鸡马立克氏病病毒(MDV)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书
马立克氏病
注：本版本在2010年5月被OIE世界代表大会采用马立克氏病概要马立克氏病（MD)是由疱疹病毒引起的家禽的一种淋巴瘤性和神经性疾病，可通过临床症状和宏观或微观的病变进行诊断。
鸡可以被MDV持续感染而不出现临床症状。
MDV的感染可通过病毒分离及抗原或抗体演示方法检测。
MD可通过接种疫苗进行防治，包括各种类型的单价或多价活病毒疫苗。
疫苗在卵期或在孵化时注射。
在鸡群中，MD发生在3~4周或更大日龄的鸡中，并且通常大多发生在12~30周龄。
观察到的临床症状主要是腿和翅膀的瘫痪，伴随外周神经的肿大，但有时看不见涉及神经的病变，特别是在成年鸡中。
高致病性的MDV毒株也许可引起1~2周雏鸡死亡率增加，特别是雏鸡缺乏母源抗体时。
根据MDV株系不同，淋巴瘤可发生在不同部位，特别是在卵巢、肝脏、脾脏、肾脏、肺、心脏、前胃以及皮肤。
与禽白血病病毒引起的肿瘤由统一的细胞群组成不同，MDV导致的神经侵润和淋巴瘤由各种不同类型的淋巴细胞组成。
禽反转录病毒也可以引起与MDV类似的肿瘤，例如禽白血病病毒（ALV）、网状内皮组织增生病毒（REV），但MD与这些肿瘤的差异显著。
传播媒介的鉴定：自然条件下，大多数鸡在生命的第一周可被MDV感染，并且终身带毒，但通常不出现临床症状。
MDV感染经常通过接种上皮活细胞（live buffy coat cells)到单层培养的鸡肾细胞或鸭胚成纤维细胞上进行检测,两天内可见特异性的病毒噬斑形成。
MDV 有两种血清型分别被定义为是1型和2型，火鸡疱疹相关病毒（HVT）代表第三种血清型。
血清型2包含自然无毒力的病毒株，其中一些可用来研制疫苗。
在受病毒感染鸡的羽毛末梢利用PCR和放射性免疫沉淀反应实验可分别检测到MDV的基因组DNA以及病毒抗原（见下文）。
血清学实验：感染1~2周内可出现针对MDV的特异性抗体，通常可以用琼脂凝胶免疫扩散实验、间接荧光抗体实验，有时也可以应用酶联免疫吸附试验等其他免疫血清学方法进行检测。
免疫鸡群发生马立克氏病的原因初探
免疫鸡群发生马立克氏病的原因初探马立克氏病（MD）是由疱疹病毒引起的一种常见淋巴细胞组织增生性疾病。
此病的特点是病鸡的外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤单核细胞浸润，是一种淋巴瘤性质的肿瘤疾病，对养鸡业的危害十分严重。
近年来，随着马立克氏病毒（MDV）强毒株的出现，马立克氏病的发生似乎有增多的趋势。
接种过火鸡疱疹病毒疫苗的鸡群发病率一般仍以2%～15%的比例再次发病，甚至有的高达50%以上。
导致免疫鸡群发生MD的原因很多，现将有关原因综述如下。
1 母源抗体的干扰雏鸡特有的母源抗体能影响同种血清型MD疫苗的效果，母源抗体对MD弱毒株有中和作用。
用MD弱毒苗，对没有母源抗体的鸡群，防治MD超强毒株侵袭特别有效;若有母源抗体存在，这种保护力就会大大下降。
当前，鸡MD免疫都是在雏鸡出壳的当时进行的，其目的是尽早提前免疫，使弱毒疫苗首先占据易感器官、易感组织和细胞，以干扰强毒感染。
但雏鸡体内的母源抗体（特别是同源抗体）可中和一部分抗原，使抗体产生的免疫应答向后推迟，这是造成免疫失败的一个原因。
有试验证明：火鸡疱疹病毒疫苗（HVT）免疫效果不稳定，受母源抗体影响较大，免疫保护力时高时低，尤其是在污染较严重的鸡场或出现超强MDV的时候，即使是用进口的HVT疫苗，并提高其免疫剂量，免疫效果也不理想。
2 MDV超强毒株的出现当前，MD在我国流行广泛，发病率、死亡率比较高，危害十分严重。
我国加入WTO后，引进种鸡、种蛋的途径多，范围大，很难控制MD的侵入和蔓延。
随着MD的侵入，陆续出现了一些不能被火鸡疱疹病毒疫苗充分控制的MDV变异株，表明MDV具有突变能力。
有资料表明，从未接种过HVT疫苗的鸡群中，分离到了超强毒型MDV（VVMDV），并同属于血清型I，雏鸡感染时，会出现大量死亡，比强毒MDV要激烈得多。
在欧洲发现几株VVMDV，能使HVT对MD的防御能力遭到破坏，内脏肿瘤病变形成率远高于神经病变。
由此可以看出，由于MDV超强毒株的出现，给防疫工作带来了很大的困难，虽然我国已研制和生产出二价苗、三价苗，但是仍不能有效地抵御MD超强毒株的侵袭。
鸡马立克氏病免疫失败的原因及防治
鸡马立克氏病免疫失败的原因及防治日期:目录•鸡马立克氏病概述•鸡马立克氏病免疫失败的原因•防治鸡马立克氏病的措施•鸡马立克氏病的诊断与监测•鸡马立克氏病的预防和控制策略鸡马立克氏病概述鸡马立克氏病的定义•鸡马立克氏病（Marek's disease）是由鸡马立克氏病毒（Marek's disease virus, MDV）引起的一种禽类传染病。
该病主要侵害鸡的淋巴组织，引起鸡群免疫力下降，从而导致其他病原感染，给养鸡业带来严重的经济损失。
•鸡马立克氏病的临床症状主要分为四种类型：内脏型、神经型、眼型和皮肤型。
内脏型主要表现为精神不振、食欲减退、羽毛粗糙、消瘦和下痢等症状；神经型主要表现为步态不稳、偏瘫和昏迷等症状；眼型主要表现为视力下降、瞳孔变形、眼球炎症和失明等症状；皮肤型主要表现为皮肤炎症、脱毛和溃疡等症状。
鸡马立克氏病的临床症状•鸡马立克氏病的病理学特征主要包括淋巴组织病变和肿瘤形成。
淋巴组织病变主要表现为淋巴细胞坏死和淋巴滤泡增生，形成特征性的“玻璃样”细胞。
肿瘤形成主要表现为淋巴瘤的形成，肿瘤细胞异型性明显，核分裂象多见。
鸡马立克氏病的病理学特征鸡马立克氏病免疫失败的原因免疫接种时间过早或过晚，都会影响免疫效果。
免疫时间不当多次免疫间隔时间过短或过长都会导致免疫失败。
免疫间隔不合理同时使用两种或多种疫苗时，可能因为疫苗间的相互干扰导致免疫失败。
不同疫苗间的冲突免疫程序不合理不同厂家生产的疫苗质量可能存在差异，导致免疫效果不同。
疫苗在运输或保存过程中出现过期、受污染或效价降低等问题，导致免疫效果不佳。
疫苗保存不当疫苗生产厂家质量不一疫苗储存温度过高或过低，都会影响疫苗的效价和稳定性。
温度控制不当部分疫苗对光照敏感，长时间暴露在阳光下会导致效价降低。
光照影响接种方法不正确如饮水免疫时饮水器数量不足、注射免疫时注射部位不准确等，都会影响免疫效果。
接种时鸡群健康状况不佳鸡群处于亚健康状态或患病时，接种疫苗容易导致免疫失败。
鸡马立克氏病
十、预防MD应采取措施
克服母源抗体的干扰增加2-3个剂量；HVT+ACM；世代交替用 不同的疫苗株；选用二价或多价疫苗；首免2周后进行二 免。
严格遵守疫苗使用方法专用的稀释液；不混合注射和加抗生 素；1h内用完，冰箱内保存稀释疫苗；剂量准确；注射器 消毒。
病；肉仔鸡多在40日龄之后发病。 本病的发生与饲养管理条件有密切关系、无季节性。
四、临床症状
潜伏期1-3个月。 根据病变发生的主要部位和症状，可分为4种类型:内脏型、
皮肤型、神经型、眼型 内脏型多呈急性暴发，常见于幼龄鸡群，开始以大批鸡精神
委顿，食欲下降，明显消瘦为主要特征，几天后部分病鸡 出现共济失调，呆顿常缩颈蹲在墙角下。病鸡羽毛松乱无 光泽，皮肤苍白，排绿色稀便。部分病鸡死前无特征临床 症状，很多病鸡表现脱水、消瘦和昏迷。
尔马林、2%火碱将其灭活。
二、病 原
比较 致瘤性 引起动物早期死亡 引起免疫抑制 淋巴细胞增多 病毒血症 鸡胚感染 抗原的侵袭力 免疫能力 细胞培养
蚀斑 脱离细胞
1 +++
+ + + ++ + + + 鸡、鸭胚成纤维细胞 中等大小 细胞结合毒不能冻干
2 + + + + 鸡、鸭胚成纤维细胞 大 细胞结合毒不能冻干
九、MD免疫失败的原因
环境中存在强毒和超强毒株 雏鸡感染其他的疾病：如CAA,注射疫苗时带入其他
的病原菌（重要的是绿脓杆菌） 母源抗体的干扰 免疫剂量不足 免疫抑制因素：免疫系统疾病、饲养管理不善
十、预防MD应采取措施
严格保证疫苗的质量及运输过程中的保管：马立克氏病冻干 疫苗应冷藏于2～8℃的冰箱，细胞结合苗应保存于特制的 液氮罐中，疫苗稀释液应保存于低于27℃的条件下，如果 保存不当，就会使疫苗免疫失效。 正确选择疫苗的种类：祖代、父母代、商品代疫苗采用交 叉免疫种类；疫区选用多价苗、液氮苗
鸡马立克氏病
病原
• 3．血清型：MDV共分三个血清型，I型为强毒、 超强毒及其人工致弱株（CVI988，荷兰），2型 为天然无毒株（SB-1、301B/1），3型为火鸡疱 疹病毒（HVT） 。 • 4．致病性及免疫特点：主要是靠细胞免疫。 • HVT对火鸡有轻微致病性，对鸡无毒。可用作疫 苗。MDV及HVT属终身感染，因此属于带毒免疫。 HVT只能防止肿瘤的形成，但不能阻止MDV强毒 感染。
鸡马立克氏病 Marek’s Disease, MD
概 述
• 马立克氏病是由马立克病毒引起的鸡的一种淋巴 组织增生性疾病，即肿瘤和神经麻痹性传染病， 临床表现为外周神经及多种组织器官的单核细胞 浸润和肿瘤形成，病鸡消瘦，肢体麻痹或急性死 亡。 • 广泛存在于世界各地，传染性极强，危害极大， 由马立克氏发现，故名之。曾经给养鸡业造成毁 灭性打击。我国从70年代开始广泛流行，80-90 年代泛滥成灾，近一、二年因液氮苗用于防制， 故少发生。
诊断
• 实际诊断中常根据血液学检查和病理学特 征结合病原和抗体的检查来确诊。淋巴细 胞性白血病应注意与马立克氏病鉴别。 • 病原的分离和抗体的检测是建立无白血病 鸡群的重要手段（补体结合反应、 ELISA）。
• • • • • • • • •
病 名 马立克氏病（MD） 淋巴性白血病（LL） 发病日龄 4周龄以上 16周龄以上 临床症状 神经麻痹多见 无 虹膜混浊 多见 极少 病理变化 神经节肿大多见 无 皮肤、肌肉肿瘤 有 无 消化道肿瘤 常有 无 法氏囊病变 弥散性增生或萎缩结节状 肿瘤 病原核酸类型 DNA RNA
概 述
• 禽白血病是由禽C型反转录病毒群的病毒引 起的禽类多种肿瘤性疾病的统称，主要是 淋巴细胞性白血病，其次是成红细胞性白 血病、成髓细胞性白血病。此外还可引起 骨髓细胞瘤、结缔组织瘤、上皮肿瘤、内 皮肿瘤等。大多数肿瘤侵害造血系统，少 数侵害其他组织。 • 本病的危害主要为垂直传播，雏鸡免疫耐 受，对疫苗不产生免疫应答
一株鸡马立克氏病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析_张艳萍
＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ
鸡 马 立 克 氏 病 毒（Ｍａｒｅｋ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ， ＭＤＶ）是 一种细胞结合性疱疹病毒， 依据生物学特性分为血 清 １ 型、２ 型和 ３ 型共 ３ 个血清型。只有血清 １ 型 ＭＤＶ （ＭＤＶ１）具 有 致 病 力 或 致 瘤 性 。 该 型 的 致 病 力 差异很大， 从几乎无毒到最强毒都有， 依据致病力 进 一 步 分 为 ４ 个 病 理 型 ， 分 别 为 温 和 （ｍＭＤＶ）、 强 （ｖＭＤＶ）、超强（ｖｖＭＤＶ）和特超强（ｖｖ＋ ＭＤＶ）毒株 。 ［１￣３］ ＭＤＶ 毒 力 的 变 化 与 其 基 因 组 中 部 分 基 因 序 列 的 变 异 相 关 ， 研 究 表 明 ＭＤＶ 基 因 组 长 独 特 区 （ＵＬ） 两 侧 反 向 重 复 序 列 （ＩＲＬ 和 ＴＲＬ） 上 的 １３２ ｂｐ 重 复 序 列 、 ｍｅｑ 基 因 和 ３８ ｋｕ 磷 蛋 白 （ｐｐ３８） 基 因 等 与 ＭＤＶ 致 肿
Ａｂｓ ｔｒａｃｔ： Ａ Ｍａｒｅｋ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ （ＭＤ） ｖｉｒｕｓ （ＭＤＶ） ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ Ｊｉｌｉｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｔｈａｔ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｂｙ ｔｕｒｋｅｙ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ． Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ ａｄａｐｔｅｄ ｔｏ ｇｒｏｗ ｉｎ ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ （ＣＥＦ）． Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＰＦ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｔｙｐｉｃａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ＭＤ． Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｃａｕｓｅｄ ７６ ％ ａｎｄ ７２ ％ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ｉｎ ｕｎｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ａｎｄ ＨＶＴ－ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｃｈｉｃｋｅｎｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １３２ ｂｐ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｅｑ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅ ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏ ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ＭＤＶ ｓｔｒａｉｎｓ．
鸡马立克氏病的症状与防控 鸡马立克氏病的疫苗免疫 - 养鸡技术
鸡马立克氏病的症状与防控鸡马立克氏病的疫苗免疫-养鸡技术马立克氏病（MD）是鸡群中比较常见的传染性疾病而且是具有高度接触性的肿瘤疾病,病原是马立克氏病病毒（MDV）。
目前,只有马立克氏病可以通过疫苗免疫预防肿瘤产生,所以应该掌握鸡马立克氏病的诊断及疫苗免疫方法。
下面一起来具体了解一下：鸡马立克氏病的症状与防控鸡马立克氏病的疫苗免疫。
1、流行病学马立克氏病是由马立克氏病病毒( MDV)所引起的鸡的一种传染病。
鸡群感染本病可使养鸡场蒙受巨大的经济损失。
本病的主要特征是淋巴细胞浸润和增生，病鸡或隐性感染鸡可以长期带毒排毒，羽毛囊上皮细胞可复制具有感染力的完全病毒。
这种完全病毒对外界有极强的抵抗力。
病毒随皮屑和脱落的羽毛污染垫料、粪便、尘埃、空气等，并能在室温下存活4～6个月。
病毒通过空气经呼吸道感染。
健康鸡与病鸡直接与间接接触，也能受到感染。
2、症状和病理变化马立克氏病可分为神经型、内脏型、眼型和皮肤型。
神经型：多见病鸡步态不稳、运动失调，然后出现一侧或双侧性的瘫痪，如翅膀下垂，腿不能站立，呈一腿向前而一腿向后姿势。
内脏型：急性发作时，几周内可见进行性消瘦、脱水、昏迷，直至死亡。
眼型：虹膜褪色，瞳孔边缘不规则（呈锯齿状）、瞳孔变大。
皮肤型：皮肤上有肿瘤。
病理变化，肉眼可见周围神经及神经丛的病变，如腰荐神经、坐骨神经、肾神经、前肠系膜神经及内脏大神经等。
受侵害神经呈灰色或淡黄色、水肿样、失去横纹，比正常粗2～3倍；往往单侧受害，可检查对称部位，加以区别。
肿瘤可出现在卵巢、肝、脾，心、肾、肺、腺胃、肠、胰腺等内脏器官以及肌肉、皮肤等。
内脏的肿瘤尤为多见。
肝脾肿瘤可能呈弥散性，也可是结节状或单一的肿瘤。
肿瘤为灰白色，坚实，切面平滑。
腺胃变得钝厚而坚实。
心肾的肿瘤可为多个结节状或单个呈灰白色，凸出于表面。
卵巢无正常的叶状外表，被分叶的肿瘤所代替或呈菜花样。
肌肉肿瘤在胸肌中较为常见。
3、防控措施孵化室与育雏室应远离大鸡舍，并应处在上风位置。
鸡马立克氏病的诊断及疫苗免疫
鸡马立克氏病的诊断及疫苗免疫作者：李淑红，刘冬芝来源：《现代畜牧科技》 2016年第2期李淑红，刘冬芝（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨150069）摘要：随着我国养鸡业的蓬勃发展，并且越来越具规模，饲养者更加重视鸡只的引种工作，鸡群的饲养量逐年呈上升的发展趋势，但是有的饲养者并不能投入足够的人力、物力来展开对鸡群疫病的防控工作，而兽药市场还存在不规范的情况，导致如今禽病呈现更加复杂的发病趋势。
马立克氏病( MD)是鸡群中比较常见的传染性疾病而且是具有高度接触性的肿瘤疾病，病原是马立克氏病病毒( MDV)。
目前，只有马立克氏病可以通过疫苗免疫预防肿瘤产生，所以应该掌握鸡马立克氏病的诊断及疫苗免疫方法。
关键词：鸡；马立克氏病；诊断；疫苗中图分类号：S858. 31 文献标识码：B 文章编号：2095-9737(2016)02-0109-01马立克氏病属于世界性的疾病，属于当前危害养鸡业健康发展的主要疾病，感染鸡群会有比较高的发病率和死亡率。
20世纪70年代至今，针对马立克氏病广泛的开展了疫苗接种，可是仍然会出现该病的发生和流行，但是随着防治方法的成熟，鸡马立克氏病的发病范围以及传染趋势已经逐年减小，但是本病仍然严重威胁养禽业经济效益。
l 流行情况MDV具有较好的完整性时其抵抗力比较强．在于鸡群排泄的粪便中，以及舍内的垫料中的病毒可以存活达4～6个月。
4℃环境条件下，细胞结合毒能够存活2周；37℃的环境能存活18h;50℃的环境中可以存活30min;但是如果环境温度为60℃仅能存活Imin。
鸡是马立克氏病的易感群体，但是火鸡、山鸡和鹌鹑等比较少见感染的情况，而哺乳动物根本不会出现感染的可能。
本病的传染来源是病鸡和带毒鸡，如果有许多完整的病毒存在于其羽毛囊上皮内，会随着皮肤的代谢而脱落，并且将环境污染，是自然条件下的传染来源而且是最主要的。
马立克氏病主要的传播途径就是通过空气进行疾病的传播，病毒侵入鸡只体内的通道是呼吸道，鸡群采食的饲料和饮水以及鸡场的工作人员同样都可以作为鸡马立克氏病的传播媒介。
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鸡马立克氏病病毒（MDV）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒
使用说明书
本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于检测鸡血清，血浆及相关液体样本中马立克氏病病毒（MDV）水平。
实验原理：
本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中鸡马立克氏病病毒（MDV）。
用纯化的鸡马立克氏病病毒（MDV）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中马立克氏病病毒（MDV）相结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与HRP标记的马立克氏病病毒（MDV）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF 值相比较，从而判定标本中鸡马立克氏病病毒（MDV）的存在与否。
试剂盒组成：
样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤：
1. 编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）
2. 加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。
然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至600ml后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
结果判定：
试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00; 阴性对照平均值≤0.10
临界值（CUT OFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15
阴性判定：样品OD值< 临界值（CUT OFF）者为马立克氏病病毒（MDV）阴性阳性判定：样品OD值≥临界值（CUT OFF）者为马立克氏病病毒（MDV）阳性注意事项
1.操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。
2.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
3.浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
4. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5.底物请避光保存。
6.试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为630nm
7.所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
终止液为2M的硫酸，使用时必须注意安全。
保存条件及有效期
1.试剂盒保存：；2-8℃。
2.有效期：6个月。