阐明TCA循环的每一步反应都有相应酶催化,如果用某种方法阻断TCA循环中的某一步反应,就会大量积累相应的中间代谢物,现已能用发酵法制备柠檬酸、异柠檬酸、α—酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸等等TCA循环有机酸。
【关键字】：有机酸、柠檬酸、发酵【正文】：一：柠檬酸的发酵流程柠檬酸是生物有机体三羧酸循环的中间代谢产物之一，广泛存在于各种生物体中，特别是柠檬、柑橘、菠萝、李、梅、桃、大花果等果实中含量较高，某些植物的叶子，如烟叶、棉叶，以及动物肌肉、骨骼、乳汁、唾液、汗、尿中也存在柠檬酸；1．原料。
工业上生产柠檬酸所用原料主要有废糖蜜、蔗糖及淀粉质原料如甘薯干。
用含淀粉原料生产时，最好在发酵前先用淀粉酶及糖化酶进行适当的糖化。
氮源对柠檬酸的发酵生产特别重要，氨、氢氧化铵或磷酸铵可以大大提高产量，在代谢中首先形成氨基酸如谷氨酸、甘氨酸及丙氨酸，这些氨基酸促进了柠檬酸的形成。
一些金属离子如钼、铜、锌或钙等对柠檬酸合成有一定抑制作用。
低铁氰化钾{K4[Fe(CN)6]}则可以提高柠檬酸的产量，这是由于它可以沉淀对柠檬酸合成有抑制作用的某些金属盐，如以糖蜜为原料时，糖蜜中存在大量的锰和铁盐，在80～100？温度下可以在15min 内被低铁氰化钾沉淀。
此外在培养基中含有1—2mol／L的1，2--*氨基环己烷一氮、氮一四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸及EDTA等时，能促进黑曲霉合成柠檬酸。
2％的甲醇对柠檬酸合成也有利。
一些非离解性的表面活化剂，可以在发酵时使菌丝均匀分散于培养液中，从而提高柠檬酸的产量。
2．柠檬酸的静置浅盘发酵静置浅盘发酵即表面发酵法，是在1923年实现规模生产的，其主要原料是糖蜜。
发酵容器为不锈钢等耐酸蚀的金属盘，盘上有进料口和出料口、无菌空气进出口等，大小根据条件设计。
培养液组成为：12％～20％的糖蜜，添加黄血盐、EDTA或六氰基高铁酸钾、磷酸二氢钾、硫酸锌以及抗菌剂等。
培养基经灭菌，调节pH至6．0—6．5，冷却至45～50C左右时输入盘内，继续冷却至3512，以干孢子喷雾接种(100～150mg孢子粉／m2培养基表面)。
培养盘固定在培养室内，培养室具有可以灭菌、保温和无菌空气供给系统等。
发酵温度为3013，发酵过程中通人无菌空气，孢子1～2d发芽，然后长成菌盖，发酵周期一般为6—8d，pH降至2．0，柠檬酸产量为200～250g／L，每百克葡萄糖约生成75g左右的柠檬酸。
发酵中柠檬酸合成高峰时为0．9～1．1k8／m3·h，平均合成速率为0．2～0．4k8／m3．h。
3．柠檬酸液体通风发酵(深层通气发酵) 发酵基质可以是糖质原料，也可以是淀粉质原料，在我国一般以甘薯干为原料，这是由于甘薯干价格低，原料来源丰富，便于贮藏和运输等。
柠檬酸深层发酵生产工艺流程：(1)原料处理薯干粉碎，要求粉碎度要细。
(2)种子制备斜面和茄瓶菌种，用10～12~Bx麦芽汁加0.1％磷酸二氢钾作培养基，30℃下培养5d，孢子形成丰富。
种子罐培养：是种子的进一步扩大，其培养基接近于发酵培养基，其组成为薯干粉8％一14％，麸皮1％(或加0.15％硫酸铵)。
灭菌后用茄瓶孢子接种，在32℃下通气培养22—24h，pH降至3以下，镜检无杂菌，菌丝生长良好。
(3)发酵生产培养基为18％的薯干粉，为浓醪发酵，灭菌前加入0．05％的o—淀粉酶。
发酵温度为32℃，通风量在12h前为l:0.1(y:y)，12h后为1：0.2，一般发酵周期为112～120h。
柠檬酸生产方式除上述表面培养和深层通气培养外，还有固体培养和连续发酵等方法。
固体发酵主要用于加工中的副产物如甘薯淀粉生产中的淀粉渣，果汁生产中的苹果、甘蔗渣等。
固体发酵工艺流程4。
连续发酵法有许多优点：发酵过程中通过离子交换法不断将柠檬酸分离出来，发酵液中柠檬酸始终处于较低浓度，加之不断补人糖等营养物，使菌处于一个适宜的环境中。
离子膜分离出的柠檬酸纯度较高，但此法尚未用于生产。
此外，固定化技术应用于柠檬酸生产也是一个诱人的课题。
现在工业生产中仍以深层通气发酵为主，有少数国家用浅盘培养和固体发酵。
(四)柠檬酸的分离提纯柠檬酸的分离提纯有钙盐法、直接提取法、溶媒萃取法以及离子交换法和渗析法等。
1．钙盐法即是将发酵液中的柠檬酸变成钙盐沉淀，然后用硫酸将柠檬酸钙置换出游离的柠檬酸,生成的硫酸钙沉淀出来,然后将柠檬酸进一步纯化结晶.柠檬酸提取工艺流程(1)柠檬酸钙的生成发酵结束后，发酵液滤去菌丝，滤液按总酸量的70％加入碳酸钙粉进行中和，随即将其煮沸，柠檬酸钙沉淀出来，在95℃以上高温时柠檬酸钙溶解度低，而其他有机酸的钙盐溶解度则较高。
然后用90～95℃热水充分洗涤沉淀，洗净培养基中带来的糖分和其他可溶性杂质。
(2)硫酸置换反应把热水洗净的柠檬酸钙加水搅成糊状，在搅拌下加入浓硫酸，温度控制在8013以上，当硫酸加的量能完全满足置换反应时，柠檬酸游离出来，硫酸与钙离子形成硫酸钙沉淀出来。
硫酸的用量约为加入的碳酸钙的85％～90％，如硫酸加入量不足时，会造成柠檬酸钙反应不完全，余下的柠檬酸三钙混于柠檬酸中，柠檬酸无法结晶；而硫酸过量时，浓缩过程中酸度增高，当温度升高至70—75℃时，会引起柠檬酸分解，产生蚁酸等挥发酸，产品颜色较深。
在酸解反应中应严格控制温度，在相对饱和度下，温度低时，有多量可溶性二水硫酸钙存在，混于柠檬酸液中，也影响过滤。
在较高的温度下是以CaS04.1/2H20和硫酸钙的形式存在，溶解度极低，成为沉淀被过滤除去。
(3)脱色为了得到纯净的柠檬酸结晶，首先须去除色素，脱色的方法有活性炭脱色和大孔树脂脱色等。
(4)去除阳离子杂质生产中多采用树脂进行离子交换，常用的树脂为732阳离子树脂，当有pH4的溶液流出时，表示已有柠檬酸流出，开始收集。
(5)浓缩在常压下浓缩易导致柠檬酸分解，应进行减压浓缩。
(6)结晶在缓慢搅拌下冷却结晶，使晶粒均匀。
钙盐法的缺点是劳动强度大，设备易腐蚀，提取收率仅70％左右，同时造成环境污染。
2．直接提取法本法适用于柠檬酸含量高、杂质少的发酵滤液。
可以用以下几种方法得到柠檬酸结晶。
(1)过滤清液先用活性炭脱色去除杂质，浓缩结晶。
(2)用CFCl2-CFCl2抽提除去蛋白质及其他杂质，将滤液分离出来浓缩结晶。
(3)以甲醇沉淀滤液中的蛋白质，洗涤沉淀，回收甲醇后浓缩结晶。
(4)用活性炭将滤液脱色、浓缩，再用3倍量丙酮沉淀蛋白质，分离、回收丙酮缩结晶。
3．萃取法即用溶媒将柠檬酸从发酵滤液中分离出来，常用的萃取溶剂有4类：①仅含碳、氢、氧的乙酸乙酯、二乙醚、甲基异丁酮；②含磷氧键的磷酸三丁脂；③含硫氧键的亚砜；④有机胺如三辛胺。
使用时可用正己烷、甲苯、乙酸乙酯、正丁醇等对某些黏度大的萃取剂进行稀释。
萃取中柠檬酸在两相中的分配与萃取温度、柠檬酸浓度以及滤液中所含杂质等因素有关。
4．离子交换和渗析法提取柠檬酸用弱碱性OH—型701阴离子树脂吸附，用5％氢氧化铵洗脱，得到柠檬酸铵溶液，然后通过强酸性H+型732树脂交换，柠檬酸游离出来。
目前，德国和日本的专利采用一种新的C1—型阴离子树脂，直接用盐酸洗脱，简化了操作步骤。
二：发酵过程中影响因素1 .通气与搅拌(溶氧)对柠檬酸发酵的影响．黑曲霉是需氧菌．它的生长、繁殖和维持生命活动以及由葡萄糠转化为柠檬酸时都需要耗用一定的氧气。
在一定范围内培养基的溶氧分压几乎与产酸成正比，溶氧分压低，产酸明显受影响或甚至完全不产酸。
特别是考虑到，在发酵15—30h这一阶段，菌体大量生长繁殖耗氧量最大，而产酸阶段耗氧虽略有减弱，而在这一时期缺氧造成的损伤是不可逆的。
因此在整个发酵过程中一刻也不能停止通气和搅拌，才能保证溶氧的供应。
加大通气或搅拌均可提高溶氧分压，但通气和搅拌均需耗用大量电能，而且强烈搅拌的剪切力有可能损伤黑曲霉菌丝，过度的通气不仅易产生泡沫，而且有可能导致降低CO2浓度，影响CO2固定。
因此必须根据发酵设备、培养基以及菌种特性的情况，合理控制通气和搅拌，既保证所需溶氧的供应，又经济节能。
2 .关于柠檬酸发酵菌丝球问题。
黑曲霉发酵生产：柠檬酸时，菌丝球的形成与产酸密切相关。
所谓菌丝球是指由许多真菌菌丝缠绕而成的小球，它是由菌球中心向四周辐射的分支菌丝构成的。
菌丝球的大小、结构和数量对产酸有明显影响。
发酵过程若产生分支状菌丝、不成小球，则一般产酸很差；若菌丝球大而结实，产酸也不好：若菌丝球伸“脚”茵丝太多，产酸也受影响；只有形成小而紧密、核心部分呈空心状的菌丝球产酸才良好。
3 .微量元素与柠檬酸发酵。
已知Mg2+ 、Zn2+、 Mn2+、 Cu2+、 Fe2+’和S、P、K、Na等元素都是黑曲霉生长所必需的。
但是它们对黑曲霉的柠檬酸生物合成并非同等重要。
Fe2+ 、 Zn2+和Mn2+三种元素对柠檬酸发酵的影响更为显著Fe2+是生物体内多种酶的组成部分，特别是氧化还原过程必须有铁的存在，入’又是TCA循环中顺乌头酸酶等的激活剂，因此传统亡认为铁的缺乏是柠橡酸积累的必要条件之一。
但事实并非如此简单，只有在磷、锌、锰等充裕时才呈现这种作用。
4 . 另外， Cu2+对Fe2+有拮抗作用。
Cu2+也是黑曲霉生长所必需的，它是多种酶的组分，(Cu2+不仅能拮抗Fe2+的作用，对Mn2+的负效应也有抵消作用，但高浓度Cu2+对柠檬酸产生也有毒害作用。