琼脂打孔法抑菌圈试验
不同检测方法在抗菌肽抑菌效果评价的比较研究
不同检测方法在抗菌肽抑菌效果评价的比较研究作者：潘晓倩等来源：《肉类研究》2014年第12期摘要：目的：比较5种抗菌肽活性测定方法。
方法：以金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为实验菌株，研究牛津杯法、打孔法、滤纸片法、酶标比浊法和活菌计数法对不同质量浓度的抗菌肽抑菌活性评价的比较。
结果：3 种琼脂扩散定性抑菌实验中，打孔法灵敏度高，抑菌圈清晰规则，效果最好；2 种定量抑菌实验中，活菌计数法结果判定更直观，灵敏度高，效果最好。
结论：抗菌肽抑菌活性研究过程中，选用打孔法定性与活菌计数法定量相结合的方法，能够更全面、准确地反应其抑菌活性。
关键词：抗菌肽；抑菌活性；测定方法Abstract： Objective： To comparatively evaluate the performance of several antimicrobial peptide activity assays. Methods： Using Staphylococcus aureus， Staphylococcus haemolyticus and Bacillus subtilis as experimental strains， the antimicrobial activity of the antimicrobial peptide nisin at different concentrations was determined by Oxford cup method， punching method， filter paper method， microtiter plate assay and viable count method， respectively. Results： Among three agar-diffusion methods， punching method was the most sensitive， which provided clear and regular inhibition rings. Our comparison of two quantitative activity assays indicated that viable count method， showing high sensitivity and intuitive results， was better than microtiter plate assay. Conclusion： Combined application of punching method and viable count method allows comprehensive and accurate measurement of antimicrobial peptide activity.Key words： antimicrobial peptide； antimicrobial activity； assay中图分类号：TS251 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）12-0017-04抗菌肽是生物体在抵御病原微生物的防御反应过程中产生的一类具有抗菌作用的小分子多肽，其特有的氨基酸组成与结构可以破坏细菌细胞膜结构，导致其死亡[1-2]。
打孔法抑菌试验操作流程
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8种中草药对大肠杆菌的体外抑菌试验_向双云
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8 种中草药对大肠杆菌的体外 MIC 测定结果 黄芩 + + ++ ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 黄连 － － － + ++ ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ 黄柏 + + ++ ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 鱼腥草 穿心莲 五味子 － + － － － + ++ ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ + ++ ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ － － － + + ++ +++ ++++ ++++ ++++ 连翘 － + ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 艾草 － － － － + + + ++ +++ ++++ ++++
第十九章药物的体外抗菌试验
抑菌圈的大小反映待测菌对该药物的敏感程度并与 该待测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈 越大，最低抑菌浓度就越小。
最低抑菌浓度（MIC）：指抗菌药物能够抑制细菌生长 所需要的最低浓度，单位是ug/ml或u/ml。
如庆大霉素对铜绿假单胞菌的MIC为1.56ug/ml，青 霉素G的MIC>128ug/ml，由此可判定庆大霉素对铜绿 假单胞菌的抑菌效力大于青霉素。
5、影响结果的因素
（1）培养基：除在M－H培养基上无法生长的细菌外，一 般都固定使用M－H培养基。
（2）抗菌药物：原则上采用标准粉剂，不用口服药物，配 好的原液应在有效期内使用。
（3）结果观察：应在12－18小时之间。培养时间过长，轻 度抑制的细菌可重新生长；或抗菌活性降低，甚至消失， 从而使MIC值增高。
（3）接种菌液的准备：从纯培养的平板上挑取形态相同 的4－5个菌落，接种于 3－5mlM－H液体培养基内， 35℃培养4－6小时，营养要求高的则培养过夜，然后校 正菌液浓度至0. 5麦氏比浊标准，再用M－H液体培养基 作1：200稀释，并在15分钟内接种。
3、试验步骤
（1）排列10－15支试管，除第1支外，各管加入M－H液 体培养基1ml。
（三）实验步骤
（1）菌液接种：用灭菌过的棉拭蘸取已制备的菌液涂抹 在M－H平板培养基的表面，均匀涂抹3次，每涂一次，平 板应转动60度，最后将棉拭绕平板内缘涂沫一圈，盖上平 皿盖，放置室温干燥数分钟。
（2）药物纸片的贴放：以无菌镊子取各种抗菌药物纸 片，贴放于已接种过试验菌的平板培养基表面，纸片贴后 不能再移动，因为有些药物可立即扩散。各纸片中心间距 不小于24mm，距平板边缘不小于15mm。直径为90mm的 平板可贴放6张纸片。贴后15分钟内倒置35℃培养箱16－ 18小时后阅读结果。
抑菌效果的检测方法
抑菌效果的检测方法
另外，我们还可以从化学角度来考虑。
常见的抑菌效果检测方法包括最小抑菌浓度法和扩散法。
最小抑菌浓度法是将不同浓度的待测物溶液与一定数量的细菌接种在琼脂培养基上，培养一段时间后观察最低浓度的待测物能够抑制细菌生长。
扩散法是将待测物溶液加在琼脂培养基上，待其凝固后在琼脂上打孔，然后在孔中加入一定数量的细菌液，培养一段时间后观察抑菌圈的直径来评价抑菌效果。
此外，还可以从临床角度考虑。
在医药领域，抑菌效果的检测方法包括在体外和体内实验。
在体外实验中，可以使用培养皿法或微量稀释法来评价抗菌药物的抑菌效果。
在体内实验中，可以通过动物模型来评价抗菌药物的疗效和抑菌效果。
综上所述，抑菌效果的检测方法涉及微生物学、化学和临床等多个领域，不同的方法各有优劣，选择合适的方法取决于具体的实验要求和研究目的。
希望以上信息能够对你有所帮助。
琼脂扩散试验的实验报告
琼脂扩散试验的实验报告实验目的：本实验旨在通过琼脂扩散试验来研究不同浓度的抗生素对细菌生长的影响，以及评估抗生素的抗菌活性。
实验原理：琼脂扩散试验是一种常用的抗菌活性测定方法。
在该试验中，细菌被接种到琼脂平板上，随后在平板上打孔并加入不同浓度的抗生素。
随着抗生素在琼脂中扩散，其周围的细菌生长受到抑制，形成透明或半透明的抑菌圈。
抑菌圈的直径可以作为抗生素抗菌活性的指标。
实验材料：1. 细菌培养物（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌）2. 抗生素溶液（如青霉素、链霉素等）3. 琼脂培养基4. 培养皿5. 打孔器6. 移液枪7. 无菌操作器材实验步骤：1. 制备琼脂培养基，并在培养皿中倒入适量的培养基，待其凝固。
2. 将细菌培养物稀释至适当的浓度，然后均匀涂抹在琼脂平板上。
3. 使用打孔器在琼脂平板上打孔，孔的间距应保持一致。
4. 使用移液枪将不同浓度的抗生素溶液加入到孔中。
5. 将培养皿倒置，放入恒温培养箱中培养24-48小时。
6. 观察并记录抑菌圈的直径。
实验结果：实验结果显示，随着抗生素浓度的增加，抑菌圈的直径也相应增大。
这表明高浓度的抗生素具有更强的抗菌活性。
此外，不同种类的抗生素对同一细菌的抗菌效果也存在差异。
实验讨论：本实验结果与预期相符，说明琼脂扩散试验是一种有效的抗菌活性测定方法。
然而，实验中也存在一些局限性，例如抗生素的扩散速率可能受到琼脂厚度和孔间距的影响。
因此，在进行实验设计时，需要考虑这些因素以确保结果的准确性。
结论：通过本次琼脂扩散试验，我们成功地评估了不同浓度抗生素的抗菌活性，并观察到抑菌圈直径与抗生素浓度之间的正相关关系。
本实验为抗生素的筛选和抗菌效果评估提供了一种简单而有效的方法。
参考文献：[1] 张三. 微生物学实验技术[M]. 北京：科学出版社，2010.[2] 李四. 抗生素的抗菌活性测定方法[J]. 微生物学报，2015,55(3): 345-350.注：以上内容为示例文本，实际实验报告应根据实验结果和具体实验过程进行撰写。
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
琼脂打孔法抑菌圈试验
琼脂打孔法（琼脂打孔抑菌圈实验）一、试验原理利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。
试验通过抑菌圈大小以判断其是否具有抑菌能力。
本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。
二、试验器材、化学试剂及菌种培养皿、试管、5uL～50uL 微量移液器，100uL～1000uL微量移液器以及配套的枪头、10mL离心管、游标卡尺、涂布棒、麦氏比浊管、电动混合器、水浴锅、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、电热炉营养琼脂培养基、PBS缓冲液、无菌水、95%乙醇。
菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌三、试验步骤1、实验工器具准备及灭菌在锥形瓶中配置营养琼脂培养基，用电热炉加热煮沸至澄清状态，盖好塞子，同PBS 缓冲液、无菌水、配套枪头、涂布棒、离心管一同放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。
将培养皿用牛皮纸包好和试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。
实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。
2、倒培养皿将培养基及培养皿放置到60℃后开始倒培养皿，培养基使用前摇匀，每个培养皿倒15～20mL左右，倒好后水平静置至完全凝固。
3、菌悬液的制备从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加入5mL 的PBS缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。
吸取1mL 的菌液加入到4mL 的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀释，选择108CFU/mL左右的菌悬液或106CFU/mL左右的孢子悬浮液（对比0.5麦氏比浊管），将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第二支试管（即浓度约为106/CFU/mL左右的菌悬液或104CFU/mL左右的孢子悬浮液）进行试验。
4、试验菌的接种用移液枪吸取浓度为 106cfu/mL 试验菌悬液0.1mL ，将其接种到已经倒好的营养琼脂培养皿内，用涂布棒涂布均匀（注意涂布棒每次使用后在酒精灯下灭菌，涂布时动作轻不要刮破培养基），盖好培养皿。
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琼脂打孔法（琼脂打孔抑菌圈实验）
一、试验原理
利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。
试验通过抑菌圈大小以判断其是否具有抑菌能力。
本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。
二、试验器材、化学试剂及菌种
培养皿、试管、5uL～50uL 微量移液器，100uL～1000uL微量移液器以及配套的枪头、10mL离心管、游标卡尺、涂布棒、麦氏比浊管、电动混合器、水浴锅、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、电热炉营养琼脂培养基、PBS缓冲液、无菌水、95%乙醇。
菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌
三、试验步骤
1、实验工器具准备及灭菌
在锥形瓶中配置营养琼脂培养基，用电热炉加热煮沸至澄清状态，盖好塞子，同PBS 缓冲液、无菌水、配套枪头、涂布棒、离心管一同放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。
将培养皿用牛皮纸包好和试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。
实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。
2、倒培养皿
将培养基及培养皿放置到60℃后开始倒培养皿，培养基使用前摇匀，每个培养皿倒15～20mL左右，倒好后水平静置至完全凝固。
3、菌悬液的制备
从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加入5mL 的PBS缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。
吸取1mL 的菌液加入到4mL 的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀释，选择108CFU/mL左右的菌
悬液或106CFU/mL左右的孢子悬浮液（对比0.5麦氏比浊管），将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第二支试管（即浓度约为106/CFU/mL左右的菌悬液或104CFU/mL左右的孢子悬浮液）进行试验。
4、试验菌的接种
用移液枪吸取浓度为 106cfu/mL 试验菌悬液0.1mL ，将其接种到已经倒好的营养琼脂培养皿内，用涂布棒涂布均匀（注意涂布棒每次使用后在酒精灯下灭菌，涂布时动作轻不要刮破培养基），盖好培养皿。
5、抑菌剂的配置
用分析天平准确称量1g样品于灭菌后的15mL离心管内，加入10mL溶剂（无菌纯水、95%乙醇等），摇匀使溶解（根据情况可使用电动混合器摇匀或放入水浴锅中加热使溶解）。
溶解后吸取上清液对倍稀释样品，可根据情况决定稀释几次，一般稀释6～10次。
若样品是液体，可直接对倍稀释。
6、添加抑菌剂
6.1在培养皿上打三个孔，用10～100uL的枪头打孔，打完孔用无菌针头将琼脂孔中的培养基挑出（打孔时一次打孔，不能转动枪头，以防琼脂圈裂缝，影响药液扩散以致抑菌圈不均匀，每次无菌针头挑完后都要酒精灯烧一下灭菌）。
各孔中心之间相距 25mm以上，与培养皿的周缘相距 15mm 以上。
用微量移液器吸取抑菌剂20uL 到琼脂孔内（三个孔为一组），盖好培养皿。
6.2 用不加抑菌剂的培养皿、加入配抑菌剂时的溶剂做阳性对照，用未接种菌的培养皿做阴性对照。
7、培养培养皿并观察抑菌效果
于37℃生化培养箱中正置培养，培养16h～18h 观察结果。
用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录。
注：每个培养皿做一个浓度，测量抑菌圈时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌圈进行。
测量其直径应以抑菌圈外沿为界。
四、试验结果
各浓度抑菌剂抑菌圈直径（mm）
阳性对照结果：
阴性对照结果：
五、评价规定
1、抑菌作用的判断:
抑菌圈直径小于或等于 7mm 者，判为无抑菌作用。
抑菌圈直径大于 7mm 者，判为有抑菌作用。
大于7mm小于10mm判为钝敏；大于10mm小于20mm判为中敏；大于20mm为高敏。
2、3次重复试验均有抑菌作用结果者，判为合格。
3、注意事项
(1)接种用细菌悬液的浓度应符合要求。
浓度过低，接种菌量少，抑菌圈常因之增大; 浓度过高，接种量过多，抑菌圈则可减小。
(2)应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌圈的大小。
(3)培养时间不得超过 18h。
培养过久，部分细菌可恢复生长，抑菌圈变小。
(4)抑菌圈直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。
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