细胞生物学实验-细胞的原代培养
原代细胞培养的名词解释
原代细胞培养的名词解释在细胞生物学领域里，原代细胞培养是一种常见的实验技术。
它是通过从一个生物体内分离和培养细胞，使其在体外继续生长和繁殖的过程。
通过原代细胞培养，我们可以研究细胞的生理特性、功能和互作，有助于我们深入了解生物体内组织和器官的基本构成和功能，以及与疾病相关的异常细胞行为。
一、原代细胞的选择和分离方法要进行原代细胞培养，第一步是选择适合的原代细胞。
原代细胞是从组织或器官中分离出来的初代细胞，与体内的细胞相似，具有原始的细胞特性。
常用的原代细胞包括人类和动物的肌肉细胞、皮肤细胞、神经细胞等。
原代细胞的分离通常通过组织分块法或酶处理法进行。
组织分块法是将组织样本切割成小块，然后用细胞培养基将其浸泡，通过适当的培养条件，细胞会从组织中游离出来并生长扩增。
酶处理法则是使用特定的酶来消化组织，使细胞从基质中分离出来。
二、原代细胞培养的技术和条件原代细胞的培养需要提供适合其生长和繁殖的环境。
培养基是最基本的条件，通常包括营养物质、生长因子、补体和抗生素等。
细胞培养基中的成分要根据细胞类型的不同而调整，以满足其特定的营养需求。
细胞培养的环境因素也很重要。
温度、湿度和气体组成是常见的调节参数。
温度需要恒定在37摄氏度左右，以模拟体内的正常生理条件。
湿度的控制可以减少蒸发和细胞表面的沉积。
气体组成通常是5％二氧化碳和95％空气，以稳定酸碱平衡。
在原代细胞培养中，还需要注意细胞的传代。
传代是指将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿中，以保证细胞的生长和更新。
传代时要遵循适当的规程和技术，以确保细胞的稳定和增殖。
三、原代细胞培养的应用原代细胞培养在细胞生物学研究中具有广泛的应用。
通过原代细胞培养，我们可以研究细胞的分化、增殖、凋亡和信号传导等基本生理过程。
这对于揭示细胞发育和组织构建的机制非常重要。
此外，原代细胞培养还可以用于研究疾病的发生机制和治疗方法。
通过比较病变组织和正常组织的原代细胞，我们可以发现细胞中的异常变化，从而揭示疾病的发生和发展规律。
细胞培养方法与步骤
细胞培养方法与步骤细胞培养是指将细胞从一个生物体中取出并在实验室中培养繁殖的过程。
细胞培养可用于各种实验研究，如细胞生物学、分子生物学、药物筛选等。
细胞培养的方法多种多样，下面将介绍常见的细胞培养方法及其步骤。
一、原代细胞培养方法原代细胞培养是指将从组织或器官中分离的细胞直接进行培养。
原代细胞培养是建立细胞株的重要步骤，一般需要一定的技术和设备。
步骤：1.组织分离：从动物或人体中取得组织，如肝脏、心脏等，并用生理盐水或细胞培养基洗刷组织的表面。
2.细胞分离：将组织切割成小块，并用胰蛋白酶或胰酶进行消化，使细胞分散。
3.细胞收集：用细胞培养基冲洗消化后的组织碎片，将细胞收集到离心管中。
4.离心：将离心管放入离心机中进行离心，分离出细胞沉淀。
5.细胞培养：将细胞沉淀重新悬浮在细胞培养基中，然后转移到培养皿中进行培养。
二、细胞株培养方法细胞株培养是指将原代细胞培养到一定数目并进行传代培养的过程。
步骤：1.细胞传代：细胞达到一定密度后，用胰蛋白酶或胰酶等对细胞进行消化，将细胞分离。
2.细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，得到细胞浓度。
3.细胞培养：将分散的细胞与新鲜的培养基混合，然后转移到培养皿中进行培养。
4.细胞增殖：培养皿中的细胞经过一段时间的培养，可以看到细胞开始增殖，形成细胞集落。
5.细胞传代：当细胞集落接近充满培养皿时，需进行细胞传代，即将细胞分散到新的培养皿中。
6.细胞冻存：当细胞达到所需数量后，可以进行细胞冻存，以备之后的使用。
三、细胞培养技术要点1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，避免细菌或真菌的污染。
操作前需做好洗手消毒，使用无菌操作台，并加入适量的抗生素或抗菌剂到培养基中。
2.培养液选择：根据不同细胞的需要，选择适合的培养基和生长因子，以提供细胞的生长所需的营养物质。
3.培养条件控制：温度、湿度、CO2浓度等因素对细胞生长有重要影响，需根据具体要求进行调节。
4.细胞检测：在细胞培养过程中，需要定期观察和检测细胞的形态、生长情况、细胞浓度等指标，以确保细胞的正常生长和状态。
细胞培养-原代培养-传代培养
鼠胎组织细胞原代培养
换液：
全量换液和半量换液
换液时机的选择：
培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄，。 细胞状态
细胞换液
细胞传代
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1.悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
红色表示中性pH 黄色代表酸性pH 紫色表示碱性pH
在一些特殊培养液中不含酚红
酚红
水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml
01
细胞原代培养
02
细胞换液与传代
03
细胞冻存与复苏
三、细胞培养基本技术
取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污
01
碳酸氢钠 2.0 g
02
03
加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。
04
调节pH值至7.2
细胞的原代培养与传代培养
细胞的原代培养与传代培养原代培养通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。
原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。
特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。
在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。
在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果很好。
但应注意，原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。
即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。
其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致。
原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。
假如原代培养能够维持几小时甚至更长，即可进行进一步筛选。
有的细胞具有继续增殖能力，有的细胞类型只是存活而不增殖，而另外一些细胞只是在特殊条件下应用而不存活，因而细胞类型的分布将会改变。
在单层培养的情况下，瓶底全部铺满细胞，达到会合以后，对密度有依赖性的细胞则逐渐减少生长，而失去密度依赖敏感性的细胞则生长增加，天然或自发转化的细胞则过度生长。
借助于频繁传代，保持细胞低密度生长，有利于保存细胞的正常表型（如小鼠成纤维细胞）。
而自发转化则倾向于高细胞密度的过度生长。
细胞密度过大，培养基消耗将尽，细胞代谢产物积聚过度，细胞增殖变慢，应进行传代培养。
传代培养原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。
原代培养在首次传代时即为细胞系，能连续培养下去的为连续细胞系；不能连续培养的为有限细胞系。
通常，传代培养是指扩大培养，也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。
但严格说来，不论稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。
细胞生物学实验细胞原代培养
• 2、离散细胞培养：有单细胞贴壁或分裂成片
培养观察一般项目
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次。 观察的内容包括：
严重者细胞脱壁悬浮。
9．将植块置于12孔培养板的培养孔中央，每孔5块，间隔约2mm，
布局合理，粘膜面向上，轻轻按压每块植块，使其紧贴培养板的
表面；
10．沿培养孔的边缘，缓慢加入约0.5ml的完全MEM培养液，
勿使培养液与植块接触；
11．将培养板置于370 C
、
５％CO2培养箱中预孵育1小时；
12．每孔加完全MEM培养液2ml，轻拿轻放，切勿使植块飘
• 学习观察体外培养细胞的形态及生 长状况。
实验原理
• 模仿体内生长环境，使来自机体 的细胞、组织、器官能够在人工 培养条件下生存、生长、繁殖。
•
培养用主要仪器设备
1、纯水设备：纯水仪 2、干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、
过滤器及0.22 m滤膜； 3、超净工作台 4、培养设备： 普通培养箱、CO2培养箱； 5、贮存设备：冰箱、液氮罐 6、观察设备：倒置显微镜 7、其他设备：天平、离心机、水浴锅等
关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯 (一切操作均需在酒精灯火焰下进行)
将消毒过的所用物品放入超净工作台中
植块培养法培养鸡心肌细胞步骤
一、配M199完全培养液：
M199基础培养液 90％
小牛血清
10％
青霉素 链霉素
100IU/ml 100g/ml
过滤除菌。
二、获取心脏
① 消毒鸡胚蛋：泡入70％酒精 ② 取出鸡胚，Hank’s液洗涤。 ③ 取出心脏，放入Hank’s液中。
细胞原代培养
细胞
一细胞培养
（一）原代培养
○1胰蛋白酶消化法
1.将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）
2.吸去PBS液，将组织块移入15ml离心管中，加入组织块两倍体积预热至37℃的0.25%含EDTA的胰蛋白酶，在37℃水浴中作用20分钟，每隔五分钟摇晃一下
3.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，将消化后的组织块过细胞筛，取过滤液于离心管中，1000r/min离心5分钟
4.离心后吸去上清液，加入5ml含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至约5×105个/ml，每个培养皿（6㎝培养皿）加入5ml含细胞的培养基，上下左右移动混匀
5.放入37℃，5%CO2的培养箱中培养
6.24h后，观察细胞贴壁情况，更换培养基，继续培养，2-3天更换一次培养基
7.代细胞融合率达80%-90%时进行传代培养
○2组织块法
1. 将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）
2.将组织块转移至培养皿中，每个组织块保持一定间距
3.向培养皿中缓慢加入培养基至刚好没过组织块，小心放入37℃，5%CO2的培养箱中培养
4.24h后，观察贴壁情况，并补加新培养基
仪器：6㎝培养皿、弯头剪、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱
试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）。
原代细胞培养 实验报告
细胞生物学实验报告原代细胞培养1.实验目的：了解原理代细胞培养的基本方法，初步掌握无菌操作的方法。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、微量移液管、培养皿、离心机、注射器、L型针头（2）实验药品：蒸馏水、75%酒精溶液、PBS溶液、细胞培养液（3）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）动物细胞培养：从动物体内取出体细胞，在体外模拟体内环境在无菌、适宜温度和一定的营养条件下，使之生存、生长、繁殖，并维持其结构和功能的方法。
原代细胞培养：直接从体内获取细胞组织或器官进行体外培养至第一次传代培养为止。
细胞培养至一定程度后，需再做培养。
及培养的细胞分散后，从一个容器以一定比例转移到另一容器扩大培养。
代数：传代培养累计次数（2）细胞培养的条件①气体条件：有一定的O）（小于空气中浓度）和CO2（5%）②无菌环境：培养用品应高温灭菌，培养液应无菌处理，操作应在超净工作台无菌操作。
③最适温度：36～37℃为最适温度，30～37℃细胞可进行代谢，4℃细胞可存活数天。
④渗透压：一般为260～320mmol/l （人血浆一般为290mmol/l）⑤营养条件：含细胞生长必须的有机物，氨基酸、维生素、无机盐、辅助物等。
培养基中不含生长因子，因此，必须在培养基中加入小牛血清。
⑥最适pH：7.0～7.4（中和细胞代谢废物与酸性气体环境）（3）贴壁生长与不贴壁生长①贴壁生长：来自于实体组织的细胞多贴壁生长。
贴壁生长的细胞进行传代培养更换培养皿时有以下步骤：首先，应轻晃培养皿并弃去上清液（去除死细胞），再用胰蛋白酶处理（细胞成片收缩，变圆），倾斜培养皿，用滴管吸去多余酶液，然后用滴管吸取PBS溶液吹打细胞并离心，最后，加入新的培养液，按比例分入培养皿中。
②不贴壁生长：造血细胞、癌细胞等。
半量换液法：吸取1/2培养液到新的培养皿中，再离心，取下层细胞，分入多个培养皿中。
4.实验步骤：（1）用断头法处死小鼠，置于解剖盘中。
原代细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握原代细胞培养的基本原理和操作步骤。
2. 学习细胞传代培养的方法和注意事项。
3. 观察细胞在不同培养条件下的生长状态，为后续实验提供基础细胞。
二、实验原理原代细胞培养是指从生物体内取出组织或细胞，经过消化、分离等步骤，在无菌条件下将其培养在适宜的培养基中，使其生长、繁殖的过程。
原代细胞培养是细胞生物学、分子生物学、药理学等领域研究的重要技术手段。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：小鼠肝脏组织、胰蛋白酶、EDTA、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、无菌水、细胞培养瓶、培养皿、移液器、显微镜、离心机等。
2. 实验仪器：CO2培养箱、超净工作台、显微镜、离心机、移液器等。
四、实验方法1. 组织处理：将小鼠肝脏组织放入无菌培养皿中，用无菌手术剪将其剪成1mm³大小的组织块。
2. 消化：将组织块放入含有胰蛋白酶和EDTA的消化液中，在37℃水浴中消化5-10分钟。
3. 分离：将消化后的组织块转移到离心管中，加入适量DMEM培养基，用移液器吹打使其分散成单个细胞。
4. 细胞计数：取少量细胞悬液，用血球计数板进行细胞计数。
5. 细胞接种：将细胞悬液接种到培养瓶中，放入CO2培养箱中培养。
6. 细胞传代：待细胞生长至单层时，用胰蛋白酶消化细胞，按照1：2的比例进行传代培养。
7. 观察细胞生长状态：定期观察细胞生长状态，记录细胞数量、形态等变化。
五、实验结果1. 细胞计数：接种后24小时，细胞开始贴壁生长，48小时后细胞数量明显增加。
2. 细胞传代：传代培养过程中，细胞生长状态良好，细胞数量、形态等指标均符合要求。
3. 细胞生长状态：细胞呈多边形，排列整齐，细胞间隙较小，细胞核清晰可见。
六、实验讨论1. 原代细胞培养的成功关键在于无菌操作和适宜的培养条件。
在实验过程中，要严格按照无菌操作规程进行，确保细胞培养环境的无菌。
2. 细胞传代培养是维持细胞生长和繁殖的重要手段。
在传代过程中，要选择合适的消化时间，避免过度消化或消化不足。
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2017.10.12
一、实验原理
原代培养是直接从机体获取组织后,通过组织块长 出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单 个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培 养。
原代培养的方法主要包括组织块培养和分散细胞 培养。
组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶 壁上，加入培养基后进行培养。
养皿（或一次性无菌培养皿）中，并用D-Hanks液冲 洗鸡胚。
6. 用无菌眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，
然后用D-Hanks液充分洗涤躯干。
7.将躯干部置于小平皿盖中。用D–Hanks液至少洗涤3 次，充分弃除红细胞。
8.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。
9.在胚胎组织碎块中加入1毫升（1滴管）胎牛血清， 用滴管吸取组织块，将组织碎块接种到培养瓶内。 在培养瓶中放置10-15个组织块，静置3-5 min，然 后反转培养瓶，使接种组织块的培养瓶面在上。
四、注意事项
1.原代培养材料的选择,尽量选取胚胎或幼小的生物体组织或 者繁殖能力较强的组织，如肿瘤组织等。 2.要注意无菌操作。其要求应高于外科手术。 3.如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时 再使之与培养液接触。翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮 起来。如果组织块没有粘壁，则细胞不易生长，既使生长也 因没有贴在瓶壁上，而无法收集到。
分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细 胞分散成为单细胞。
鸡胚（chick embryo or embryonated egg）
பைடு நூலகம்对鸡胚的研究可以追溯到古希腊亚里士多德， 鸡胚在疫苗的开发和研究中有着不可替代的作用。
二、实验目的
1.了解原代细胞培养的一般方法与步骤 2.了解鸡胚的基本结构 3.巩固无菌操作技术
12.待细胞铺满瓶壁后，弃去培养液，用胰酶消化细胞。弃去消化液, 待细胞皱缩变圆。
13.补加培养液，轻轻将细胞吹打下来，吹打均匀。将培养物吸置离心管 内，静置5 min。
14.上层为单细胞悬液，下层为组织块沉淀。将上层单细胞悬液轻轻吸置 另一离心管内,弃组织块。
15.以800—1000 rpm 离心5min，弃上清液。加入培养液，重新悬浮细胞， 转移至心得培养瓶中以传代培养。
思考题
• 如何提高原代细胞培养的成功率？ • 为克服微生物污染应采取那些措施？
• 下次课主要内容：细胞爬片
10.向培养瓶中无组织块的一面（下面）加入完全培 养基，注意不要冲到组织块。 将培养瓶放在37℃、 5％CO2培养箱中培养。
11. 4小时后翻转培养瓶。培养开始的前两天不要晃动培养瓶。两天后 在倒置显微镜下观察（第三天见植块附着在培养瓶壁，周围生长出 细胞，补充或更换培养液继续培养，并拍照留存结果）。
1. 将超净台内物品，按照无菌操作要求摆放。
2. 在D–Hanks液中按1：100的比例加入双抗。
3. 取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边 界和胎位。将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球 擦拭蛋壳。
4. 用镊子或砂轮在鸡蛋气室位置敲/划一道裂痕，
然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。
5.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培
三、实验材料及设备
1.实验动物 9至12日龄的鸡胚
2.试 剂 D–Hanks缓冲液、DMEM培养基、血清、抗生素
3.仪 器 超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜
4.其它用品：
手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃 平皿、培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液 缸，75％酒精棉球，酒精灯
四、实验步骤：