小分子抗原制备的注意要点
抗原的制备方法
抗原的制备方法 除完整的细胞可作为抗原外，各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质，也都具有全抗原或半抗原的性质，某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的，可作为这种细胞的一个标志。
由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质，有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质，以供科学研究之用。
一、抗原的提取 抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。
根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；②把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心和超滤等。
由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。
因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选用合适的方法。
如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质，更需要经过各种方法的比较探索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。
抗原物质的制备，大概要经过如下过程：①材料的选择和预处理；②细胞的粉碎（细胞器的分离）。
③提取；④纯化；⑤浓缩或干燥，保存。
现分别简述如下。
（一）材料的选择及预处理 选择什么材料主要根据实验目的而定。
通常选含量高、工艺简便、成本低的材料。
材料选定后，通常要进行预处理，剔除结缔组织、脂肪组织等，把组织块剪碎。
若取材后不立即进行提取，则应冷冻保存，动物组织更要深低温保存。
某些容易失活的物质，一般宜采用新鲜材料。
（二）细胞的粉碎 除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外，凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质，都必须把组织和细胞粉碎，使活性物质充分释放到溶液内。
小分子人工抗原的制备方法
小分子人工抗原的制备常用方法一、碳二亚胺（EDC）法（制备KAN-BSA ）1. A 液的制备：准确称取BSA 20mg，EDC 55mg，使之充分溶解于2mL 0.01MPBS 中，4℃避光搅拌反应6h，得到反应液为A 液；2. B 液的制备：准确称取卡那霉素标准品50 mg，加入1.5 mL 0.01 M PBS 中，边加边搅拌，使之充分溶解后所得溶液称为 B 液；3.将上述B 液逐滴加入A 液中（边加入边搅拌），密封，避光，在4℃下搅拌过夜；4.待上述反应完后，将反应液转移到处理好的透析袋中，4℃用0.01M PBS 透析3d，透析第一天每3h 换液一次，以后每8-10h 换液一次；5.透析完成后，将偶联产物分装于 1.5ml ep 管中，于-20℃保存备用。
本实验将其作为免疫原。
二、戊二醛（GA）法（制备KAN-GA-OVA ）1. A 液的制备：准确称取卡那霉素标准品50mg，量取0.5%戊二醛溶液1mL，2.先后将二者充分溶于2 mL 0.01M 的PBS 中，于4℃，避光搅拌反应30min，所得反应溶液称为A液；3.B液的制备：准确称取OVA 150 mg，将其充分溶于5mL 0.01M PBS 中，得到的溶液称为B液；4.将上述B 反应液逐滴加入到 A 反应液中，边加入边搅拌，再向反应溶液中加入约5.5mg硼氢化钠，调节溶液pH至8.0，于4℃避光搅拌反应2h；5.用 0.01M PBS 透析，4℃透析5d，每8h换液一次，透析完成后，将反应液分装于1.5mL离心管中，放于-20℃冻存备用。
三、混合酸酐法（制备克百威人工抗原）1.取半抗原克百威（BFNH或BFNB）溶解在DMF（二甲基甲酰胺）中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，在室温下反应1h；2.取反应液500ul加入到5ml 15mg/ml的BSA碳酸缓冲液中，在磁力搅拌下反应2h；3.反应完成后，蒸馏水透析2次；0.8%生理盐水透析；4.紫外扫描测定结合比，于-20℃保存备用。
小分子抗原现在做的最多的是农药和兽药(精)
小分子抗原现在做的最多的是农药和兽药，这方面的文献也很多。
以前查过一些材料，个人觉得小分子抗原能否制备出高性能的单克隆抗体主要以下几点决定。
对于半抗原结构的选择，如果待测物本身含有NH2，COOH，OH等活性基团，可以利用待测物活性基团加入间隔臂，然后联入载体蛋白就可以成功合成人工抗原，制备特异性良好的抗体（周思祥，刘福成，2005）。
但大部分待测物上并不含有活性基团或活性基团对药物的特异性和极性影响很大，所以大部分用于人工抗原合成的半抗原要经过改造或从头合成。
例如在关于有机磷农药倍硫磷的免疫检测方法的研究中，半抗原物的获得采用的合成方法并不是从倍硫磷开始合成，而是采用另一途径，从起始物重新合成，这样反而能取得较好的效果，这一点对于制备具有多残留检测能力的抗体来说更为重要，只需合成出几种待测药物共有的结构就有可能制备出具有多残留检测能力的抗体。
（Yoo Jung Kima，2003）待测物本身的结构有时对建立方法的性能有很重要的影响，在分子量在111－1202Da的化合物制备的单克隆抗体的亲和系数的试验中，半抗原的分子量在334–374Da之间时，制备的单克隆抗体具有很高的亲和系数。
但当要检测的小分子化合物的分子量小于300Da时，产生具有良好灵敏度和特异性单克隆抗体的可能性下降（Chappey et al.，1994）。
这说明药物的分子量是影响抗体性能的重要因素。
同时待测物的结构对于制备人工抗原的难易程度有重要影响，有些半抗原经过理论分析能制备出高质量的抗体，但从化学合成的角度，这些化合物可能是合成不出来的或工艺过于复杂，所以半抗原结构能否合成出来，也是半抗原结构设计过程中要考虑的问题。
如果待测物结构过于简单，可能也是不能建立免疫检测方法的。
待测物的结构最好含有特征性的环状结构或侧链结构，甚至含有杂原子，都能够增加制备出高质量抗体的可能性。
在对脂肪酸类物质制备抗体的试验中，对于脂肪酸类物质来说，如果含有两个以上的羰基，及与蛋白偶联之后还有多余的羰基增强亲水性，同时酰基的不饱和双键和极性的头部结构都可以做为B细胞的抗原决定簇，可以将其他抗原性很弱的部分变成强抗原性。
抗原分离纯化的基本操作方法
抗原分离纯化的基本操作方法抗原分离纯化是生物化学和生物技术领域中十分重要的研究方法，用于从混合物中分离出特定的抗原并进一步纯化。
下面将介绍抗原分离纯化的基本操作方法。
1. 抗原的提取：在分离纯化之前，首先需要从生物样品中提取目标抗原。
提取方法根据抗原的特性和来源可以有多种选择，如细胞裂解、超声波破碎、冷冻切片等。
2. 色谱层析：色谱层析是抗原分离纯化的重要手段之一。
根据抗原的特性和需求，可以采用多种类型的色谱层析技术，如离子交换层析、亲和色谱、凝胶过滤层析、逆流层析等。
色谱层析的原理是通过选择性结合、分离和洗脱，将混合物中的目标抗原与其他成分分离。
3. 过滤：过滤是常用的样品预处理和分离纯化步骤。
可以通过滤膜的孔径大小选择性地分离不同大小、不同形态的分子。
例如，通过滤膜可以分离大分子抗原和小分子杂质。
4. 盐析：盐析也是一种常用的分离和纯化方法。
盐析是通过改变样品中的离子强度和溶剂的pH值，使溶液中的蛋白质产生相互吸引力或排斥作用，从而实现蛋白质的分离和纯化。
可以通过逐渐增加或减少盐浓度的方法来控制蛋白质的溶解度。
5. 电泳：电泳是一种常用的分离纯化手段，可以根据抗原的电荷和分子大小进行分离。
电泳可分为凝胶电泳和毛细管电泳两种，其中凝胶电泳又分为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和凝胶过滤电泳等。
该方法可以通过电流作用下移动不同电荷的分子而实现分离纯化。
6. 超速离心：超速离心是利用离心力作用下分子的悬浮性差异进行分离纯化的方法。
通过调节离心速度和时间，可以将目标抗原与其他成分分离。
7. 透析：透析是将混合物置于半透膜中，利用溶质的扩散来实现溶质的分离和去除。
透析可以有效去除小分子的杂质，使溶液中的目标抗原纯化。
8. 离子交换：离子交换是根据溶液中离子的电荷进行分离纯化的方法。
通过调节溶液的pH值和盐浓度，可以控制目标抗原与离子交换树脂的吸附和解吸，实现分离纯化。
9. 亲和层析：亲和层析是利用抗原与特定亲和配体（如抗体、金属离子等）之间的特异结合来实现的纯化方法。
抗原的分离与纯化技术介绍
抗原的分离与纯化技术介绍从细胞中提取出来的生物大分子是不纯净的，必须进一步分离纯化才能获得纯品。
在生物大分子制备工作中，分离纯化是比较复杂和重要的一个环节。
对于异类的物质，如提纯蛋白质和酶时混杂着核酸，提纯核酸时混杂着蛋白质或多糖，一般可用专一性酶水解、有机溶剂抽提、选择性分部沉淀等方法处理，小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互相转化被分离或最后用透析方法除去。
而对同类物质，如酶和杂蛋白，RNA和DNA以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之间的分离，情况则复杂得多，主要应用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超速离心法、柱层析法等。
其中盐析法、等电点法、结晶法用于蛋白、酶的提纯较多；有机溶剂抽提和沉淀用于核酸提纯较多；柱层析法、梯度离心法在蛋白质和核酸的提纯工作中应用均十分广泛。
本节侧重对蛋白质、酶和核酸分离纯化中与溶解度有关的一些方法作一简要叙述。
1．蛋白质分离纯化的一些方法（1）盐析法①原理：盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早，至今仍广泛使用的方法。
其原理是蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解度随着盐液浓度升高而增加（此时称为盐溶）；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。
这一现象是由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力，当水中加入少量盐类时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。
但盐浓度增加到一定程度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出。
盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。
②盐的选择：蛋白质盐析常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最广的是硫酸铵，其优点是温度系数小而溶解度大（25℃时饱和溶解度为4.1mol/L，即767g/L;0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来，而且硫酸铵价廉易得，分段效果比其他盐好，不容易引起蛋白质变性。
抗原制备的实验报告
一、实验目的1. 掌握抗原的制备方法，了解不同类型抗原的制备和纯化技术；2. 熟悉常用佐剂的使用；3. 学习玻璃器材的清洁和消毒方法；4. 培养实验操作技能和实验数据处理能力。
二、实验原理抗原是指能够引起机体产生特异性免疫反应的物质。
在抗原制备实验中，我们需要从生物样品中提取目标抗原，然后对其进行纯化和处理，使其具有良好的免疫原性和特异性。
三、实验材料1. 生物样品：细菌、病毒、细胞、组织等；2. 试剂：细胞裂解剂、超声破碎剂、离心机、玻璃器材、消毒液、佐剂等；3. 仪器：显微镜、离心机、分光光度计、移液器、培养箱等。
四、实验步骤1. 样本处理（1）取适量生物样品，用无菌操作技术进行接种；（2）根据样品类型，选择合适的裂解方法，如细胞裂解、超声破碎等；（3）裂解后，将样品置于离心机中，以适当转速和时长进行离心，收集上清液。
2. 抗原提取（1）取上清液，加入适量的缓冲液和离心机，以适当转速和时长进行离心；（2）收集沉淀，加入适量的缓冲液，进行溶解；（3）重复离心，直至沉淀完全溶解。
3. 抗原纯化（1）根据抗原特性，选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等；（2）将溶解的抗原加入纯化柱，进行洗脱和收集；（3）根据需要，可进行多次纯化，以提高抗原纯度。
4. 抗原处理（1）将纯化后的抗原加入适量的佐剂，进行免疫原性增强；（2）将抗原与佐剂混合均匀，备用。
5. 实验结果观察（1）通过观察显微镜下的细胞形态，了解抗原制备过程中的细胞状态；（2）通过分光光度计检测抗原浓度，了解抗原纯化效果；（3）通过实验数据分析，评价抗原制备的成功率。
五、实验结果与分析1. 样本处理过程中，细胞形态良好，无污染现象；2. 抗原提取过程中，上清液清晰，无沉淀；3. 抗原纯化过程中，纯化效果良好，抗原浓度达到预期；4. 抗原处理过程中，抗原与佐剂混合均匀，无分层现象；5. 实验数据分析表明，抗原制备成功率较高。
六、实验总结本次实验成功制备了所需抗原，掌握了抗原的制备方法、纯化技术和佐剂的使用。
抗原的制备
抗原的制备
小分子抗原
小分子抗原是指小分子化合物，分子量一般都比较小；通常来说，分子量越大、结构越复杂越容易制备高亲和力的抗体，含有芳香环的小分子更容易引起免疫反应。
同样，小分子化合物必须与载体蛋白偶联才能形成完全抗原作为免疫原，小分子化合物与载体偶联一般需要借助于中间体途径引入一些连接臂或者Linker然后再连接到蛋白质载体上，一般不能直接与其结构上的某个基团直接偶联，如果强行偶联势必改变抗原结构；所以通常是先借以合成中间体然后再制备完全抗原。
金属离子抗原
金属离子的免疫抗原一般是借助于螯合剂来实现的，首先将螯合剂偶联到蛋白载体上，比如BSA和OVA，然后再将离子螯合上去；吉林大学的郝亚明依靠该技术成功制备出镉离子（Cd2+）单克隆抗体。
目前，制备金属离子单抗成功并不多，暨南大学的唐勇教授在这方面积累了很多，目前已经成功制备出汞离子（Hg2+）、镉离子（Cd2+）和铅离子（Pb2+）等单克隆抗体，在环境污染检测方面已开发出胶体金和ELISA试纸条等快速检测产品。
对于此类抗原的制备方法,本书不做过多介绍,如感兴趣可与福因德技术团队共同探讨。
临床免疫学：第三章 抗原制备技术
一、氨基酸序列的确定
1、肽抗原的长度： 一般为10～20个氨基酸残基，平均 15个左右
2、肽抗原的理化特征 ： 线性表位，位于天然蛋白质分子 的表面，序列中多含带电氨基酸 残基，具有很高的亲水性或具有 特定的二级结构
3、肽抗原的合成难易程度和纯度 亲水性序列的水溶性好，相对容 易合成 ；选取数条不同的短肽序 列
制备天然抗原的限制：得率、纯度 基因工程技术：在外源表达系统中大量表 达 纯化处理 高纯度的蛋白质抗原
一、氨基酸序列的确定；
二、重组蛋白质抗原的制备；
一、氨基酸序列的确定
1、已知的蛋白质抗原： 直接从相关的生物信息数据库如NCBI中检索获得其氨基
酸序列； 2、部分氨基酸序列已知的蛋白质抗原： 先根据三联密码子原则设整的序 列； 3、序列信息完全不知的新发现重组蛋白质抗原的制备
氨基酸序列的确定 1．已知的蛋白质抗原 2．部分序列已知 3．完全未知
获得对应的DNA编码序列
构建合适的表达载体
1.超声破碎法 2.反复冻融法 3.酶处理法 4.表面活性剂处理法
原理：利用超声波（1～20kHz）的机械振动使 流体局部减压而发生内部液体流动、旋涡形成 和消失，产生强大压力使细胞破碎。
特点：①操作简单，重复性较好，节省时间； ②多用于组织细胞的破碎。
超声破碎时必须间歇进行，可采用冰浴以 避免因长时间产热对抗原的破坏。
线性或连续性决定簇
构象或不连续性决定簇
抗原的分类：
1. 根据抗原的免疫原性 完全抗原：细菌、病毒、动物血清； 半抗原/不完全抗原：大多数多糖、类脂、 核酸降解产物、某些药物；
2. 根据与淋巴细胞的关系 胸腺依赖性抗原：蛋白质、红细胞、细菌 非胸腺依赖性抗原：脂多糖
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小分子抗原制备的注意要点小分子抗原现在做的最多的是农药和兽药，这方面的文献也很多。
以前查过一些材料，作者觉得小分子抗原能否制备出高性能的单克隆抗体主要以下几点决定。
1、对于半抗原结构的选择，如果待测物本身含有NH2，COOH，OH等活性基团，可以利用待测物活性基团加入间隔臂，然后联入载体蛋白就可以成功合成人工抗原，制备特异性良好的抗体。
但大部分待测物上并不含有活性基团或活性基团对药物的特异性和极性影响很大，所以大部分用于人工抗原合成的半抗原要经过改造或从头合成。
例如在关于有机磷农药倍硫磷的免疫检测方法的研究中，半抗原物的获得采用的合成方法并不是从倍硫磷开始合成，而是采用另一途径，从起始物重新合成，这样反而能取得较好的效果，这一点对于制备具有多残留检测能力的抗体来说更为重要，只需合成出几种待测药物共有的结构就有可能制备出具有多残留检测能力的抗体。
（Yoo Jung Kima，2003）2、待测物本身的结构有时对建立方法的性能有很重要的影响，在分子量在111－1202Da的化合物制备的单克隆抗体的亲和系数的试验中，半抗原的分子量在334–374Da 之间时，制备的单克隆抗体具有很高的亲和系数。
但当要检测的小分子化合物的分子量小于300Da时，产生具有良好灵敏度和特异性单克隆抗体的可能性下降（Chappey et al.，1994）。
这说明药物的分子量是影响抗体性能的重要因素。
同时待测物的结构对于制备人工抗原的难易程度有重要影响，有些半抗原经过理论分析能制备出高质量的抗体，但从化学合成的角度，这些化合物可能是合成不出来的或工艺过于复杂，所以半抗原结构能否合成出来，也是半抗原结构设计过程中要考虑的问题。
3、如果待测物结构过于简单，可能也是不能建立免疫检测方法的。
待测物的结构最好含有特征性的环状结构或侧链结构，甚至含有杂原子，都能够增加制备出高质量抗体的可能性。
在对脂肪酸类物质制备抗体的试验中，对于脂肪酸类物质来说，如果含有两个以上的羰基，及与蛋白偶联之后还有多余的羰基增强亲水性，同时酰基的不饱和双键和极性的头部结构都可以做为B细胞的抗原决定簇，可以将其他抗原性很弱的部分变成强抗原性。
再者如果脂肪酸含有平面结构，也可以作为抗原决定表位，使产生特异性的抗体。
这说明小分子的极性以及不饱和键，苯环结构都可以增强抗原性，简单的直链结构很难产生特异性很强的抗体，这也是一般选用直链作为间隔臂的原因。
直链碳链本身的抗原决定性很差，不会产生针对间隔臂的抗体。
4、合成人工抗原的过程中，即使半抗原绝大部分的官能团与待测物都是一致的，它也可能在联入蛋白载体的过程中受到屏蔽作用。
小分子药物在与载体蛋白连接的部位很容易受到屏蔽。
从而产生的抗体就会丧失对那些屏蔽基团的特异性。
确定半抗原不受蛋白的屏蔽作用在人工抗原合成中非常重要，解决这一问题的最佳方法就是联入间隔臂。
5、间隔臂的连接位点的选择对于抗体质量至关重要，最好不要影响小分子化合物中特征性的基团暴露于免疫B细胞的抗原表位，这也是待测物本身的羧基，氨基一般不能直接联入间隔臂，因为这些基团对小分子药物的电性和极性影响非常大。
而且引入的间隔臂不能影响主要基团的电子分布，例如苯环和其他杂环类的电子分布，这就要求间隔臂的极性和能量要低，将对小分子药物的电子排布和空间结构的影响降到最低，从这个角度来说，低能量的直链间隔臂是最佳的选择。
联入间隔臂的半抗原的电子分布与目标待测物的电子特性一致性对抗体针对待测物的特异性至关重要。
6、半抗原间隔臂的连接位点，最好选择极性较低且远离半抗原的特征性结构。
如果待测物的极性较高，半抗原合成的过程中最好保持其与目标待测物极性的一致性。
人工抗原具有较高的极性，对于引发免疫反应有重要作用。
在结构3Bentazon的抗体制备过程中，有三个介入位点。
异丙基远离杂环，是联入间隔臂的理想位点，可以最小程度的改变待测物的物理和化学特性。
但异丙基是这物质的特异性基团，对于保证制备抗体的特异性很重要，所以不能选择这个位点。
7、Bentason II位的亚氨基具有很强的极性，如果间隔臂联入这个位点极性将会消失。
这种化合物的衍生物大多为非极性，如果要制备多残留的抗体，增加交叉反应率，这个位点将是理想的间隔臂介入位点。
但对特异性要求高的抗体制备，就必须要保证半抗原的极性，所以对于高特异性的抗体制备来说，这一位点也不适合连入间隔臂。
在III位介入直链的间隔臂，可以保证与待测物极性的一致，而且中性的多甲基直链对杂环的电子排布影响也较小。
试验结果显示II，III联入间隔臂制备的抗体对Bentason的灵敏度很差，但是对II位氨基衍生的样品的灵敏度高于目标待测物，说明衍生物的非极性是灵敏度高于原形Bentason的原因。
这也与MQCA抗体对原型药物识别能力较差，但对丁胺衍生后的样品具有高灵敏度的实验结果相一致。
说明半抗原与待测药物电荷状态的一致性，在这些极性很强的药物小分子免疫残留检测方法中要重点考虑。
但III位接入间隔臂的人工抗原制备的抗体的灵敏度与预期不一致，这可能因为再III位联入间隔臂时，间隔臂上面自由的羧酸基团可能与II位自由的氨基发生偶联，所以III位联入间隔臂的人工抗原的极性与目标待测物不一致，这也是抗体对目标待测物识别能力较差的原因。
在Eva M.Brun等（2004）的实验中，根据待测物杀螟松的结构设计了多种半抗原的组合，具有特异性的结构的是用椭圆标记出来的，在连接偶联臂时就要充分考虑暴露这一重要的抗原表位，研究中通过对比接入偶联臂的不同结构的半抗原，显示充分暴露该结构的F7半抗原制备人工抗原免疫动物得到的多克隆抗体，具有最好的灵敏度和效价。
（Eva M.Brun et al，2004）8、间隔臂的介入位点，最好远离特征性的基团，而且要尽可能保存特异性较大的杂原子或带侧链的碳链结构，联入的间隔臂最好在苯环或其他杂环的碳原子上，这样可以最大程度的保证半抗原的极性与目标待测物的一致性，如果有远离大环的碳链结构，那么碳链的末端也是一个很好的介入位点，因为这样的结构对大环的电子排布影响较小。
（Young Ae Cho et al ，2004）9、除了间隔臂的接入位点以外，间隔臂本身的结构也是影响半抗原合成是否成功的重要因素。
虽然半抗原接入间隔臂是必要的，但间隔臂太长会导致半抗原分子的折叠，使其更接近载体蛋白，屏蔽作用增强。
一些学者认为理想的间隔臂长度是中度的3－6个直链碳原子构成，这时得到抗体的灵敏度要高于间隔臂很短的人工抗原制备的抗体（6，13，20，21），但在另外的试验中，使用零间隔臂的免疫原也得到了特异性很好的抗体。
在Yoo Jung Kim实验中，在间隔臂介入位点为最佳的时候，当间隔臂的长度在2-6之间时，分别制备了人工抗原，在载体蛋白以及其他的免疫程序一致的条件下，不同免疫原产生的抗体在亲和能力和灵敏度方面都没有明显的差异。
也说明在间隔臂长度适中的情况下，间隔臂的长度对免疫检测的灵敏度没有明显的影响。
10、间隔臂的选择，一般间隔臂要求本身不要产生针对间隔臂的抗体，而且对半抗原的结构影响要小，并且末端要含有能与载体蛋白氨基或羧基偶联的活性基团，一般为氨基，羧基，或羟基。
间隔臂与小分子半抗原连接一端，最好以单纯的碳链连接，如果难以实现也要选择电性较低的连接基团，试验证明以酰胺键相连接，产生的抗体对间隔臂有很高的亲和系数.11、有试验表明当联入的间隔臂末端为羟基时，产生抗体的灵敏度要明显高于相同条件下间隔臂以羧酸基团为末端的人工抗原制备的抗体。
这可能因为含间隔臂半抗原末端不同，所以与载体蛋白的偶联方式不同，所以含羟基的半抗原可以提高半抗原与载体的偶联比，并且能够更好的暴露半抗原的抗原决定簇。
（Brun et al，2004）12、虽然对于含多个特异性结构的大分子化合物来说，用含苯环的间隔臂或零间隔臂同样可能制备处特异性好，灵敏度高的抗体。
但现在很多试验都证明，选择简单的中长度的碳链对于半抗原合成是最佳选择，也是小分子药物半抗原合成选择间隔臂的通用方法。
13、用作载体的有蛋白质类、多肽聚合物、大分子聚合物和某些颗粒，常用的有明胶、牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、兔血清白蛋白、卵清白蛋白（OVA）、匙孔血蓝蛋白（KLH）等。
选择载体要综合考虑分子量、活性基团、溶解度及来源，价格等因素。
明胶做为载体免疫原性差，需要多次免疫。
匙孔血蓝蛋白（KLH）价格昂贵，虽然免疫原性强，但它激发的B淋巴细胞克隆中针对自身抗原决定簇的多，相对减少了针对半抗原的B淋巴细胞克隆，增加阳性克隆筛选的难度和工作量（Fasciglione et al.，1996）。
一般认为，用与免疫动物亲缘关系较远的蛋白作为载体可能会更好，BSA与HSA都是良好的载体蛋白，均能刺激动物产生特异性抗体，并且BSA、HSA和OVA这几种载体分子量适中、来源容易、价格便宜、水溶性好，故常用作半抗原载体；此外BSA、HSA和OVA都具有大量的反应基团，如氨基、羧基等，且能在水相或某些有机溶剂的混合物中充分溶解，使偶联反应可在较高浓度的反应物存在条件下进行，据报道，每分子BSA有60个游离氨基，每分子OVA有20个游离氨基（NCBI蛋白质数据库）可以和合成半抗原的羧基反应形成肽键，合成免疫原。
14、由试验表明在单克隆抗体的制备过程中，脂蛋白－Th细胞抗原决定基载体蛋白（Pam3Cys-TH）制备抗体的灵敏度高于用BSA，KLH作为载体蛋白制备的抗体，可能因为这种载体蛋白的支链更长。
用BSA或KLH作为载体制备抗体的亲和力很差，因为分子在体内很快被肾脏系统消除，而新载体Pam3Cys-TH就克服了这样的问题。
（Hoffmann et al.，1997；Baier et al.，2000）。
并且Pam3Cys-TH本身就可以做为佐剂使用，所以产生的免疫反应非常强，有利于产生高亲和力的抗体。
因为抗原展示细胞（APC）表面是带负电荷的，通常认为如果载体蛋白经过离子化处理带有正电荷，就更容易结合到带负电荷的细胞表面，能引起更强的免疫反应。
（Apple et al.，1988）以上仅是作者查文献的一些总结，而且很多结果都不能从原理上解释清楚，所以抗体制备的时候最好还是多考虑几种抗原设计方案。
根据初步筛选的结果确定用哪种抗原免疫的动物做融合。