PEI转染试剂的Protocol教学提纲
质粒转染protocol
1. 细胞分盘：通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以1×105 至4×105 细胞/cm2 的密度平铺细胞于60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的30%）。
将细胞置于含5％
CO2 的37℃温箱中孵育8-24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。
转染前2 h 换
液（用4 ml 新鲜的完全培养基置换旧的培养基）。
注：为得到较高的转染效率，尽量使用指数生长的细胞，转染时细胞的密度不超过80％。
2. 制备磷酸钙－DNA 沉淀：以60 mm 组织培养皿用480 μl 反应总体积，6孔板培养皿用240ul反应体系。
在灭菌水中加入质粒DNA（总量1－3 μg 为佳），
3.再加入48ul的10*HBS，vortex 3s左右，再加入24ul的5*CaCl2，vortex 10s
,静置12min，将磷酸钙－DNA悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。
注：可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色，应尽快将其混匀，避免形成过大的颗粒，影响转染效率。
3．若转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含5％CO2 的37℃温箱孵育。
8 h 后吸去培养基与DNA 沉淀，加入5 ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放
置温箱孵育，16-40 h 观察其转染效率。
PEI转染技术
PEI法瞬时转染HEK-293F悬浮培养物细胞于37℃，150rpm下，CO2恒温箱中的振荡器平台上悬浮生长。
在进行转染之前，请保持5-7代的培养物，以确保稳定的生长模式。
HEK293悬浮细胞（Freestyle™293-F细胞，Life Technologies，目录号R790-07）于Freestyle™293表达培养基（Life Technologies，货号12338026）中培养。
细胞量应维持在4 x 105和3 x 106细胞/ml之间，体积不超过培养瓶总体积的20％。
最佳旋转速率由每种培养瓶类型和培养量确定。
Life Technologies的Freestyle™293-F细胞在更高的密度和体积下容易结块。
聚乙烯亚胺（PEI）（25 kDa线性PEI，Polysciences，Inc.，目录号23966）在含有25mM HEPES和150mM NaCl（pH 7.5）的缓冲液中以1 mg/ml的浓度制备成母液。
PEI添加到缓冲液，并涡旋振荡，直至完全溶解（这可能需要花费数分钟的涡旋时间）。
一旦完全溶解的PEI可以使用0.22 µM注射器过滤器进行无菌过滤，分装后在-20℃冷冻直至需要。
为了获得最佳的转染效率，细胞在转染时应具有> 95％的活力。
转染前24小时，使细胞分裂增殖至约1 x 106细胞/ml的密度，并在37°C CO2培养箱中振荡过夜。
转染时细胞密度应为约2 x 106细胞/ml。
转染应以2.5 x 106至3.0 x 106细胞/ml的细胞密度进行。
使用血球计数器对细胞计数，并调低足够的体积，以2.5 x 106细胞/ml的密度将细胞重悬在新鲜的293F Freestyle Media中，并以所需的体积进行转染。
转染前将细胞重悬于新鲜培养基至关重要。
条件培养基含有抑制转染的代谢产物。
细胞应在室温下以1200 rpm旋转10分钟。
转染24小时后，将转染产物以1：1稀释，即转染的初始体积是所需最终体积的一半。
liofectamine说明书
6.加入DNA-脂质体复合物至细胞中。
7.37℃孵育细胞2-4天。然后分析转染，遵循如上所述的DNA实验方案，但在稀释siRNA时不要
加入P3000?试剂(第3步)。
细胞培养容器
96-well
24-well
6-well
贴壁细胞
1–4×104
0.5–2×105
0.25–1×106
Opti-MEM培养基稀释Lipofectamine?3000试剂（2管）
Opti-MEM培养基
5μL×2
25μL×2
125μL×2
Lipofectamine?3000
0.15和0.3μL
0.75和1.5μL
3.75和7.5μL
Opti-MEM培养基稀释DNA，制备DNA预混液，然后添加P3000?试剂，充分混匀
5μL
25μL
125μL
室温孵育5分钟
加入DNA-脂质体复合物至细胞中
96-well
24-well
6-well
DNA-脂质体复合物
10μL
50μL
250μL
37°C孵育细胞2–4天。然后分析转染细胞。
表1：使用lipofectamine?3000转染DNA产品参考用量
Opti-MEM培养基
10μL
50μL
250μL
DNA(0.5–5μg/μL)
0.2μg
1μg
5μg
P3000?试剂(2μL/μgDNA)
0.4μL
2μL
10μL
Lipofectamine?3000试剂中加入稀释的DNA(1:1比例)
稀释的DNA
5μL
25μL
125μL
各种转染试剂的中文转染方法
各种转染试剂的中文转染方法FuGENE6（Roche）转染步骤：转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。
将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。
将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。
使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。
1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100 ul。
2. 将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。
3. 加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。
4. 室温孵育20分钟。
5. 将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。
6. 将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。
7. 3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。
Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）：1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。
细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2. 对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。
3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。
Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。
NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。
4. 混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。
室温放置20分钟。
5. （optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。
lipofectamine3000说明方案
0.2 μｇ 0.4 μＬ
5μＬ 5μＬ
室温孵育 5 分钟
加入 DNA- 脂质体复合物
96-well
至细胞中
DNA- 脂质体复合物
10 μＬ
50 μＬ 1μｇ 2μＬ
25μＬ 25 μＬ
24-well
50 μＬ
250 μＬ 5μｇ 10 μＬ
125μＬ 125 μＬ
6-well
250μ L
mine?300 0 转染 DNA 产 品参考 用量
37°C 孵育细胞 2–4 天。然后分析转染细胞。
转染 siRNA 至细胞中时，遵循如上所述的 DNA 实验方案，但在稀释 siRNA 时不要
加入 P3000?试剂 (第 3 步)。
细胞培养容器 贴壁细胞
Opti-MEM 培 养 基 稀 释 Lipofectamine ?3000 试 剂 （ 2 管）
Opti-MEM 培养基 Lipofectamine ?3000
10 μＬ
DNA ，制备 DNA 预混液， 然后添加 P3000?试剂，充 分混匀 Lipofectamine ?3000 试 剂 中加入稀释的 DNA(1:1 比例 )
DNA(0.5 – 5μ g/ μ L)
P3000?
试
剂
(2 μ L/ μ gDNA)
稀释的 DNA
稀
释
的
Lipofectamine?3000
96-well
24-well
6-well
表 1：使
1–4×104 5μ L×２
0.5–2×105 25μ L×２
0.25–1×106
用
125 μ L×２
0.15 和 0.3 μＬ 0.75 和 1.5 μＬ 3.75 和 7.5 μＬ lipofecta
PEI转染细胞方法的标准操作规程
PEI转染细胞方法的标准操作规程（编号：031）1、目的及适用范围该SOP用来规范利用PEI为转染试剂进行转染的操作。
2、主要仪器细胞培养箱、细胞培养皿、微量移液器3、试剂及配制方法3.1 PEI (2μg/μL)：采用生理盐水配成2μg/μL，60℃烘箱助溶，完全溶解并冷却后，调pH至7.0（不可回调），0.22μm微孔滤器过滤，分装于1.5mL离心管，储存与4℃备用。
3.2生理盐水：0.9g NaCl溶于100mL纯水中，灭菌后微孔滤器过滤分装于1.5mL离心管，储存于4℃备用。
4、操作步骤4.1 细胞铺于细胞培养皿中，培养过夜；4.2 在转染前1-2h，将细胞培养皿中换成预热的培养基；4.3 将要转染的质粒和转染试剂PEI分别用生理盐水稀释，室温处理5min。
质粒和转染试剂的质量比为1:6；一般质粒和PEI稀释后的每管体积为50μL，如转染的质粒量多，则可对应适当增加生理盐水的量；4.4 将处理好的两者混匀，室温放置15-30 min；4.5 将处理好的样品轻轻且均匀滴加到细胞中；4.6 转染后6-8 h换液；4.7 根据实验需要，在转染后的特定时间收集样品，进行分析。
5、注意事项5.1 细胞如何健康而茁壮成长转染前细胞最好经过1～2次传代，以保证细胞生长旺盛，容易转染。
注意，贴壁细胞生长到几乎汇片时就要赶快进行下一次传代，千万不要使细胞保持融合超过24h，一旦长满了，转染效率便会降低。
大多数已建立的细胞系都是非整倍体，细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化，这会导致和转染相关的细胞行为的变化。
如果随时间发生61。
ESCORT V 转染剂说明书
ESCORT™V Transfection ReagentCatalog Number E9778Storage Temperature 2-8 °CTECHNICAL BULLETINProduct DescriptionESCORT V Transfection Reagent was developed for highly efficient stable and transient transfections of eukaryotic cells. It is a specially processed polyethyleneimine (PEI) optimized for use in serum-containing media. Transfection in serum-free media has been demonstrated, and Escort V can also be used for transfection experiments with siRNA.The reagent has been extensively tested and found to be highly efficient in many cell types including CHO, BHK, HeLa, HEK293, HEK-293T, Vero, F9, PC12, COS-1, COS-7, NIH 3T3, L929, Human Foreskin Fibroblasts (HFF) primary cells, and Bovine Aorta Endothelial cells (BAEC).ReagentsESCORT V Transfection Reagent,Catalog Number E0654 1.5 ml ESCORT V Transfection Buffer,Catalog Number E0529100 ml ESCORT V Transfection Reagent is provided at a concentration of 1.3 mg/mL. The reagent is sufficient for 700-1000 transfection experiments in 24-well plates.Precautions and DisclaimerThese products are for R&D use only, not for drug, household, or other uses. Please consult the Material Safety Data Sheet for information regarding hazards and safe handling practices.Storage/StabilityStore at 2-8 °C.PROCEDUREThis protocol is optimized for use in 24-well plates. All volumes given are for a single reaction (single well) on a 24-well plate. If another format is desired, scale up or down accordingly (Please see Table I). Cell PreparationAdherent cells1.18-24 hours before transfection, seed the plate with5-7.5 x 104 cells/well in 0.5 ml of the appropriatemedium.2.30 minutes to 2 hours before adding thetransfection cocktail to the wells, replace the growth media in the wells with 0.5ml fresh mediacontaining serum (complete media).Cells in suspension1.Before transfection, pellet the cells and dilute to theappropriate concentration (0.5-1X106cells/ml) inthe standard growth medium for the cell line.2.Add 0.5 ml of the cell suspension to each well. Transfection with plasmid DNA in 24-well plateFor optimal transfection, the recommended ratio ofµg DNA/µL ESCORT V Transfection Reagent is 1:3.In some cases, transfection efficiency can be increased by using a different ratio. When changing the amount of ESCORT V Transfection Reagent (step 2), keep the amount of Transfection Buffer constant at 60 µL.1.In a sterile tube, combine 60 µl of ESCORT VTransfection Buffer and 0.7 µg of plasmid DNA.Mix the contents of the tube gently.2.In a separate tube, combine 60 µl of ESCORT VTransfection Buffer and 2.1 µl of Escort VTransfection Reagent. Mix gently.bine the DNA/buffer solution, Step 1, with theESCORT V reagent/buffer solution, Step 2, to make the transfection cocktail. Mix gently.4.Incubate at room temperature for15-20 minutes.The complex is stable for up to 2 hours at roomtemperature.5.Add the total volume of transfection cocktail directlyto the wells. Mix gently by rocking the plate.6.Incubate the transfected cells under standardconditions for 24-72 hours.2Stable Transfection1.Perform cell transfection using the appropriatevector. Follow the protocol above.2.Two days after transfection, replace the media withfresh media containing the appropriate selectionantibiotic.3.Maintain the cells in selective media for 2-3 weeksuntil stably transfected cells are clearly identified. Transfection with siRNA in a 6-well plateThis protocol is optimized for cells plated in a 6-well plate. Volumes indicated in the protocol are for one reaction (one well).1.Prepare 10 nmol siRNA stock solution (dilute withRNAse-free water).2.In a sterile tube, add 60 µL of ESCORT VTransfection Buffer and 9 µL of ESCORT VTransfection Reagent.3.Mix the contents of the tube gently and incubate for5 minutes at room temperature.4.In a second sterile tube, add 60 µL of serum-freemedium and 10 µL of10 nmol siRNA solution.bine the contents of both tubes and gently mix.6.Incubate for 15-20 minutes at room temperature toform the transfection complex.7.During incubation, remove culture media from thewells and add 0.8 ml of complete culture media(media with serum) to each well.8.Carefully add the transfection mix drop-wise to thecells in the well.9.Swirl the plate gently to ensure uniform distributionof the transfection complex.10.Incubate the cells at 37 °C in 5% CO2for 24-72hours before analysis.11.Change the media as required.Transfection with siRNA in a 96-well plateThis protocol is optimized for a 96-well plate. Volumes indicated in the protocol are for one reaction (one well).1.Prepare 100 pmol siRNA stock solution (dilute withRNAse-free water).2.In a sterile tube, add 25 µL of ESCORT VTransfection Buffer and 0.6 µL of ESCORT VTransfection Reagent.3.Mix the contents of the tube gently and incubate for5 minutes at room temperature. 4.In a second sterile tube, add 25 µL of serum-freemedia and 10 µL of the 100 pmol siRNA solution. bine the contents of both tubes and mixcarefully.6.Incubate for 10-15 minutes at room temperature toform the transfection complex.7.During incubation, remove the culture media fromthe wells and add 100 µL of complete culture media (media with serum) to each well.8.Carefully add the transfection mix drop-wise ontothe cells in the well.9.Swirl the plate gently to ensure uniform distributionof the transfection complex.10.Incubate the cells at 37 °C in 5% CO2for 24-72hours before expression analysis.11.Change the media as required.OPTIMIZING TRANSFECTIONFor some cell lines, ESCORT V Transfection Reagent may require optimization. When optimizing conditions, it is important to consider the following optimization factors:Volume of Transfection CocktailIn some cases, a different volume of the transfection mixture may increase transfection rates. For optimization, compare transfection performance when different volumes of transfection mixture are added to the wells (e.g., 75, 100, 120, and 150 µL/well).The Ratio of DNA/ESCORT VThe recommended ratio of µg DNA/ µl ESCORT V Transfection Reagent is 1:3. This ratio produces good results for most cell lines. In some cases, transfection efficiency can be increased by changing the ratio (e.g., 1:2 or 1:4).MediaIt is recommended to change growth media up to 2 hours before transfection. Use complete media (media supplemented with serum). If desired, media containing the transfection mixture can be substituted 4-6 hours after the initial addition without loss of transfection activity.Transfection without ESCORT V Transfection BufferIf use of the ESCORT V Transfection Buffer is not desired, prepare the transfection mixture in any standard media without serum and antibiotics. Follow the same volumes as in transfection protocol.3Cell DensityThe optimal number of cells to be plated depends on the specific cell line. A 40%-70% confluent cell layer at the time of transfection is suggested for best response. When required, cells can be transfected at very low cell densities such as 5-15% confluence.Incubation Time Post-TransfectionIncubation time depends on the cell line, the protein being expressed, as well as the vector construct.DNA QualityDNA quality is a critical factor for successful transfection. OD260/280should be ~1.8 or greater (1.85 is recommended). DNA should be free of endotoxin and other contaminants. RNA contamination does not prevent transfection; however, RNA substitutes DNA in the complex and may lead to an incorrect DNA concentration estimation. Taken together, these factors may greatly reduce transfection efficiency.DNA VectorThe expression of the transfected gene depends on the cell line, the promoter used, and the nature of the expressed protein.Condition of the CellsCells should be healthy, free of contamination, proliferating well and plated at an appropriate density. The Level of the Expressed GeneHigh level of expression of some proteins can be cytotoxic.Table I Scaling up/down4Troubleshooting GuideESCORT is a trademark of Sigma-Aldrich Biotechnology LPKH,PHC 03/07-1Sigma brand products are sold through Sigma-Aldrich, Inc.Sigma-Aldrich, Inc. warrants that its products conform to the information contained in this and other Sigma-Aldrich publications.Purchaser must determine the suitability of the product(s) for their particular use. Additional terms and conditions may apply.Please see reverse side of the invoice or packing slip.。
[说明]转染详细步骤大攻略
![[说明]转染详细步骤大攻略](https://img.taocdn.com/s3/m/8d4c02e6bb68a98270fefa98.png)
[说明]转染详细步骤大攻略转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。
将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。
具体操作步骤如下: 1)质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下:(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
(注:如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低)(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
(注:混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏)(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
(注:溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清)(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min至溶液变清亮。
(6)37?水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。
12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。
(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。
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50
12孔板
3.5
1.6
100
6孔板
9.6
4
250
6cm平板
21.5
8
500
10cm平板
56.7
16
1000
15cm平板
147
32
2000
4.将B液缓慢加到A液中并混匀，最好使用旋涡振荡器边加边震荡。然后室温放置20min。
5.将DNA-PEI混合液缓慢加入到细胞培养基中，轻轻混匀。
6.转染4h后更换为完全培养基。
培养皿面积(cm2)
转染DNA量（ug）
稀释DNA/PEI的培养基体积（ul）
96孔板
0.32
0.2
25
48孔板
1.1
0.5
PEI转染试剂的Protocol
PEI转染Protocol
1.转染前一天（24h左右）胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染时汇合度为70~90%。
2.转染前1h，将细胞培养基更换为Opti-MEM或者DMEM基础培养基（若使用Opti-MEM，PEI转染效果更佳）。
3.用一定体积的Opti-MEM稀释质粒，小心混匀，记为A液；用相等体积的Opti-MEM稀释PEI，小心混匀，记为B液（质粒：PEI=1：2，W/W)，室温静止5min。