紫外分光光度法测定核苷酸含量

数据处理
第一组： 试管 标准DNA溶液 （ml） 蒸馏水（ml） A260
1 0 5 0 2 3 0.1 0.2 4.9 4.8 0.027 0.053 260 0.323 4 5 0.4 0.6 4.6 4.4 0.121 0.170 270 0.264 6 7 0.8 1 4.2 4 0.255 0.324 290 0.081
λ
（nm）
A
240 0.178
250 0.225
280 0.185
λ
m
260 试管 1 2 3 4 5 6 7 A260 0 0.027 0.053 0.121 0.170 0.255 0.324 试管8对应于标准DNA溶液的毫升数V 1.9ml
待测的DNA溶液的浓度（μg/ml） 由公式V*100/5计算 待测DNA溶液的A260/A280 待测的DNA溶液是否纯净
38 μg/ml 1.8 不纯净
第二组： 试管 1 标准DNA溶液 （ml） 0 蒸馏水（ml） 5 A260 0 λ（nm） A λm 240 0.177
2 3 4 5 6 7 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4 0.040 0.069 0.132 0.210 0.264 0.309 260 0.309 270 0.256 260 280 0.171 290 0.080
2.取样器：参见实验一，10uL、200uL各1支/组。

使用指南：接好套头（不漏气）→通过旋钮调节容量（如500表示5mL） →用活塞第一挡吸液→用活塞第一挡和第二挡放液→换套头→继续使用。 注意，平时取样器应挂在架子上，绝不可倒置，以免溶液倒流入枪体中 而损坏仪器。
3.其他器材：试管，试管架、烧杯、卫生纸。
250 0.265
试管8对应于标准DNA溶液的毫升数V 待测的DNA溶液的浓度（μg/ml） A260/A280 待测的DNA溶液是否纯净
1.91ML 38.1 1.76 不纯净
第三组： 试管 1 2 3 4 5 6 7 标准DNA溶液 （ml） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 蒸馏水（ml） 5 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4 A260 0 0.036 0.064 0.120 0.173 0.262 0.298 λ（nm） 240 250 260 270 280 290 A 0.174 0.268 0.298 0.259 0.167 0.079 λm 260 试管8对应于标准DNA溶液的毫升数V 1.97ML 待测的DNA溶液的浓度（μg/ml） 39.4 A260/A280 1.77 待测的DNA溶液是否纯净 不纯净
的DNA溶液，其A260/A280≥1.8。
实验原理

如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚 多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液(20～ 50mg/mL)，在紫外分光光度计上直接测定。

蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常
蛋白质的吸收高峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为
核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对 核酸的紫外测定影响不大。

RNA在260nm与280nm处的吸收比值在2.0以上，DNA的
比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时，比值即下 降。
实验器材

1.UV-1000型紫外可见分光光度计
操作指南： 1. 打开仪器电源，系统自检，并预热20min。 2. 选择“光度测量”，按“enter”进入吸光度测量。 3. 关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中， 按“enter”进入后，系统自动调整投射比为100% 和0%。 4. 关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中， 按“zero”键调使吸光度A为0.000。 5. 测量样品。将被测溶液推入光路中，待读数稳定 后，读取吸光度。 6. 仪器使用完毕，取出比色皿，洗净、晾干。 7. 关闭电源开关，拔下电源插头，复原仪器。 8. 登记《仪器使用记录表》
值约为0.020，每毫升含1mgRNA溶液的光吸收值为 0.022。故测定待测浓度RNA或DNA溶液260nm的光吸 收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便， 迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能
吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法事
先除去。纯净的RNA溶液，其A260/A280≥2；纯净


关于比色皿：比色皿的前后有2 个光滑面，是用来对准光路的， 左右有2个粗糙面，手只能拿比 色皿的粗糙面，不能接触光滑 面。比色皿的内部的清洗只能 用蒸馏水润洗（用洗瓶），不 可用卫生纸或其他物品捅进去 擦洗，比色皿的2个光滑面一定 要保持清洁，如发现有指纹或 残液，须用卫生纸轻轻擦拭干 净。比色皿是成套发放的，严 禁混用，本实验使用的是石英 比色皿。使用完毕后先用自来 水内外冲洗干净比色皿，再用 洗瓶冲洗比色皿的内外表面1次， 将其粗糙面朝下斜靠在培养皿 中。
实验试剂 1. 2.
Baidu Nhomakorabea
蒸馏水 待测的DNA溶液
样品测定：

1. 取两个比色皿，一个加蒸馏水做空白对照。一个 用来加DNA样品。 2. 取10uL的DNA样品, 加入90uL的蒸馏水稀释10 倍。进行测定含量。
4． 清洁紫外分光光度计（尤其是比色槽内）、清 洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂。
思考题





1.若样品中含有蛋白质，应如何排除干扰？ 答：当样品中蛋白质含量较高时，将样品移到试管中，加入一定量的吸 烟溶液，用玻璃棒小心搅拌，使蛋白沉淀，滴加少量25%sos溶液边加 边轻轻搅拌，加完后，在60C水溶中保温10min并不停搅拌，取出过滤 即可 2.紫外吸收法测定核苷酸的原理？ 答：核苷酸及衍生物具有共轭双键具有紫外吸收效果 3.如果手接触了石英比色皿的光面而没有被擦净会导致什么误差，为什 么？ 答：误差变大，因为手中含有污渍会黏在表面，影响透光 4.如果换波长后不用空白样来调“0%”和“100%”，直接测定，会导致什 么结果？ 会导致所测结果为0，而测量的空白样为负值
生物化学实验： 核酸的紫外扫描及含量测定
实验目的
1.了解紫外分光光度计的基本原理并掌
握其使用方法。 2.掌握使用紫外分光光度法测定核酸含 量的原理和方法。
实验原理

核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，具有 紫外吸收。RNA和DNA的紫外吸收峰为260nm。一般
在260 nm波长下，每毫升含1mg DNA溶液的光吸收