实验一16SrRNA基因的PCR扩增电泳及系统发育分析
16SrDNA 实验原理
一、实验原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：PCR实验原理即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker，溶菌酶、dNTP和E.coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（pH 8.0）三、操作方法1. 细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180 r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
16SrDNA 实验原理
一、实验原理随着分子生物学的迅速发展,细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平,如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱与16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA,分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA,rRNA 基因由保守区与可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析,但核苷酸太少,仅几十bp,没有足够的遗传信息用于分类研究;23S rRNA含有的核苷酸数几乎就是16S rRNA的两倍,分子量太大,分析较困难。
而16S rRNA相对分子量在2kb左右,较为适合PCR扩增,又具有保守性与存在的普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高,因此,现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因就是16SrDNA,但就是要直接将16SrRNA提取出来很困难,因为易被广泛存在的RNase降解,因而利用16S rDNA鉴定细菌,其技术路线如下:PCR实验原理即聚合酶链式反应,就是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
就是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker,溶菌酶、dNTP与E、coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE(pH 8、0)三、操作方法1、细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中,180 r/min,37 ℃培养过夜,按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
16SrDNA 实验原理
一、 实验原理 随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA 杂交、rDNA 指纹图、质粒图谱和16SrDNA 序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5SrRNA 、16SrRNA 、23SrRNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。
16SrRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16SrDNA 。
5SrRNA 虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp ，没有足够的遗传信息用于分类研究；23SrRNA 含有的核苷酸数几乎是16SrRNA 的两倍，分子量太大，分析较困难。
而16SrRNA 相对分子量在2kb 左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16SrRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16SrDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA 的过程。
是一项DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA 。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、TaqPolymerase、DNAMarker，溶菌酶、dNTP和感受态细胞、pMD18-TVector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（）三、操作方法1.细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
(1)菌体收集：取新鲜的菌液于EP管中，12000r/min离心30s，弃净上清，收集菌体。
16SrDNA鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
用PCR扩增16SrRNA基因鉴定幽门螺杆菌的细胞壁缺陷型
用PCR扩增16SrRNA基因鉴定幽门螺杆菌的细胞壁缺陷型（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的：探讨幽门螺杆菌及其稳定L型的检测与鉴定方法。
方法：用抗生素诱导、滤菌器过滤、非高渗透压培养基培养获得幽门螺杆菌稳定L型纯培养物，对幽门螺杆菌及其稳定L 型进行16SrRNA基因的PCR扩增及序列测定。
结果：幽门螺杆菌及其稳定L型的16SrRNA基因PCR扩增产物经1％琼脂糖电泳，在紫外检测仪下可见550 bp的DNA条带，测序结果经NCBI Blast 分析比对，基因同源性可达100％。
结论：16SrRNA基因PCR检测可用于幽门螺杆菌L型及其他形态变异的菌种鉴定。
【关键词】螺杆菌，幽门；细胞壁；稳定L型；16SrRNA基因；聚合酶链反应［Abstract］Objective: To exploit effective methods for detection and identification of Helicobacter pylori and its stable cell wall deficient form(L form). Methods: Stable L form of H. pylori was induced by ceftriaxone sodium in non hyperosmosic medium andpurified by filtration. The 16SrRNA gene of L form and normal H. pylori were amplified by PCR and analyzed with agarose gel electroforesis and DNA sequencing. Results: The PCR products were approximately 550 bp. and their sequences were verified as 100% homology with the part of H. pylori 16SrDNA gene recorded in NCBI gene bank with blasting. Conclusion: L form H. pylori could be identified through analyzing its 16SrDNA with PCR.［Key words］Helicobacter pylori;cell wall; stable L form; 16SrRNA; polymerase chain reaction幽门螺杆菌（HP）是定植于人胃部的一种革兰阴性细菌，与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病的发生密切相关[1]。
16srrna鉴定菌株的标准操作规程
16srrna鉴定菌株的标准操作规程1. 准备工作：清洗实验室器具、准备培养基和试剂、保持操作环境的无菌状态。
2. 提取细菌样品：从菌落、液体培养基或环境样品中选择一个菌落较纯净的菌株。
使用无菌操作工具，在无菌条件下，用菌液或菌落均匀涂抹于无菌平板上。
3. 培养菌株：将无菌平板培养基转移到适合该菌株生长的培养条件下。
通常情况下，大多数菌株可以在37℃下培养24小时后获得足够的菌量。
4. 提取菌株的16S rRNA基因：使用合适的菌株提取方法提取菌株的总DNA，并使用PCR方法扩增16S rRNA基因。
PCR 反应条件可根据实验室的标准方法或相关文献进行设置。
5. 准备电泳样品：将扩增的16S rRNA基因产物与DNA分子量标记物一同混合，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测。
6. 电泳分析：将准备好的电泳样品注入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳分析。
根据相对位置和迁移速度，确定16S rRNA基因的大小。
7. 分离目标DNA带：使用无菌操作工具，在琼脂糖凝胶上切割目标DNA带。
8. 提取目标DNA带：使用合适的目标DNA提取方法，从琼脂糖凝胶上提取目标DNA带。
9. DNA序列测定：将提取的目标DNA带进行测序，可以委托测序机构进行测序，也可以使用实验室的测序设备进行测序。
10. 序列分析：使用生物信息学工具对测序结果进行分析，包括序列比对、物种鉴定和进化分析等。
11. 物种鉴定结果的确认：将测序结果与数据库中的已知序列进行比对，确定菌株的物种鉴定结果。
12. 数据和结果的解释：根据测序结果和数据库比对结果进行数据分析和结果解释。
上述是针对16S rRNA基因进行鉴定的一般操作流程，具体操作规程可能因实验室的要求和设备的不同而有所差异。
实施过程中应始终保持无菌操作，确保结果的准确性和可靠性。
实验一、16SrRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析
贮液浓度 ——
Mg2+ Plus 2.5mmol 10pmol/μl 10pmol/μl 100μg/ml
5U/μl
使用量(20μl体系) 14μl 2μl 0.5μl 1 μl 1μl 1μl 0.5μl
操作步骤
循环次数
1 30
1 1
反应条件
95℃（10min） 94℃；30s 58℃ ；1min
Ribosomal RNA Sequences 核糖体RNA序列与进化
小核糖体亚单位RNA（16S rRNA，18S rRNA）
（1）具有重要且恒定的生理功能； （2）普遍存在于原核生物和真核生物中，而且在系统发育上具有适当的
保守性； （3）分子量大小适中，在细胞中含量度变化的序列区域，适用于进化距离不同
72℃ ；1min30s 72℃ ；10min
72℃ (10min)
琼脂糖凝胶电泳：
(1) 称取琼脂糖，用适当的电泳缓冲液(常用1×TAE)配成所需 浓度的胶；10×TAE 缓冲液配制：0.4M Tris-乙酸；0.02M EDTA，pH8.0 (2) 置微波炉中加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解； (3) 按照每20ml胶加入1µl Goldview/20ml； (4) 凝胶溶液冷却至50℃左右，倒入电泳胶盘，避免出现气泡， 室温放置，至胶凝固； (5) 小心拔出梳子，将胶盘放到有1×TAE 缓冲液的水平电泳槽 中； (6) 样品中加入1/5 体积的6×loading buffer，混匀，用移液器小 心加到点样孔中，以稳定电压(4-5V/cm) 电泳；6×加样指示剂 配方:0.25% 溴酚蓝;40%(W/V) 蔗糖水溶液； (7) 取出凝胶，紫外灯下观察电泳结果，如有必要，拍照记录。
16s rrna基因测序原理
16s rrna基因测序原理
16S rRNA基因测序是一种常用的微生物分析方法，用于研究
和鉴定微生物的种类和数量。
16S rRNA是细菌和古细菌的核
糖体RNA的一个组成部分，它在不同的微生物中存在一定的
变异性，这种变异性可以用来区分不同的微生物。
16S rRNA基因测序的原理是通过提取样品中的总DNA或总RNA，然后使用聚合酶链式反应（PCR）扩增16S rRNA基因。
PCR反应使用一对通用引物，能扩增大多数细菌和古细菌的
16S rRNA基因片段。
扩增获得的DNA片段可以通过电泳或
其他方法进行分离和纯化。
得到纯化的DNA片段后，可以使用Sanger测序技术或高通量
测序技术对其进行测序。
Sanger测序技术是一种经典的测序方法，通过反复合成和分离DNA链的方式逐个测序碱基。
高通
量测序技术，如Illumina平台，使用一种并行测序原理，可以
同时测序大量的DNA片段。
通过测序获得的16S rRNA序列可以通过比对已知的16S
rRNA数据库进行比对分析，以确定样品中微生物的种类和亲
缘关系。
也可以通过对多个样品的测序结果进行比较，进行微生物群落结构和多样性分析。
总的来说，16S rRNA基因测序是一种通过扩增和测序16S rRNA基因来分析微生物组成和多样性的方法，能够对微生物
进行定性和定量分析。
16srRNA序列同源性分析与细菌系统分类鉴定（论文资料）
004 16s rRNA 序列同源性分析与细菌系统分类鉴定中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所 (北京 100050)焦振泉 刘秀梅综述 孟昭赫审校 摘要 本文介绍了16s rRNA 序列测定及同源性分析的方法,并阐述了其在细菌系统分类鉴定中的重要作用。
关键词 16s rRNA 序列同源性分析 细菌 分类鉴定 近10多年来,随着分子生物学理论和技术的迅速发展,特别是作为生物技术里程碑的聚合酶链反应(PCR )技术的出现及核酸测序技术的不断完善,产生了许多新的分类方法,如:质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、脉冲场凝胶电泳、PCR 指纹图、r DNA 指纹图、16s rRNA 序列分析等。
它们主要是对细菌染色体进行直接的DNA 分析或对染色体外的DNA 片段进行分析,从遗传进化的角度去认识细菌,从分子水平进行分类与鉴定,使细菌的分类越来越科学和精确,特别是16s rRNA 序列分析方法的出现使细菌进化可以通过试验研究来证实。
这是细菌分类史上的一次革命,必将使人们对生物进化及其与其它生物学科关系的认识更加深入。
1 16s rRNA 的结构与性质16s rRNA 为原核生物核糖体中一种核糖体RNA 。
目前,在细菌的系统分类学研究中最有用的和最常用的分子钟是rRNA ,其种类少,含量大(约占细菌RNA 含量的80%),分子大小适中,存在于所有的生物中,特别是其进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称。
rRNA 在大多数原核生物中都具有多个拷贝[1],5s 、16s 和23s rRNA 的拷贝数相同[2],16s rRNA 由于大小适中,约115kb 左右,既能体现不同菌属之间的差异,又能利用测序技术来较容易地得到其序列,故被细菌学家及分类学家所接受[3]。
所以,“细菌系统学研究特设委员会”建议依据系统发育关系分类。
通过对其序列的分析,可以判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近。
基于16S rRNA基因序列分析的临床分离乳源菌鉴定和系统进化研究
基于16S rRNA基因序列分析的临床分离乳源菌鉴定和系统进化研究摘要利用16S rRNA基因序列分析方法对1株临床分离乳源菌进行鉴定并确定菌株的进化位置。
抽提细菌DNA基因进行16S rRNA PCR扩增，并对扩增产物测序。
成功扩增出长度为1 432 bp的核苷酸序列。
该临床分离的乳源菌与GenBank上的已知序列进行了同源性比较，克隆到的序列与Y15856的同源性最低，为99.6%；与AB305019、D83353.1和FM875711.1的同源性最高，达99.9%。
该试验菌为金黄色葡萄球菌且16S rRNA基因是高度保守的。
利用16S rRNA基因序列分析鉴定细菌是一种快速、准确、方便的方法。
关键词16S rRNA；基因序列；乳源菌；金黄色葡萄球菌；鉴定；系统进化DNA序列分析作为微生物鉴定的黄金指标，在众多DNA分析方法中应用广泛[1]。
其中，rRNA含量大、种类少，是目前细菌系统分类学研究中最常用的。
由于其功能和结构上的保守性，以及良好的时钟性质，可以用于鉴定生物进化的亲缘关系[2]。
对于不同菌属、菌种遗传关系的远近，可以通过序列分析进行确定[3]。
本研究中，利用从临床奶牛乳房炎分离到的1株细菌，进行16S rRNA基因分析、PCR扩增和测序，再通过测序结果与已知种属的16S rRNA基因序列进行同源性比较确定菌株的种类，最后通过系统进化比较，确定其进化位置。
现将试验结果报告如下，以供同类研究参考。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 供试菌种。
试验菌株从四川地区患有乳房炎奶牛的奶汁中分离。
1.1.2 供试培养基。
Chapman′s 培养基、Mueller-Hinton（MH）琼脂培养基（购于微生物试剂有限公司，批号20061019），LB肉汤培养基、普通肉汤培养基（购于北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20071028）。
1.1.3 供试试剂。
细菌基因组DNA抽提试剂盒（购于上海生工生物技术有限公司）、琼脂糖（购于成都溶海生物有限公司）、Premix-Taq和分子量标准物DL2000（购于Takara公司）、溴化乙锭（EB）（购于Sigma公司）、革兰氏染液。
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实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析来自操作步骤成分 水
10×GC Buffer dNTPs 16Sp1 16S p2
基因组DNA Taq酶
贮液浓度 ——
Mg2+ Plus 2.5mmol 10pmol/μl 10pmol/μl 100μg/ml
5U/μl
使用量(20μl体系) 14μl 2μl 0.5μl 1 μl 1μl 1μl 0.5μl
实验一16SrRNA基因的 PCR扩增电泳及系统发
育分析
2020/11/17
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验内容
♣16S rRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析 ♣染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 ♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达 ♣ 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性 ♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取
1 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAGC 61 GGTAAGGCTC CTTCGGGAGT ACACGAGCGG CGAACGGGTG AGTAACACGT GAGTAATCTG 121 CCCTCCACTT TGGGATAAGC CTCGGAAACG AGGTCTAATA CCGAATACGA CCACTTCCTG 181 CATGGGATGG TGGTGGAAAG TTTTTTCGGT GGGGGATGTG CTCGCGGCCT ATCAGCTTGT 241 TGGTGGGGTA ATGGCCTACC AAGGCTTCGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GTGACCGGCC 301 ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGGAC 361 AATGGGCGGA AGCCTGATCC AGCAACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA 421 CCTCTTTCAG CGGGGACGAA GCGCAAGTGA CGGTACCCGC AGAAGAAGCA CCGGCCAACT 481 ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG TGCGAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA 541 AAGGGCTCGT AGGCGGTTTG TCGCGTCGGG AGTGAAAACA CCGGGCTTAA CTCGGTGCTT 601 GCTTTCGATA CGGGCAGACT AGAGGTATTC AGGGGAGAAC GGAATTCCTG GTGTAGCGGT 661 GAAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC GGTTCTCTGG GAATATCCTG 721 ACGCTGAGGA GCGAAAGTGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACACCG 781 TAAACGTTGG GCGCTAGGTG TGGGATCCAT TCCACGGGTT CCGTGCCGCA GCTAACGCAT 841 TAAGCGCCCC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC 901 CCGCACAAGC GGCGGAGCAT GCGGATTAAT TCGATGCAAC GCGAAGAACC TTACCTGGGT 961 TTGACATACA CCGGAAAGCT GCAGAGATGT AGCCCCTTTT AGTCGGTGTA CAGGTGGTGC 1021 ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC 1081 TCGTCCTATG TTGCCAGCAA GCCTTCGGGT GTTGGGGACT CATAGGAGAC TGCCGGGGTC 1141 AACTCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAG TCATCATGCC CCTTATGTCC AGGGCTTCAC 1201 GCATGCTACA ATGGCCGGTA CAAAGGGCTG CGATCCCGTG AGGGGGAGCG AATCCCAAAA 1261 AGCCGGTCTC AGTTCGGATT GGGGTCTGCA ACTCGACCCC ATGAAGTCGG AGTCGCTAGT 1321 AATCGCAGAT CAGCAACGCT GCGGTGAATA CGTTCCCGGG CCTTGTACAC ACCGCCCGTC 1381 ACGTCACGAA AGTCGGCAAC ACCCGAAGCC GGTGGCCTAA CCCTTGTGGA GGGAGCCGTC 1441 GAAGGTGGGG CTGGCGTTTG GGACGAAGTC GTAACAAGGT AGCCGTA
核酸
分子量的大小 分子状态
物理
电压 缓冲液 温度
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
电泳指示剂：溴芬兰，距边缘1cm左右停止电泳。 电泳染色剂：溴化乙锭(ethidium bromide,简称EtBr)， 扁平染料， 嵌到DNA或RNA分子的碱基之间，借助紫外灯观察。
DNA Marker
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
Ribosomal RNA Sequences 核糖体RNA序列与进化
小核糖体亚单位RNA（16S rRNA，18S rRNA）
（1）具有重要且恒定的生理功能； （2）普遍存在于原核生物和真核生物中，而且在系统发育上具有适当的
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
PCR技术的反应原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链 反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
设想—实现—改进与完善
94℃
55℃
72℃
PCR循环
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
16S rRNA基因的PCR扩增、电泳 及系统发育分析 窦桂铭
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验目的
1. 掌握PCR的原理，增强对PCR重要性的认识； 2. 掌握电泳技术及系统发育分析的方法，为将来课题
研究奠定基础。
5´
退火
5´
引物
延伸 底物
5´ 2
30个循环：230
目标DNA片段达
106-107
5´
2
5 ´ 变性－退火－延伸
5´
5´ 4
5´
5´
变性 加热
5´
5´
5´
退火 引物
5´
5´
5´
5´
5´
5´
5´
5´
5´
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电
泳及系统发育分析
一个标准的PCR过程
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
种类：
普通DNA RNA
水平
琼脂糖
垂直
聚丙烯酰胺
小分子量 核酸
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
二、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖：线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。 加热→凝固：网孔状的电泳介质，密度由琼脂糖的浓度决定。
琼脂糖
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的能力
凝胶浓度
0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
FASTA格式文件
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
线形DNA的最佳分辨范围（bp）
1,000～30,000 800～12,000 500～10,000 400～7,000 200～3,000 50～2,000
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围: 0.2-50kb
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素 的影响：
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
16S rRNA的系统发育分析
NCBI Blast： /
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
PCR技术的反应原理
5´
DNA或RNA模板
DNA引物
5´
DNA聚合酶
5´
dNTPs
Mg2+（缓冲液） 5´
待扩增DNA区域
5´
变性
94℃ 5 min
1
退火
3´
聚合
3´
5´
55℃
①
5´
70℃ 3´
2
5´ 3´
循环25-30次
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
目的基因