核酸的性质及研究方法
第八章 核酸的理化性质 - 复制
mRNA的提取 磁珠吸附法
4.核酸的含量测定
紫外吸收法：
定磷法：在浓H2SO4作用下将有机P转化成无机P， 酸性条件下与钼酸作用氧化成磷钼酸，最终被还 原成钼蓝，660nm测定紫外吸收。 定糖法： 1）核糖与浓盐酸和苔酚蓝共热呈绿色， 在 670nm处可测RNA； 2）2-脱氧核糖与酸和二苯胺共热呈蓝 紫色，在595nm处可测DNA。
3.判断DNA是否变性
在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）
四 核酸的变性、复性、分子杂交
1、变性（Denaturation）
1）定义：双螺旋DNA的 有序结构或具双螺旋 区的RNA，在外界因 素的作用下，碱基间 的氢键断裂，形成无 规则单链线团结构的 过程。
DNA的Tm一般在82— 95℃之间
3.影响Tm的因素：
1）DNA的均一性
均一性高，变性温度范围越窄，据此可分析DNA均 一性。
2）G-C含量：Tm与G-C含量成正比。 （G+C)%=(Tm-69.3)X2.44
3）介质的离子强度：离子强度低，Tm低，
熔解温度范围窄。
大肠杆菌DNA在不同浓度KCl溶液下的熔融温度曲线
32P
*ACTTCGACAG 肼/Nacl（C）： *AC *ACTTC *ACTTCGA C *ACTTCGACAG 肼（C+T）： *AC *ACT *ACT T *ACTTC *ACTTCGAC *ACTTCGACAG
硫酸二甲酯（G）： *ACTTCG *ACTTCGACAG
甲酸（G+A）： *A *ACTTCACAG
应用 于克 隆、 测序、 检测 DNA 等
碱基的解离 p504 核苷的解离 P505 核苷酸的解离 P505 核酸的滴定曲线 P506
核酸的理化性质及应用
核酸的理化性质及应用核酸是一类含有大量核苷酸单元的生物大分子，在细胞中起着重要的生物学功能。
核酸分为两类：脱氧核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。
下面我将介绍核酸的理化性质及应用。
一、核酸的理化性质：1. 化学成分：核酸由核苷酸单元组成，单个核苷酸由一个五碳糖（脱氧核糖或核糖）、一个含氮碱基和一个磷酸基团组成。
2. 结构：DNA是由两条互补的链以双螺旋结构排列而成，RNA是以单链形式存在。
DNA的碱基对是按照互补规则特异性配对的，腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）之间有两个氢键相连，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）之间有三个氢键相连，保持了DNA分子的稳定性。
3. 酸碱性：核酸是一种多酸性物质，可与碱性染料结合。
通过电泳技术可将核酸分离，由于核酸是多酸性的，具有负电荷，在电场中可被迁移，从而实现其分离和纯化。
4. 稳定性：由于DNA中的碱基对通过氢键相连，DNA分子具有较高的稳定性，可在适宜条件下长期储存。
二、核酸的应用：1. 遗传学研究：核酸是遗传物质的重要组成部分，在遗传学研究中发挥着关键作用。
通过对DNA或RNA的序列进行分析，可以揭示生物个体之间的遗传差异，并研究基因与功能的关系。
例如，人类基因组计划（Human Genome Project）使用DNA测序技术对人类整个基因组进行了测序，从而为深入研究人类遗传学奠定了基础。
2. 诊断医学：核酸在疾病诊断中的应用日益重要。
通过PCR（聚合酶链式反应）技术可以在体液或组织中检测到微量的病原体DNA或RNA，从而实现病原体的快速检测和诊断。
例如，在新冠疫情中，核酸检测成为最常用的方法之一。
3. 基因工程：核酸在基因工程领域具有重要应用。
通过将外源DNA或RNA导入细胞中，可以实现基因的插入、删除或替换，从而实现基因改造或修复。
这种技术在生物技术、农业、医学等领域中有着广泛的应用，如转基因作物的培育、基因治疗等。
4. 疾病治疗：核酸药物被广泛应用于疾病的治疗。
核酸的性质
核酸的性质核酸的理化性质及研究方法内容十分庞杂，本节只可能对若干比较重要的核酸理化性质和研究方法作概要叙述。
一、一般物理性质1. 溶解度DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，它们都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。
它们可溶于2-甲氧乙醇，但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂，因此，常用乙醇从溶液中沉淀核酸，当乙醇浓度达50%时，DNA就沉淀出来，当乙醇浓度达75%时RNA也沉淀出来。
DNA和RNA在细胞内常与蛋白质结合成核蛋白，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同，DNA核蛋白难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于高浓度（1~2mol/L）的NaCl溶液，而RNA核蛋白则易溶于0.14mol/L的NaCl溶液，因此常用不同浓度的盐溶液分离两种核蛋白。
2. 分子大小DNA分子极大，分子量在106以上，RNA的分子比DNA分子小得多。
核酸分子的大小可用长度、核苷酸对（或碱基对）数目、沉降系数（S）和分子量等来表示。
3. 形状及粘度核酸（特别是线形DNA）分子极为细长，其直径与长度之比可达1：107，因此核酸溶液的粘度很大，即使是很稀的DNA溶液也有很大的粘度。
RNA溶液的粘度要小得多。
核酸若发生变性或降解，其溶液的粘度降低。
二、核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。
DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值（图3-25），其吸光率（absorbance）以A260表示，A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。
在230nm处为吸收低谷，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。
不同核苷酸有不同的吸收特性。
所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。
实验室中最常用的是定量测定小量的DNA或RNA。
对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值，因为蛋白质的最大吸收在280nm处，因此从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。
第15章 核酸的研究方法
核酸的核苷酸序列测定(4) 核酸的核苷酸序列测定
Sanger DNA测序原理 测序原理
核酸的核苷酸序列测定(5) 核酸的核苷酸序列测定
(二)DNA的化学法测序 二 的化学法测序
化学法测序由Maxam和Gilbert于1977年所发明。其基本原理 和 年所发明。 化学法测序由 于 年所发明 是用特异的化学试剂作用于DNA分子中不同碱基，然后用哌啶切 分子中不同碱基， 是用特异的化学试剂作用于 分子中不同碱基 断反应碱基的多核苷酸链。 种不同的特异反应 种不同的特异反应， 断反应碱基的多核苷酸链。用4种不同的特异反应，就可以使末端 标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。 分子切成不同长度的片断， 标记的 分子切成不同长度的片断 其末端都是该特异的碱基。 经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱。 经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱。
寡核苷酸链释放
PCR:聚合酶链式反应 聚合酶链式反应(1) 聚合酶链式反应
由引物决定的DNA扩增片断 扩增片断 由引物决定的
①加热使DNA双链分开 加热使 双链分开 加入寡聚DNA引物片 ②加入寡聚 引物片 段，冷却
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
重复步骤③ 重复步骤③
③升温至TaqDNA聚 升温至 聚 合酶最适温度， 合酶最适温度，使子 链自引物向前延伸
核酸的凝胶电泳
(一) 琼脂糖凝胶电泳 一 以琼脂糖作为支持物,电泳的迁移率决定于以下因素 以琼脂糖作为支持物 电泳的迁移率决定于以下因素: 电泳的迁移率决定于以下因素 (1) 核酸分子大小 (2) 胶浓度 (3) DNA的构象 的构象 (4) 电压 (5) 碱基组成 (6) 温度 (二) 聚丙烯酰氨凝胶电泳 以聚丙烯酰氨作支持物,单体丙烯酰氨在加入交联剂后, 以聚丙烯酰氨作支持物,单体丙烯酰氨在加入交联剂后, 就成聚丙烯酰氨.由于这种凝胶的孔径比琼脂糖胶要小, 就成聚丙烯酰氨.由于这种凝胶的孔径比琼脂糖胶要小,所以 可用于分析相对质量小于1000bp DNA片段和RNA的电泳 1000bp的 片段和RNA的电泳. 可用于分析相对质量小于1000bp的DNA片段和RNA的电泳.
核酸生物学的研究及其在生命科学中的应用
核酸生物学的研究及其在生命科学中的应用生物分子是构成生命基石的重要组成部分，其中核酸具有非常重要的生物学作用。
在生命科学领域中，核酸生物学是一个不断发展的领域，旨在研究核酸的生物学性质、结构、功能、调控等方面，以增进对生命的认识和应用。
本文将介绍核酸生物学的研究进展以及在生命科学中的应用。
一、核酸的生物学性质核酸是生物体内不可或缺的生物分子之一，它具有一些特殊的生物学性质。
首先，核酸是生命信息的载体，可以传递、保存和表达遗传信息，是遗传学中研究的重要对象。
其次，核酸在细胞代谢中也具有重要作用，如RNA参与蛋白质合成，DNA参与细胞分裂等。
此外，核酸还具有比较严格的碱基配对规则和双链结构，这些结构性特征也影响了核酸的生物学功能。
二、核酸的结构研究核酸的结构研究是核酸生物学研究的重要内容之一。
DNA和RNA的发现和结构揭示是核酸研究的重大里程碑。
20世纪50年代，Watson和Crick发现了DNA的双螺旋结构，这一发现具有重大的生物学和化学意义，推动了生物学和生物化学的发展。
此后，人们进行了对不同类型核酸的结构探索和比较，如RNA中分子间G-C配对的比例较低等。
随着技术的发展，如透射电子显微镜和核磁共振技术等的应用，人们对核酸的结构和功能有了更深层次的认识。
三、核酸的功能和调控核酸的生物学功能非常广泛，主要包括以下方面：1.存储遗传信息。
DNA是细胞内遗传物质的主要载体，可以传递、保存并复制遗传信息，2.表达遗传信息。
DNA转录成RNA并进一步被翻译为蛋白质。
3.编码蛋白质。
基于DNA序列信息，可以预测对应蛋白质的组成和结构。
4.调控生物体代谢和发育。
核酸还参与调控生物体代谢和发育过程，如RNA干扰技术可以靶向调控基因表达。
五、核酸在生命科学中的应用1.基因编辑。
CRISPR/Cas9是近年来非常热门的基因编辑技术，借助RNA引导CRISPR-Cas9体系靶向剪切基因，以实现基因编辑。
2.诊断技术。
核酸的性质与研究方法
核酸的理化性质
核酸的分离纯化、 测定及研究方法
ห้องสมุดไป่ตู้酸的理化性质
核酸的性质是由其结构决定的。核酸的结构 特点是分子大,有一些可解离的基团,具有共轭 双键等.这些特点决定了核酸及其组分核苷酸性 质的基础.下面介绍几种重要的性质:
一、物理性质
1、性状：RNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色 的粉末或结晶；DNA则为疏松的石棉一样的纤维状固体。
核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此， 核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸 性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约 为4～5，RNA的pI约为2.0～2.5，在pH7～8电泳时 泳向正极。
四、UV吸收 ：核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫 外吸收的的性质，在260nm处核酸紫外吸收最强。核酸的紫外 吸收是核酸定量测定的基础。
指经加热变性的DNA在适当条件下，二条互补链全部 或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种 逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过 程称之为退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核 酸分子的形成(见后)。
DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因 素的影响：
杂交可以发生于DNA与DNA之间，也可以发生于RNA 与RNA之间和DNA与RNA之间。
第十五章 核酸的物理化学性质和研究方法答案法答案
第十五章核酸的物理化学性质和研究方法答案一．选择题1-7 ③③②④①④二．判断题1-4是否否否5-9 是是是是是三．名词解释cot：是DNA复性的动力学常数，数值上等于单链DNA初始浓度Co和复性完成一1.12半所需时间的乘积，其大小代表DNA顺序的复杂程度。
2 增色效应：由于DNA变性引起的光吸收增加称增色效应,也就是变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。
四．问答题1、RNA比DNA更不稳定，为什么？RNA的磷酸酯键易被碱水解，因为RNA的核糖上有2 ’-OH,在碱作用下形成磷酸三酯，磷酸三酯极不稳定，随即水解产生核苷2’，3’-环磷酸酯。
该环磷酸酯继续水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸。
DNA的脱氧核糖没有2 ’-OH，不能形成碱水解的中间产物，故对碱有一定抗性。
2、何谓变性？是否所有能引起蛋白质变性的因素都能引起核酸变性，或者引起核酸变性的因素都能引起蛋白质变性？变性作用是指核酸双螺旋结构被破坏，双链解开，从而核酸的天然构象和性质发生改变，但共价键并未断裂。
3、何谓Southern杂交？何谓Northern杂交？它们的原理和用途是什么？Southern杂交是将凝胶电泳分开的DNA限制片段转移到硝酸纤维膜上进行杂交。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。
该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA 指纹分析和PCR产物判断等研究中。
Northern杂交将变性的RNA转移到硝酸纤维膜上，通过分子杂交以检测特异的RNA。
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
4、琼脂糖凝胶电泳对核酸研究有何用途？分离DNA分子大小从上百kb到数百bp, 凝胶电泳后可以用嵌合荧光染料显色，凝胶电泳后核酸样品可用多种方法自凝胶上回收。
05-核酸化学(5-6)
一、人类基因组计划
采取的测序方法：多级散弹测序法 一、人类基因组计划
2003年4月l4日，美、英、日、德、法、中六国首 脑发表了“人类基因组联合宣言”，宣告“人类基 因组计划”提前完成。
一、人类基因组计划
• 2002,12,18日，水稻 基因组由中国领衔完 成。
三、核酸的分析 1．定磷法 2．紫外法 3．荧光分析法 4．共振光散射分析法 5．电化学分析法
三、核酸的分析
纯DNA的OD260/280≥1.8。 纯RNA OD260/280≥2.0，如果样品中含有杂 蛋白，比值会明显下降。 如果OD260/230≥1.8时样品是纯的，否则样 品中含有杂多糖。通常1.0 OD相当于 50μg/mL的双螺旋DNA或 40 μg/mL单链 DNA（或RNA）。 紫外法
Tm值的大小与下列因素有关： （1）DNA的均一性 （2）G-C含量 （3）介质中的离子强度
5．熔解温度
（1）DNA的均一性：一般均一性越高，Tm值的变 动范围越小。
（2）G-C含量：G-C含量越高，Tm值越大，Tm与GC含量成正比关系。因为G-C比A-T更稳定（氢键）。 Tm与所含G-C的多少的关系，可用经验公式计算不 同DNA的Tm：
一、人类基因组计划
1989年美国成立“国家人类基因组研究中心 ”。诺贝尔奖金获得者J.Waston出任第一任 主任。 1990年，历经5年辩论之后，美国国会批准美 国的“人类基因组计划”于10月1日正式启动 。美国的人类基因组计划总体规划是：拟在 15年内至少投入30亿美元，进行对人类全基 因组的分析。
一、人类基因组计划
2007年10月11日，我国科学家成功绘制出第一个 完整中国人基因组图谱（炎黄一号），这也是第 一个亚洲人全基因序列图谱。 2008年10月11日，我国科学家成功绘制出大熊猫 晶晶的基因组序列。 玉米、水稻、猪、家蚕等生物的DNA全序列也被陆 续测定，目前科学家的研究中心开始转移到对基因 组的功能研究上，产生了基因组学这一新的学科。
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Cot ½ 是指复性完成一半时的Cot值。
根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数
分子杂交
不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有 碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核 酸分子杂交（hybridization）制备特定的探针（probe） 通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。实例： southern印迹法
DNA的Tm一般在82—95℃之间
2 影响DNA的Tm值的因素
① DNA均一性 。
均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性 。
② G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。 G-C%=（Tm-69.3）×2.44
③ 介质中离子强度 离子强度高，Tm高。
三 核酸的复性
在一定条件下，变性DNA 单链间碱基重新配对恢 复双螺旋结构，伴有A260减小（减色效应）,DNA的 功能恢复。
DNA的复性历程
★ 热变性DNA在缓慢冷却时可以 复性，快速冷却不能复性。
★ DNA片段越大，复性越慢； ★ DNA浓度越大，复性越快。 ★ 复性速度可用Cot衡量。
Cot 是Co 与 t 的乘积，Co 为变性DNA（复性前） 的原始浓度，以摩尔浓度（mol/L）表示，t为复性 时间，以秒（s）表示。
部分双螺旋解开
无规则线团
DNA的变性过程
链内碱基配对
★ 变性因素 ：
热变性 酸碱变性（pH小于4或大于11） 变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）
★ 变性后的理化性质 ：
260nm吸收值升高。 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。
★ DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很 窄的温度范围内。
分子脂糖电泳
Southern 印迹法
带有DNA片 段的凝胶
用缓冲液 转移DNA
转移至硝酸纤维素膜上
凝胶 滤膜
与放射性标记 DNA探针杂交
吸附有DNA 片段的膜
放射自显影
四 核酸的水解
酸水解 碱水解 酶水解
核酸的酶水解
核酸酶的分类
（1）根据对底物的 专一性分为
非专一性核酸酶类
外切核酸酶对核酸的水解位点
BBBBBBBB
5´ p
p
p
p
p
p
p
p
OH 3´
牛脾磷酸二酯酶
（ 5´端外切5得3）
蛇毒磷酸二酯酶
（ 3´端外切3得5）
可作用于RNA 或 DNA
第二节 核酸研究的技术和方法
一 DNA的化学合成：
合成方向：3’ → 5’端 5’-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。 3’-OH用氨基亚磷酸化合物活化 碱基上氨基用苯甲酸保护
★ 含量计算
1 A260（OD260）值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸
★ 判断DNA是否变性
在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）
二 核酸的变性
核酸的变性是指核酸受到加热、极端的pH或离子强度的降低等 因素或特殊的化学试剂的作用，其双螺旋区的氢键断裂，变成 单链的过程，其中并不涉及共价键断裂。
Pu ：嘌呤
Py：嘧啶
限制性内切酶
原核生物中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中4-8个碱基 对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列，并在此序 列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类 酶称为限制性内切酶（ristriction endonuclease）。
限制性内切酶的命名和意义
二 核酸的分离、纯化和定量
◇ 尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。 ◇ 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 ◇ 抑制核酸酶。
DNA分离纯化
真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液 （1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/LNaCl）， 据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开， 提取出DNP。 DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇 去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀
第一节 核酸的性质
一 核酸的紫外吸收
DNA的紫外吸收光谱
1 天然DNA 2 变性DNA 3 核苷酸总吸收值
最大吸收峰为260 nm
3
0.
2
4
1
光 吸
0. 3
收
0.
2
0. 1
220 240 260 280
波长（nm）
核酸紫外吸收光谱的应用
★ 鉴定纯度
纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。
例：Eco R I，这是从大肠杆菌（Ecoli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶
Eco R I
属名 种名 株名 序号
★限制酶的命名：E.coRI
第一位： 属名E（大写） 第二、三位：种名的头两个字母小写co 第四位： 菌株R 第五位： 从该细菌中分离出来的这一类酶的编号
限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限 制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外 重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀， 用来解剖纤细的DNA分子。
核糖核酸酶(RNase) 脱氧核糖核酸酶(DNase)
非特异性核酸酶
核酸内切酶 （2）根据切割位点分为 核酸外切酶
内切核酸酶对RNA的水解位点示意图
Py Pu Py Py G A C U G A
1´
p
p
p
p
p
p
p
p
p
p
OH
5´
3´
RNAase I RNAase I RNAase T1
RNAase T1
A260
1 .4 100%
1 .2
1 23
1 .0 60
T 80 T m t \ 0mC
T 100 m
某些DNA的Tm值
Poly d(A-T) DNA
1
2
Poly d(G-C) 3
熔解温度（Tm）
浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完 全变性（单链）A260= 1.37当A260增加到最大 增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。
★ 增色效应与减色效应
增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大 减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。
1 Tm：熔解温度（melting temperature）
DNA 的 变 性 发 生 在一个很窄的温度 范围内，通常把热 变 性 过 程 中 A260 达 到最大值一半时的 温 度 称 为 该 DNA的 熔解温度，用Tm表 示。