紫外分光光度法测定核苷酸含量
紫外-可见分光光度法在核酸分析中的应用
紫外-可见分光光度法在核酸分析中的应用摘要综述紫外-可见分光光度法测定核酸总量的方法，总结紫外-可见分光光度法研究核酸与小分子之间的相互作用机理。
文中选用上海元析UV6100A紫外可见分光光度计通过实验进行研究！关键词核酸紫外可见分光光度法小分子1. 引言核酸是遗传信息的载体，在生物的生长、发育及繁殖等生命过程中起着十分重要的作用。
它是以核苷酸为基本组成的生物信息大分子。
天然存在的核酸可以分为脱氧核糖核酸(DNA) 和核糖核酸(RNA) 两大类。
1953年watson和crick [1]提出DNA的双螺旋结构模型，从分子水平上阐述了生命遗传信息通过DNA的半保留复制进行代代遗传的机理，从此生物学进入了分子生物学的新时代。
核酸在酶的催化作用下水解为核苷酸。
核苷酸完全水解可释放出等量的含氮碱基、戊糖和磷酸。
构成核苷酸的五种碱基分别为腺嘌呤(adenine, A），鸟嘌呤(guanine, G），胞嘧啶(cytosine, C），胸腺嘧啶(thymine, T）和尿嘧啶(uracil, U)。
其中，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶存在于DNA和RNA分子中，胸腺嘧啶仅存在于DNA分子中，尿嘧啶仅存在于RNA分子中。
DNA存在于细胞核和线粒体内，携带遗传基因，决定着细胞和个体的遗传性；RNA存在于细胞质、细胞核和线粒体中，参与遗传信息的复制和表达[2]。
因此，它在生命科学的研究中有着无与伦比的重要，其测定具有重要意义。
核酸是遗传信息的载体，是基因表达的物质基础。
核酸在生物的生长、发育及繁殖等生命过程中起着十分重要的作用。
许多药物小分子能与核酸发生相互作用，破坏其模板作用，使核酸链断裂，进而影响基因调控和表达功能[3]。
从生物学角度来看，DNA的化学环境就是指DNA周围存在的小分子化合物，研究这些小分子物质与DNA的相互作用，对于认识小分子物质的活性及药物、污染物或毒物在生物体内的作用机理有着极其重要的意义。
早在60年代，意大利、法国、日本及美国的一些实验室就开展了有关DNA。
实验九紫外分光光度法测定核酸的含量
学会使用紫外分光光度计进行核酸含量测定
操作步骤
准备标准品、未知样品和空白对照；按照仪器操作说明调整波长、设置测量模 式；将标准品和未知样品分别放入样品池；记录吸光度值；根据标准品的标准 曲线计算未知样品的核酸含量。
02
核酸在260nm波长处有最大吸收 峰，这是核酸特有的吸收峰，可 用于核酸的定量分析。
核酸的紫外吸光度与浓度的关系
随着核酸浓度的增加，吸光度也相应 增加。
在一定浓度范围内，吸光度与核酸浓 度呈线性关系，可以用于定量分析。
核酸含量计算公式及注意事项
核酸含量计算公式：核酸浓度（μg/mL） = (A / V) / (1000 × L) × (100 / S)
其中，A为吸光度值，V为样品体积（mL），L 为光程（cm），S为核酸分子截面积 （cm²/μg）。
注意事项
实验过程中要保持光程一致，以减小 误差。
实验过程中要避免样品污染，以免影 响实验结果。
对于不同来源和性质的核酸样品，可能需要采 用不同的实验条件和标准曲线进行定量分析。
03
实验步骤
样品制备
实验结论
根据实验结果和分析，得出实验结论，总结实验的成功与不足之处， 并提出改进意见和建议。
05
实验总结
实验收获与体会
学会了使用分光光度计进行实验 操作。
认识到实验操作对结果准确性的 影响。
01
02
掌握了紫外分光光度法测定核酸 含量的原理和方法。
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04
了解了核酸在紫外光下的吸收特 性。
DNA浓度与纯度的紫外分光光度计法分析
DNA浓度与纯度的紫外分光光度计法分析项⽬三：DNA浓度与纯度的紫外分光光度计法分析⼀、实验⽬的学习利⽤紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，掌握浓度和纯度的计算⽅法和实验操作技术。
⼆、实验原理组成核酸的碱基(G, A, T, C）在260 nm处具有强吸收峰，所以通过测定260 nm的吸收峰即可对DNA进⾏定量。
但有时也会因为所处溶液的pH值不同⽽导致吸光系数的不同，因此，⼀般在中性pH值左右的环境中进⾏测定。
这种⽅法常⽤于测定⽐较纯的样品。
核酸样品中最常有的其它吸光物质为蛋⽩质，由于蛋⽩质在280 nm处具有强吸收峰，因此测定A260/A280⽐率，可以判断DNA的纯度。
纯化的DNA及RNA的A260/A280 ⽐值应分别接近1.8 及2.0，当溶液中含有蛋⽩质时，会造成A260/A280 ⽐值降低。
计算原溶液的浓度（A）：A260×转换因⼦×稀释因⼦= 原溶液DNA浓度(µg/ml) 每吸光单位转换因⼦：双股DNA为50 µg/ml；单股DNA或RNA为40 µg/ml计算原溶液的摩尔数（以500 bp⼤⼩的DNA⽚段为例）：每个脱氧核苷酸的平均分⼦量近似为324.5，因此分⼦量=500×324.5=162250摩尔浓度(mol/L)=A/162250×1000三、实验仪器1、紫外-可见分光光度计2、移液器16套（每2⼈1套）四、实验材料1、⽆菌枪头20 µL各2⽀；2、离⼼管五、实验试剂1、⽆菌⽔2、待测DNA溶液五、实验步骤1、取标准λDNA，稀释，待⽤。
2、制作标准曲线（教师完成！）3、取实验⼀提取的基因组DNA，稀释50倍后待⽤。
4、测定A260和A2805、计算DNA浓度、纯度紫外吸收检测DNA浓度与纯度2007年11⽉13⽇星期⼆11:40⽬的：了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理，掌握测定⽅法。
原理：核酸的最⼤吸收波长为260nm，蛋⽩质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50µg/ml，单链寡核苷酸的含量为30µg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的⽐值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。
紫外分光光谱法和化学法测定核酸含量
紫外吸收光谱法及化学法测定核酸含量
实验原理
o 核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌 呤、嘧啶碱基具有共轭双健（C＝CC＝C ），能够强烈吸收250～280nm波长的紫 外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸 收值在260nm左右。核酸、核苷酸及其衍 生物分子组成中都含有这些碱基，因而具有 吸收紫外光的作用。遵照LambertBeer定 律，可以从紫外吸收光谱的变化来测定核酸 类物质的含量。
o 当已知ε（p）时，只要将被测核酸溶液在紫外分 光光度计260nm波长处，通过光径为1cm的比色 杯，测得OD值，即可测得该核酸溶液的浓度。 o 现已知RNA的ε（p）在260nm（pH7）时为 7700～7800，RNA的磷含量约为9.5%。因此， 每毫升溶液（中性）含1μg的RNA钠盐，在 260nm波长处通过光径为1cm的比色杯时的光密 度相当于0.020～0.024
o 化学法DNA含量的的原理： o DNA在强酸条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核 糖 之间的糖苷键断裂。生成嘌呤碱、脱氧 核糖和脱氧嘧啶核苷酸。脱氧核糖在酸性条 件下脱水生成酮基戊糖，后者与二苯胺在酸 性条件下生成蓝色物质，在597nm波长处 有最大吸收。
实验器材
o 紫外分光光度计
实验方法
o 1．碱基、核苷、核苷酸的定性测定 o 现在已经知道碱基、核苷、核苷酸在一定pH值时 有4个特定的紫外光吸收值（光密度）的比值是固 定的。要鉴别测得的未知样品中这些成分，只要测 定它们在一定pH条件下如下几个特定波长 （250nm，260nm，280nm，290nm）紫外光 的吸收值（光密度），然后根据其光密度比值 （250nm/260nm，280nm/260nm， 290nm/260nm）即可鉴别碱基、核苷和核苷 酸。
紫外分光光度法测定核酸的含量的实验
紫外分光光度法测定核酸的含量的实验紫外分光光度法测定核酸的含量核酸是核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分，根据核酸的物理和化学性质，应用一种简便、快捷、准确的方法，达到测定核酸含量的目的。
1：元素分析表明，RNA 含磷量平均为9.4%，DNA 含磷量平均为9.9％，由此可以推导出核酸质量约为其含磷量的11倍，因此可从测得的核酸样品的含磷量计算核酸的含量。
2：DNA 、RNA 分子在强酸作用下降解的糖，再与浓酸、酚或胺生成的有色化合物，其颜色深浅与核酸含量呈正比，因此通过比色法可测得核酸的含量。
3：核酸分子中的共轭π键具有紫外吸收性质，核酸溶液的吸收度与核酸的浓度呈正比，可用作定量测定。
常用紫外可见分光光度计进行测定，分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。
它是带状光谱，反映了分子中某些基团的信息。
可以用标准光图谱再结合其它手段进行定性分析。
按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称紫外-可见分光光度法。
1. 材料和方法1.1 材料1.2 核酸样品DNA1.3 方法1.3.1 实验器材和试剂器材：分析天平、离心机、容量瓶、紫外分光光度计、吸管试剂：氨水、钼酸铵-高氯酸、1.3.2 实验步骤当待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，在测定时需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm 处光密度作为对照。
(1)取2 支离心管，每管各加入2mL 待测的核酸溶液，再向甲管内加2mL 蒸馏水，向乙管内加2mL 沉淀剂。
混匀，在冰浴(或冰箱)中放置10min ，3 000r/min 离心10min 。
将甲、乙两管清液分别稀释至光密度在0.1~1.0 之间。
选用光程为1cm 的石英比色杯，在260nm 波长下测其光密度OD 260nm 。
1.3.3计算260nm 260nm /0.02OD OD DNA g m μ-? 甲乙含量（）稀释倍数 2 实验结果计算实验结果3 讨论因为蛋白质含有芳香族氨基酸，故也能吸收紫外光，通常吸收峰在280nm 处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，若样品中蛋白质含量较低时对核酸紫外测定影响不大，若蛋白质含量较高时，会影响核酸含量的测定，故应去除蛋白质的干扰。
核酸浓度测定
核酸的定量与纯度的测定在分子生物学实验中，核酸提取需要进行其纯度和浓度的测定。
目前实验室常用的测定方法主要有分光光度法、荧光染料法、PCR法和杂交定量法等。
分光光度法分光光度法主要包括紫外分光光度法、定糖定磷法及基于酶催化的核酸定量方法等。
（1）紫外分光光度法紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm 处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。
因此，可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA，单链DNA浓度约为33µg / ml，RNA约为40μg/ml，寡核苷酸约为35μg/ml。
如用1cm光径，用H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数/1000。
A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。
假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或分类物质的污染，需要纯化样品。
比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。
A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。
若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。
A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。
假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
实验步骤1、将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中pH8.0，10mmo1/L的Tris缓冲液，内含(1mmol/L EDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。
实验测定核酸含量——紫外分光光度法
实验测定核酸含量——紫外分光光度法Experiment Report生化实验级班学号Subject Specialty Grade Name Date实验测定核酸含量——紫外分光光度法一.实验目的：学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
二.实验原理：DNA和RNA都具有紫外吸收的性质，它们的紫外吸收高峰在260nm处。
其紫外吸收特性是由于它们含有的嘌呤环和嘧啶环中的共轭双键系统的特性所决定的。
蛋白质分子中含有Trp、Phe、Tyr等有共轭双键系统的氨基酸，因此对紫外光在280nm处有吸收高峰，而在260nm处的吸收仅为核酸的1/10。
纯核酸260nm与280nm吸收的比值RNA应为2.0，DNA为1.8以上。
核酸分子中无论DNA还是RNA，主链结构单一，呈现磷酸-核糖（脱氧核糖）的重复。
由此通过测定核酸分子中磷的含量便可以基本确定核酸的含量。
进而求出摩尔磷消光系数ε（P）来表示溶液中的核酸含量：ε(P)=A260nm/CL注：A260nm：为260nm处光吸收值；C：为每升溶液中磷的摩尔数；L：为比色杯内径由于C=每升溶液的重量（W）/30.98，所以ε(P)=30.98×A260nm/WL天然DNA的ε（P）为～6600；RNA的ε（P）为7700～7800。
磷在DNA中占9.9%，在RNA中占9.5%。
1μg/mlDNA溶液的光吸收值为0.020，1μg/mlRNA溶液的光吸收值为0.022。
因此在260nm 处测的未知样的光吸收值即可求出其含量。
通常以A值为1相当于50μg/ml双螺旋DNA，或40μg/ml单链DNA（或RNA），或20μg/ml寡核苷酸计算。
这个方法既快速，又相当准确，而且不会浪费样品。
三.仪器使用：752型紫外可见分光光度计：在指定波长下，将机器预热20min，以参比液作空白，开盖调节透光率T值为0%；盖盖调节透光率T值为100%，转换功能键至A后，测定样品光吸收值。
含有核苷酸的核酸-紫外分光光度法测定
含有合核苷酸杂质的核酸含量测定凡文一、原理：DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。
吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核苷酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用E（P）来表示，E（P）为每升溶液中含有一摩尔原子核酸磷的消光值（即光密度或称光吸收）。
RNA的E（P）260 nm（pH7）为7700—7800。
RNA的含磷量约为9.5%，因此每毫升溶液含1微克RNA的光密度值相当于0.022—0.024。
小牛胸腺DNA钠盐的E（P）260 nm（pH7）为6600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1微克DNA钠盐的光密度值为0.020。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。
通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。
RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。
当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。
具体如下：DNA样品：OD260/OD280≈1.8 DNA纯净＞1.9 RNA含量高＜1.7 蛋白质含量高RNA样品：OD260/OD280≈2.0 RNA纯净＞2.2 RNA已降解＜1.7 蛋白质含量高钼酸铵-过氯酸能够与核酸作用形成沉淀，通过离心可以将其沉淀到离心管底部，上清液的OD260反映出核苷酸的含量。
（也可以采用酸性乙醇进行沉淀核酸，详细方法原理参见参考资料[3]）二、器材与试剂：1．器材：容量瓶（50毫升）、离心管、离心机、紫外分光光度计、石英比色皿、微量移液枪、1.5ml Eppendorf管、枪头（灭菌）、烧杯。
2．试剂：①钼酸铵-过氯酸沉淀剂[0.25%钼酸铵-2.5%过氯酸溶液]：取3.6毫升70%过氯酸和0.25克钼酸铵溶于96.4毫升蒸馏水中。
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2.取样器：参见实验一，10uL、200uL各1支/组。
使用指南：接好套头（不漏气）→通过旋钮调节容量（如500表示5mL） →用活塞第一挡吸液→用活塞第一挡和第二挡放液→换套头→继续使用。 注意，平时取样器应挂在架子上，绝不可倒置，以免溶液倒流入枪体中 而损坏仪器。
3.其他器材：试管，试管架、烧杯、卫生纸。
关于比色皿：比色皿的前后有2 个光滑面，是用来对准光路的， 左右有2个粗糙面，手只能拿比 色皿的粗糙面，不能接触光滑 面。比色皿的内部的清洗只能 用蒸馏水润洗（用洗瓶），不 可用卫生纸或其他物品捅进去 擦洗，比色皿的2个光滑面一定 要保持清洁，如发现有指纹或 残液，须用卫生纸轻轻擦拭干 净。比色皿是成套发放的，严 禁混用，本实验使用的是石英 比色皿。使用完毕后先用自来 水内外冲洗干净比色皿，再用 洗瓶冲洗比色皿的内外表面1次， 将其粗糙面朝下斜靠在培养皿 中。
数据处理
第一组： 试管 标准DNA溶液 （ml） 蒸馏水（ml） A260
1 0 5 0 2 3 0.1 0.2 4.9 4.8 0.027 0.053 260 0.323 4 5 0.4 0.6 4.6 4.4 0.121 0.170 270 0.264 6 7 0.8 1 4.2 4 0.255 0.324 290 0.081
λ
（nm）
A
80 0.185
λ
m
260 试管 1 2 3 4 5 6 7 A260 0 0.027 0.053 0.121 0.170 0.255 0.324 试管8对应于标准DNA溶液的毫升数V 1.9ml
待测的DNA溶液的浓度（μg/ml） 由公式V*100/5计算 待测DNA溶液的A260/A280 待测的DNA溶液是否纯净
的DNA溶液，其A260/A280≥1.8。
实验原理
如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚 多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液(20～ 50mg/mL)，在紫外分光光度计上直接测定。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常
蛋白质的吸收高峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为
实验试剂 1. 2.
蒸馏水 待测的DNA溶液
样品测定：
1. 取两个比色皿，一个加蒸馏水做空白对照。一个 用来加DNA样品。 2. 取10uL的DNA样品, 加入90uL的蒸馏水稀释10 倍。进行测定含量。
4． 清洁紫外分光光度计（尤其是比色槽内）、清 洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂。
38 μg/ml 1.8 不纯净
第二组： 试管 1 标准DNA溶液 （ml） 0 蒸馏水（ml） 5 A260 0 λ（nm） A λm 240 0.177
2 3 4 5 6 7 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4 0.040 0.069 0.132 0.210 0.264 0.309 260 0.309 270 0.256 260 280 0.171 290 0.080
值约为0.020，每毫升含1mgRNA溶液的光吸收值为 0.022。故测定待测浓度RNA或DNA溶液260nm的光吸 收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便， 迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能
吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法事
先除去。纯净的RNA溶液，其A260/A280≥2；纯净
250 0.265
试管8对应于标准DNA溶液的毫升数V 待测的DNA溶液的浓度（μg/ml） A260/A280 待测的DNA溶液是否纯净
1.91ML 38.1 1.76 不纯净
第三组： 试管 1 2 3 4 5 6 7 标准DNA溶液 （ml） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 蒸馏水（ml） 5 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4 A260 0 0.036 0.064 0.120 0.173 0.262 0.298 λ（nm） 240 250 260 270 280 290 A 0.174 0.268 0.298 0.259 0.167 0.079 λm 260 试管8对应于标准DNA溶液的毫升数V 1.97ML 待测的DNA溶液的浓度（μg/ml） 39.4 A260/A280 1.77 待测的DNA溶液是否纯净 不纯净
思考题
1.若样品中含有蛋白质，应如何排除干扰？ 答：当样品中蛋白质含量较高时，将样品移到试管中，加入一定量的吸 烟溶液，用玻璃棒小心搅拌，使蛋白沉淀，滴加少量25%sos溶液边加 边轻轻搅拌，加完后，在60C水溶中保温10min并不停搅拌，取出过滤 即可 2.紫外吸收法测定核苷酸的原理？ 答：核苷酸及衍生物具有共轭双键具有紫外吸收效果 3.如果手接触了石英比色皿的光面而没有被擦净会导致什么误差，为什 么？ 答：误差变大，因为手中含有污渍会黏在表面，影响透光 4.如果换波长后不用空白样来调“0%”和“100%”，直接测定，会导致什 么结果？ 会导致所测结果为0，而测量的空白样为负值
核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对 核酸的紫外测定影响不大。
RNA在260nm与280nm处的吸收比值在2.0以上，DNA的
比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时，比值即下 降。
实验器材
1.UV-1000型紫外可见分光光度计
操作指南： 1. 打开仪器电源，系统自检，并预热20min。 2. 选择“光度测量”，按“enter”进入吸光度测量。 3. 关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中， 按“enter”进入后，系统自动调整投射比为100% 和0%。 4. 关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中， 按“zero”键调使吸光度A为0.000。 5. 测量样品。将被测溶液推入光路中，待读数稳定 后，读取吸光度。 6. 仪器使用完毕，取出比色皿，洗净、晾干。 7. 关闭电源开关，拔下电源插头，复原仪器。 8. 登记《仪器使用记录表》
生物化学实验： 核酸的紫外扫描及含量测定
实验目的
1.了解紫外分光光度计的基本原理并掌
握其使用方法。 2.掌握使用紫外分光光度法测定核酸含 量的原理和方法。
实验原理
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，具有 紫外吸收。RNA和DNA的紫外吸收峰为260nm。一般
在260 nm波长下，每毫升含1mg DNA溶液的光吸收