尿激酶的制取和检验
尿激酶的提取方法
尿激酶的提取方法
一、离心取中清液
1. 将兔尿细胞悬液（10~20 ml）放入彻底消毒过的离心管内，滴加
2~3滴凝胶，用转速为3000 rpm的离心机离心5分钟；
2. 将上侧浮渣滤出，取得离心液（黄褐色），即为尿激酶中清液。
二、分离尿激酶
1. 将中清液用温度调整到4℃以下的冷冻状态；
2. 将中清液放入分离器，在每毫升冷冻中清液中添加1~2毫克聚乙二醇，充分搅拌均匀，调节pH为7~7.5；
3. 将此液体加入温度为4℃以下的卡瓦离心机中，20~30分钟离心，使得尿激酶从溶液中析出；
4. 将离心液倒入锥形管中，放入冰水中静置10分钟，以使上层的尿激酶析凝在离心管的表面，上层的漂浮液滤去，得到析凝的尿激酶。
尿激酶生产流程
尿激酶生产流程尿激酶是一种重要的生物活性物质，在医药领域中具有重要的应用价值。
其主要用途是治疗血栓病，因此其生产流程对于医药工业的发展具有重要的意义。
下面将从尿激酶的特点、生产流程、检测质量等方面详细介绍。
尿激酶具有独特的生物活性，可溶于水，酸、碱和氯化钠等物质对其稳定性无影响。
其生产过程主要包括细胞培养、提取和纯化三个步骤。
细胞培养是尿激酶生产的第一步，其主要通过选择发酵菌种，进行纯化和扩增，使其能够产生尿激酶。
一般来说，尿激酶的生产菌种是大肠杆菌、酿酒酵母等。
在细胞培养过程中，首先需要进行菌种的预处理，包括接种前的准备、接种、增殖和保持等，然后进行生物反应器的制备，在不同的条件下培养，控制温度、酸碱度、通气、营养等因素，以获得较高产量的尿激酶。
提取是尿激酶生产的第二步，其主要步骤是通过破碎、裂解细胞壁等手段，将尿激酶从培养菌中提取出来。
具体来说，可以采用三步法提取，即初步分离、分级分离和合并等。
初步分离主要是通过低渗、离心、过滤等手段，去除杂质，分离出目标产物。
然后进行分级分离，通过离子交换、凝胶过滤等方法进一步提取纯化。
最后是合并等步骤，适量地混合不同的纯化产物，构成最终的成品，即尿激酶。
纯化是尿激酶生产的第三步，其目的是使产物纯度达到一定要求，满足药品制造的质量要求。
常用的纯化技术包括离子交换、凝胶过滤、亲合层析、逆流层析、柱层析等。
在纯化过程中，需要根据产物的物理化学特性，选用适当的纯化方法。
然后，根据进一步的检测质量要求，对纯化产物进行混合、溶解、浓缩、干燥等处理，以得到良好的尿激酶成品。
在尿激酶生产过程中，需要对每个步骤进行严格的质量控制，包括原料的质量、生产工艺的控制、生产环境的卫生控制、检测分析的质量控制等。
对于尿激酶的质量检测，常用的方法包括凝血时间测定法、色谱法、电泳法等。
其中，凝血时间测定法是最常用的方法，通过体外血凝作用反映尿激酶的生物活性和药效。
总之，尿激酶的生产过程是一个复杂的过程，需要严格的质量控制，以保证产品的质量和稳定性。
尿激酶可行性分析报告
尿激酶可行性分析报告一、背景介绍尿激酶是一种关键的生物标志物，与多种疾病的发生、发展和预后密切相关。
因此，对尿激酶进行可行性分析有着重要的临床价值。
本报告旨在通过对尿激酶的可行性进行分析，为临床应用提供科学依据。
二、研究方法1. 样本采集从健康志愿者中随机选择100名参与研究，采集其新鲜尿液样本。
严格控制样本采集的时间和方法，确保样本的准确性和可靠性。
2. 实验步骤将尿液样本离心，收集上清液，使用蛋白酶抑制剂对其进行处理，以消除蛋白酶对尿激酶的降解作用。
然后，使用尿激酶检测试剂盒进行检测，按照说明书上的方法进行操作。
最后，使用检测仪器测定吸光度，并计算尿激酶的浓度。
3. 数据分析收集检测结果数据，并进行统计学分析。
计算尿激酶的平均值、标准差、置信区间等指标，评估尿激酶检测的可行性。
三、结果与讨论1. 尿激酶检测结果分析通过对样本进行检测，得到了尿激酶的浓度数据。
根据统计学分析，得出平均尿激酶浓度为X，标准差为X，置信区间为X。
这说明尿激酶的平均浓度在该范围内具有一定的可行性。
此外，还发现尿激酶浓度与年龄、性别等因素存在一定相关性，可以作为进一步研究的方向。
2. 结果讨论尿激酶检测的可行性受到多种因素的影响，包括样本采集方法、处理过程、检测方法等。
在本研究中，我们采用了先进的技术手段，严格控制实验条件，保证了数据的准确性和可靠性。
然而，仍然需要进一步的研究来验证尿激酶检测的可行性，并探索其临床应用的潜力。
四、结论通过对尿激酶的可行性进行分析，我们得出了以下结论：1. 尿激酶的检测具有一定的可行性，可以作为疾病诊断和预后评估的一种指标。
2. 尿激酶的浓度与年龄、性别等因素相关，需要进一步研究来探讨其机制和临床应用的意义。
3. 尿激酶检测的技术手段和方法还需进一步改进和完善，以提高其准确性和可靠性。
在未来的研究中，我们将进一步探索尿激酶的生物学功能和临床应用价值，以期为疾病的诊断和治疗提供更加可靠的依据。
尿激酶的亲和层析分离研究
华南理工大学硕士学位论文尿激酶的亲和层析分离研究姓名：叶峰申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：阮复昌20040301摘要摘要尿激酶（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）是体内纤溶酶原激活剂。
自从在尿液中发现尿激酶以来，人们对它的研究也日益深入和全面。
尿激酶参与纤溶过程，因而常用作治疗脑血栓、急性心肌梗塞和静脉栓塞等疾病。
尿激酶是一种糖蛋白，属丝氨酸蛋白酶类，等电点在８．４～９．７之间。
尿激酶的活性检测方法主要有直接法与间接法，采用间接法较为快捷，如荧光分光光度法和可见光分光光度法是使用较广泛的测定方法。
高纯度的药用尿激酶价格昂贵。
通常是从成年健康男性尿液中提取，制得粗酶后早期采用沉淀和传统层析相结合的多步分离法，后来发展用亲和层析纯化尿激酶。
本文采用Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ为基质，对氨基苯甲脒（Ｐ—ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ，ｐ－ＡＢＺ）年［Ｉ肌酸为亲和配基，制备亲和层析柱分离尿激酶。
在前人的研究工作基础上，本文选择对氨基苯甲脒层析柱在最优的条件下分离尿激酶：合成配基密度４８１．ｔｍｏｌ・ｇ。
１的亲和载体，最大吸附量达２．１７×１０５Ｉｕｇ。
载体以上；选择ｐＨ７．５含Ｏ．５ｍｏｌ・Ｌ。
ＮａＣＩ的０．０５ｍｏｌ・Ｌ‘１Ｎａ２ＨＰ０４～ＮａＨ２Ｐ０４缓冲液为吸附条件，选择ｐＨ４．０含０．５ｍｏｌ・Ｌ‘１ＮａＣｌ的０．１ｍ０１．Ｌ～ＮａＡｃ～ＨＡｃ缓冲液洗脱条件：将尿激酶粗酶纯化５０．２倍，活性回收率为７９％。
首次将肌酸应用于分离尿激酶，并取得较好的效果：合成配基为５３１．ｔｍｏｌ・ｇ。
的亲和载体，最大吸附量为１．２８×１０５ＩＵ・ｇ。
载体；选择ｐＨ４．５含０．５ｍｏｌ－Ｌ１ＮａＣｌ，０．１ｔ００１．Ｌ～ＡＩＣｌ，的０．１ｍ０１．Ｌ～ＮａＡｃ—ＨＡｃ缓冲液为吸附条件，选择ｐＨ７．０含０．５ｍ０１．Ｌ。
１ＮａＣｌ的Ｏ．０５ｍ０１．Ｌ～Ｎａ２ＨＰ０４～ＮａＨ２Ｐ０４缓冲液为最终洗脱条件；将尿激酶粗酶纯化６３．７倍，活性回收率为８ｌ％。
尿液提取尿激酶
尿激酶的生产工艺及废水处理
尿激酶的生产工艺及废水处理
尿激酶（Urokinase）是一种酶类药物，常用于溶解血栓和治疗心血管疾病。
下面是关于尿激酶的生产工艺和废水处理的一般概述：
1. 尿激酶的生产工艺：
a. 培养基准备：选择适合尿激酶生产的培养基，添加适量的碳源、氮源、矿物质等。
b. 发酵过程：将适量的发酵菌株接种到培养基中，进行发酵过程。
控制合适的温度、pH值、氧气供应等条件，促进尿激酶的生长和产量。
c. 细胞收获：在发酵结束后，通过离心等方法将菌体和培养液分离。
d. 提取与纯化：采用多步酶解、沉淀、过滤、层析等技术，将尿激酶从细胞中提取出来，并进行纯化。
2. 废水处理：
a. 生产过程中产生的废水可能含有有机物、无机盐和微生物等成分，需要进行处理以符合环保要求。
b. 废水处理工艺可以包括初级处理、生物处理和深度处理等步骤。
c. 初级处理：通过物理方法如沉淀、过滤等，去除废水中的悬浮物和固体颗粒。
d. 生物处理：利用生物菌群对废水中的有机物进行降解和转化，常采用活性污泥法、生物膜法等。
e. 深度处理：根据废水成分的具体情况，可以采用化学沉淀、吸附、氧化等
方法进一步处理废水，以达到排放标准。
请注意，具体的生产工艺和废水处理方式可能因不同的生产厂家和地区而有所不同。
在实际生产中，需要根据情况进行工艺优化和环保要求的符合。
论文尿激酶
尿激酶的制备与研究进展摘要：尿激酶是纤溶酶原的主要激活物之一。
近年来的研究工作发现, 尿激酶在临床上发挥了重要作用，现在已经大量应用于治疗新鲜血栓性闭塞性疾病、肺栓塞、急性脑血栓形成、脑血管栓塞以及视网膜中央静脉血栓形成。
本文对尿激酶的结构、作用机制及其制备等做了简要介绍。
关键词：尿激酶纤溶酶原分子组成制备Preparation, Rsearch and Delopment of Urokinase Abstract:Urokinase is one of the major activitor of plasminogen . Recent research found t-hat urokinase plays a very important role in a variety of other physiological and pathological proc- ess in recent research,including wound healing,tissue regeneration,cell migration,and especially i- ncluding cancer metastasis , angiogenesis and other physical and pathological process. The struct- ure of urokinase and its preparation are introducted in detail in this article.Keywords: urokinase plasminogen molecule structure preparation1.前言尿激酶型纤溶酶原激活物（简称尿激酶：urokinase 简写UK，)最初是从新鲜男性尿中提取[1]，以后又在血浆、脑水、精液以及肾细胞、血管内皮细胞、单核细胞、纤维母细胞、某些肿瘤细胞的培养液中发现[2-3]。
尿激酶
尿激酶生产工艺：1、收集尿液过程，一般选用男性尿作原料，尿液最好保存在10℃以下尽快处理。
迅速降温，用5N的NaOH调尿液PH值为9，静置1小时，虹吸上清液，丢弃灰白色的沉淀。
2、吸附尿激酶过程，将虹吸的上清液用5N盐酸（HCl）调PH至5.8-6，加1%树脂，搅拌吸附1小时，停止搅拌，树脂自然下沉，虹吸，去掉残留尿液，收集树脂。
3、水洗和洗净过程，把收集的树脂用自来水洗三遍，然后用无离子水再洗三遍，至尿液无色为止，以0.1M PH6.4 磷酸钠缓冲液（10%体积）搅拌洗净30分，虹吸，去掉上清液。
4、洗脱过程，第一次洗脱，用2% NH4OH和1M NaCl洗脱液，按3.5%体积搅拌洗脱1小时，第二次洗脱，用同样洗脱液同样体积洗脱30分，抽滤收集洗脱液，合并两次洗脱液，量出体积。
5、硫铵沉淀过程，按洗脱液体积加入固体硫铵，当其达到0.6饱和度时，用5N 盐酸（HCl）调成PH 3，于0-2℃下沉淀6~7小时，以纸浆过滤收集棕色的尿激酶沉淀，抽干后于低温冰柜火冰箱冰室保存。
6、树脂再生过程，用2N盐酸（HCl）搅拌洗涤1小时，洗至中性，然后用2N的NaOH搅拌洗涤1小时，洗至中性，最后用2N盐酸搅拌洗涤1小时，洗至中性。
来源：从健康人尿中分离的，或从人肾组织培养中获得的一种酶蛋白。
作用：直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统能催化裂解纤溶酶原成纤溶酶，后者不仅能降解纤维蛋白凝块，亦能降解血循环中的纤维蛋白原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ等，从而发挥溶栓作用。
该品对新形成的血栓起效快、效果好。
该品还能提高血管ADP酶活性、抑制ADP诱导的血小板聚集、预防血栓形成。
行业应用：主要是在医疗上的应用1.脑血管疾病2.急性静脉血栓形成3.急性动脉栓塞取栓术时4.急性心肌梗死5.眼科应用。
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尿激酶的制取和检验
摘要：尿激酶是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶,是一种碱性蛋白,等电点在PH 8.7左右。
目前我国主要从男性尿液中提取尿激酶有三种方法:浸泡法、沉淀法、吸附法。
生产上多采用吸附法,根据选用吸附剂的类型又分为树脂吸附和硅藻土吸附两种工艺。
成品尿激酶为无色（或米色）澄清或白色冻干粉末，每毫克蛋白的活力不得低于120000IU。
关键词：尿激酶；性质；工艺；检验方法；质量标准；
正文：
尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物。
它能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶, 纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽,从而使血栓溶解。
因此, 临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。
尿激酶与抗癌剂合用时, 由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白,使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞, 从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力。
所以,尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂,而且它是无抗原性问题,可长时间使用。
一、产品性质
尿激酶是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶,是一种碱性蛋白,等电点在PH8.7左右。
为白色非结晶状粉末,易溶于水。
稀溶液性状不稳定,必须新鲜配用,且不得用酸性溶液稀释。
冻干状态可稳定数年。
尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶。
对合成底物的活性与胰蛋白酶和纤溶酶近似,也有酯酶的活力。
无抗原性，不使体内产生抗体。
体内半衰期为(14±6)min。
尿激酶主要有高分子尿激酶(H-UK),分子量为54000和低分子尿激酶(L- UK),分子量为34000两种,前者为天然存在形式,后者为H-UK的降解产物。
这两种UK 均有生物活性,但从体外进行的酶动力学试验和临床表明,H-UK比L-UK更有效,因此临床使用上均要求以它为主的产品。
二、尿激酶制法
自20世纪70年代以来,尿激酶的制取方兴未艾,精制方法多有报道,但回收率偏低。
我国人口众多,尿源十分丰富,因此以尿为提取尿激酶的原料,比较适合我国国情。
由于尿激酶在尿中含量很低,从尿中提取尿激酶的关键是选择恰当的吸附剂。
目前我国主要从男性尿液中提取尿激酶有三种方法:浸泡法、沉淀法、吸附法。
生产上多采用吸附法,根据选用吸附剂的类型又分为树脂吸附和硅藻土吸附两种工艺。
2.1主要仪器及试剂:
752紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂生产);Sephadex G-50,CM- Sephadex C-50,Bio-GelP-30(Pharmacia);人纤维蛋白原(上海生物制品研究所生产)；尿激酶标准品,凝血酶,纤维酶原(中国药品生物制品检定所生产)；其他
试剂均为国产分析纯或化学纯。
2.2 UK粗品制备:
吸附:用搪瓷缸收集新鲜男性尿,在搅拌下加尿量0.12%(W/V)HD-2树脂,搅拌吸附50min。
用尼龙布过滤,弃去尿液,收集树脂装柱；
洗脱:将树脂用少量水洗涤后用0.1%氨水(电导率为22.5mΩ)洗脱,收集洗脱液，回收树脂；
盐析:将洗脱液移入搪瓷桶中,在搅拌下加入固体硫酸铵粉末至0.65饱和度,待全部溶解后,在0℃放置6~8h,然后过滤,收集盐析物,即得到粗品。
Sephadex G-50凝胶过滤除盐:将UK粗品用预冷至0~5℃的无热原蒸馏水溶解,制成UK含量为(2~3)×104IU/mL的UK水溶液,立即用冷冻离心机分离,收集上清液,用2mol/L盐酸或2mol/L氢氧化钠溶液调pH6.5。
将此溶液上Sphadex G-50凝胶柱(此柱预先用pH6.5,0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡),上样体积控制在柱床体积的15%~25%,收集流出液中含UK部分。
GM-Sephadex C- 50离子交换层析:将上述收集到的UK溶上GM-Sephadex C- 50离子交换层析柱(此柱预先用PH6.5,0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡),加一个床体积的柱平衡液洗涤后,用0.6mol/L的氯化钠溶液洗脱,收集UK活力部分。
硫酸铵沉淀:在上一工序收集的UK溶液中缓缓加入固体硫酸铵(每升溶液加430克),边加边搅拌,直至加入的硫酸铵溶解,随即用冷冻离心机分离,收集UK沉淀物。
Bio-Gel P-30凝胶过滤:将UK沉淀物用0~5℃的无热原蒸馏水溶解,制成UK 含量为(5~10)×10-4IU/mL的溶液,上Bio-Gel P-30凝胶柱(此柱预先用0.3mol/L的氯化钠溶液平衡),上样量控制在柱床体积的8%~12%,随时监测流出液的UK活力,收集第一个流出峰部分,即H-UK部分。
产品的除菌及冷冻干燥:将上工序收集的H-UK溶液添加1%~5%的甘露醇做赋形剂(加量多少依产品效价要求和冷冻干燥情况而定),用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后,立即进行冷冻干燥,冷冻干燥后的UK为粉状产品,密封于容器内置0~5℃下保存。
三、尿激酶检验
3．1生物学活性测定
采用溶圈法。
称取125mg琼脂糖,加入23ml生理盐水,煮沸溶解,60℃水浴平衡,加凝血酶14μl(100IU/ml),纤溶酶原280μl(0.5mg/ml),边加边摇匀,加入人纤维蛋白原2.2ml(6mg/ml),摇匀,混浊后马上倒平板(直径9cm),水平放置,充分凝固后,4℃冰箱放置至少0.5h待用(应在2d内使用)。
将尿激酶标准品用生理盐水稀释至200、100、50、25和12.5IU/ml待测样品用生理盐水稀释至约
50IU/ml(成品)或5μg/ml(原液)。
在制备好的纤维蛋白平板内打孔(直径2mm),每孔点样6μl每个样品2孔,放置37℃湿盒中16h后,纵横两次量取点样板溶圈直径,以标准品各个稀释度活性的对数为横坐标(x),溶圈直径的平均数(4次量取的数值)的对数为纵坐标(y),采用生物统计软件分析结果。
利用统计学软件中的回归分析方法作标准曲线,并求得y=a+bx中的a和b及线性回归系数r值,根据样品的溶圈直径,计算样品活性。
3．2单链比例测定
采用发色底物法。
将Thermolysin用pH7.5、0.1mol/L NaCl，0.01% Tween-20，0.01mol/L氯化钙，0.05mol/L Tris缓冲液稀释成3.0mg/L；S-2444用pH7.5、0.1mol/L NaCl，0.01% Tween-20,0.05 mol/L，Tris缓冲液稀释成1.5mg/ml；尿激酶标准品用pH 7.5、0.1mol/L NaCl；0.01% Tween-20,0.05 mol/L，Tris 缓冲液稀释成100、80、60、40和20IU/ml；u-PA样品用pH7.5、0.1mol/LNaCl，0.01% Tween-20,0.01mol/L氯化钙,0.05mol/L Tris缓冲液稀释成40 IU/ml。
3.3样品总活性的测定:
在96孔酶标板上,分别加入稀释样品100μl Thermolysin 20μl，37℃孵育 1 h,在激活的样品中加入Aprotinin(5×105IU/ml)20μl和S-2444(1.5mg/ml)60μl 37℃孵育,1.5h内每间隔20min,在405 nm处测定A值。
以反应时间为横坐标,A值为纵坐标,分别作各浓度UK标准品溶液和待检品的生色速率曲线,线性回归得出线性方程,得到不同浓度标准品和待检品直线方程的斜率。
以各浓度UK标准品溶液的斜率为纵坐标,UK活性的浓度为横坐标作图,得到用显色底物测定UK浓度的标准曲线,线性回归得到标准方程。
将待检品的生色速率直线的斜率代入标准方程中,可计算出待检品的活性,再乘以稀释倍数,即可得到待测样品的总活性。
3.4样品双链活性的测定:
在96孔酶标板中加入含tcu-PA (40 IU/ml)的稀释样品100μl，pH 7.5 Tris 缓冲液20μl，Aprotinin(5×105IU/ml)20μl和S-2444(1.5mg/ml)60μl 37℃孵育,在1.5 h内每间隔20min,于405nm处测定A值。
同4.1法计算出待测样品中双链活性。
3.5单链比例的计算:
总活性与双链活性之差即为单链的活性。
单链的活性与样品的总活性之比即为单链在样品中的比例。
3.6纯度分析
采用SECOHPLC法,参照《中国药典》三部(2005版)进行。
洗脱液: pH 7.0,0.1mol/L PB,400 mmol/L NaCl,色谱条件:流速0.9 ml/min;上样量10μl(2.0mg/ml),柱温25℃,检测波长280 nm,样品池温度8℃。
用WATERS 2690HPLC 系统对实验结果进行数据处理,用面积归一化法算出其纯度。
3.7相对分子质量测定
采用还原型SDSOPAGE法。
3.8其他指标的检测
等电点、肽图、蛋白质含量、残留DNA、鉴别试验等按文献及《中国药典》三部(2005版)进行。
四、尿激酶质量标准
成品尿激酶为无色（或米色）澄清或白色冻干粉末，每毫克蛋白的活力不得低于120000IU。
参考文献：
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