三大类病毒表达载体
载体的名词解释生物学
载体的名词解释生物学生物学中，载体（Vector）是指用来传递、繁殖和表达外源DNA（或RNA）分子的工具。
在分子生物学和基因工程领域，载体扮演着至关重要的角色。
本文将探讨载体在生物学中的定义、种类、应用以及相关的研究进展。
一、载体的定义载体是指一种生物分子，能够携带外源DNA或RNA分子。
它为这些分子提供一个合适数量及合适的环境，使其稳定存在，并能进行复制、传递和表达。
载体可以是DNA、RNA或蛋白质，也可以是一个细胞、病毒、质粒等。
二、载体的种类1. DNA载体DNA载体是最常见且最重要的载体类别之一。
其中，质粒是最常用的DNA载体。
质粒是一种环状DNA分子，能够自主复制并存在于细胞质中。
质粒可以在接受外源DNA后进行基因复制，从而将外源DNA稳定的传递给目标细胞。
此外，噬菌体也是常见的DNA载体，它是一种病毒，能够感染细菌，并在细菌内复制自身。
2. RNA载体RNA载体主要指RNA病毒，它是一种只能通过RNA复制和传递基因的病毒。
RNA载体包括正义病毒和反义病毒。
正义病毒将其RNA转录成DNA并插入宿主细胞染色体中，从而实现基因传递。
反义病毒则利用RNA复制酶来生成更多的RNA病毒。
三、载体的应用1. 外源基因表达载体在基因工程中广泛应用于外源基因表达。
研究人员可以将感兴趣的基因插入载体中，然后将其导入目标细胞。
通过选择适当的载体和表达元件，外源基因可以被成功地表达出来。
这对于探究基因功能、生物制剂的生产以及疾病治疗等方面都具有重要意义。
2. 基因治疗载体在基因治疗中扮演着关键的角色。
基因治疗是一种利用外源基因修复或替代患者体内缺乏或异常基因的方法。
通过将修复好的基因插入载体中，并将其导入患者体内，可以实现基因的传递和修复，从而治疗患者的遗传性疾病。
3. 基因传递载体还可以用于基因传递研究。
通过将感兴趣的基因插入载体中，研究人员可以将其引入目标细胞，并观察和研究基因的功能和表达。
这对于揭示基因功能及相关生理机制具有重要意义。
病毒载体概述
病毒载体概述引言基因导入体系（gene delivery system）是基因治疗的焦点技巧,可分为病毒载体系统和非病毒载体系统.本章重要阐述用于人类基因治疗的病毒载体系统.用于基因治疗的病毒载体应具备以下根本前提：1.携带外源基因并能包装成病毒颗粒;2.介导外源基因的转移和表达;3.对机体不致病.然而,大多半野生型病毒对机体都具有致病性.是以须要对其进行改革后才干用于人体.原则上,各类类型的病毒都能被改革成病毒载体.但是因为病毒的多样性及与机体庞杂的依存关系,人们至今对很多病毒的生涯周期.分子生物学.与疾病产生及成长的关系等的熟悉还很不周全,从而限制了很多病毒成长成为具有实用性的载体.近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒（包含HIV病毒）.腺病毒.腺病毒陪同病毒.疱疹病毒（包含单纯疱疹病毒.痘苗病毒及EB病毒）.甲病毒等被成功地改革成为基因转移载体并开展了不合程度的运用.第一节病毒载体产生的道理病毒载体的产生树立在对病毒的生涯周期和分子生物学熟悉的基本之上.研讨病毒载体起首要对病毒的基因组构造和功效有充分的懂得,最好能获得病毒基因组全序列信息.病毒基因组可分为编码区和非编码区.编码区基因产生病毒的构造蛋白和非构造蛋白;根据其对病毒沾染性复制的影响,又可分为必须基因和非必须基因.非编码区中含有病毒进行复制和包装等功效所必须的顺式感化元件.各类野生型病毒颗粒都具有必定的包装容量,即对所包装的病毒基因组的长度有必定的限制.一般来说,病毒包装容量不超出自身基因组大小的105～110％.基因重组技巧的成长使病毒载体的产生成为可能.最简略的做法是,将恰当长度的外源DNA拔出病毒基因组的非必须区,包装成重组病毒颗粒.比方,本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）拔出HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不转变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等,1998）.因为UL44基因产品对于HSV病毒在造就细胞中产毒性沾染长短必须的,是以,该重组病毒可以在细胞中增殖传代.用这种重组病毒沾染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达.用同样的办法,将AAV-2病毒的rep和cap基因片断（4.3kb）拔出HSV1病毒的UL2（编码尿嘧啶DNA糖基化酶）或UL44（编码糖蛋白C）基因中,构建成具有供给重组AAV载体复制和包装所需的全体帮助功效的帮助病毒rHSV-rc（伍志坚等,1999）.然而,如许的重组病毒作为基因转移载体有很多缺点.起首,很多野生型病毒经由过程在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解逝世亡;或带有病毒癌基因而使细胞产生转化.是以必须经由改革使其成为复制缺点性病毒并且删除致癌基因后才干用于基因治疗.其次,拔出外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒陪同病毒（AAV,4.7kb）.反转录病毒（8～10kb）.腺病毒（36kb）,假如不去除病毒基因,可供外源DNA拔出的容量就十分小.是以,必须删除更多的病毒基因以腾出地位拔出较大的外源DNA. 为了增长病毒载体拔出外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必须基因外,还可以进一步删去部分或全体必须基因,这些必须基因的功效由帮助病毒或包装细胞系反式供给.病毒载体大体上可分为两种类型：重组型病毒载体：这类载体是以完全的病毒基因组为改革对象.一般的步调是选择性地删除病毒的某些必须基因尤其是立早基因或早期基因,或掌握其表达;缺掉的必须基因的功效由互补细胞反式供给;用外源基因表达单位替代病毒非必须基因区;病毒复制和包装所需的顺式感化元件不变.这类载体一般经由过程同源重组办法将外源基因表达单位拔出病毒基因组中.如在传统的重组腺病毒构建办法中,将外源基因表达盒（exogenous gene expression cassette）拔出穿梭质粒（如pXCX2或pFGdX1）的腺病毒同源序列中,与帮助质粒（含有腺病毒基因组的质粒如JM17或pBHG）共转染293细胞,通细致胞内的同源重组获得含有外源基因的重组腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）.无病毒基因的病毒载体（gutless vectors）：这类载体在不合的病毒载体系统中的称谓不合.对于腺病毒,一般称为mini-Ad;在HSV载体系统,一般称为扩增子（amplicon）载体或质粒型载体.重组AAV载体也属于无病毒基因的病毒载体.这类载体系统往往由载体质粒和帮助体系构成.重组载体质粒重要由外源基因表达盒.病毒复制和包装所必须的顺式感化元件及质粒骨架构成.帮助体系包含病毒复制和包装所必须的所有反式感化元件.在帮助体系的感化下,重组载体质粒（包含或不包含质粒骨架）以特定情势（单链或双链,DNA第二节病毒载体的包装体系将外源基因包装到病毒壳粒中,是病毒载体临盆的焦点技巧.一般地,病毒载体的制备包含以下要素：宿主细胞固然如今已有可能对有些病毒载体（如AAV载体）进行体外（无细胞）包装（Zhou XH et al . 1998; Ding L et al. 1997）,但是这种包装体系仍然须要细胞提取物,并且包装效力相当低,远远达不到可临盆程度.至今为止,病毒载体的包装主如果在对该病毒迟钝的宿主细胞中进行的.宿主细胞不单供给了病毒复制和包装的情形前提,很多细胞成分还直接介入了病毒复制和包装的进程.病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因的表达盒一般地,病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因的表达盒由细菌质粒携带,构成病毒载体质粒,是被包装的对象.因为病毒复制方法的不合,有些病毒载体如单纯疱疹病毒扩增子（HSV amplicon）载体在包装时,全部载体质粒都被包装进入病毒颗粒中;而有些病毒载体如反转录病毒.腺病毒陪同病毒载体的质粒骨架部分其实不被包装到病毒颗粒中,只有病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因表达盒被包装到病毒颗粒中.构建重组型病毒载体时,病毒复制和包装所需的顺式感化元件消失于病毒基因组中（病毒基因组可以由具有沾染性的病毒颗粒供给,也可以质粒情势供给）.先将外源基因表达盒拔出穿梭质粒携带的病毒同源序列中;将重组穿梭质粒转染至细胞中,再用帮助病毒超沾染;或将重组穿梭质粒与病毒基因组质粒共转染细胞;重组质粒与病毒基因组在细胞中进行同源重组而产生表达外源基因的重组病毒. 重组腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）和重组单纯疱疹病毒（Pyles RB et al. 1997;Kramm CM et al. 1997）的传统制备办法都是采取这种方法.为了使病毒载体的临盆更为便利,病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因的表达盒除了可以用质粒携带以外,也可以用另一种病毒（往往是帮助病毒）或临盆细胞来携带.帮助元件包含病毒复制和包装所必须的所有反式感化元件.这些元件一般包含病毒基因转录调控基因.病毒DNA合成和包装所需的各类酶类的基因.病毒的外壳蛋白基因等.帮助元件的表示情势可以多种多样.经常运用的情势有：①帮助质粒（helper plasmid）,如用于产生重组腺病毒的质粒JM17,用于重组AAV包装的帮助质粒pAAV/Ad（Rolling F and Samulski J 1995）等;②帮助病毒（helper virus）,如用于HSV 扩增子载体包装的帮助病毒HSV1 tsK株;③包装细胞系如用于反转录病毒载体包装的PA317细胞.这些表示情势之间可以互相转化或归并.例如,帮助病毒可以转化为帮助质粒：传统的AAV载体临盆体系经常运用腺病毒作为帮助病毒.研讨发明,并不是腺病毒的所有基因对AAV病毒的产生都是必须的,只须要腺病毒E1a,E1b, E2a, E4和VA RNA 5种基因就行了.是以,将这5种基因置于同一个质粒中,构建成的这种新的帮助质粒就完全可以替代本来的帮助病毒（Xiao X et al. 1998; Grimm D et al. 1998 ）,不单进步了包装效力,并且防止了产品中腺病毒污染的问题.上述几种要素的不合组合,便产生了各类各样的病毒载体包装计谋.根据病毒载体临盆体系的构成身分的若干,可将其分成以下几种：单构成身分临盆体系（one-component system）：所有的构成成分都分散在临盆细胞中.经典的反转录病毒临盆体系就是由产病毒细胞（VPC）构成,重组反转录病毒由VPC细胞不竭排泄至造就上清中.这种临盆体系操纵最为简略,但是往往产量不高或不稳固.采取这种计谋,须要将重组病毒产生所须要的所有元件都稳固地置于临盆细胞中.因为很多病毒基因产品本身对细胞有损坏感化或不克不及在细胞中稳固表达,是以这种计谋在很多病毒载体的临盆中难以实行.双构成身分临盆体系（two-component system）这种临盆系同一般由"一株病毒/一株细胞"构成.典范的例子是重组腺病毒临盆体系.先用共转染的办法获得重组腺病毒毒种,再由该毒种和临盆细胞（如293细胞）构成一个双构成身分的临盆体系使病毒大量扩增.多构成身分临盆体系（multi-component system）是由两种以上的构成身分构成的临盆体系.传统的AAV载体临盆体系就是由载体质粒,帮助质粒,帮助病毒和临盆细胞4种身分构成.这种计谋的缺点是影响身分多,操纵庞杂,产量不轻易稳固,晦气于大范围临盆. 以上各类临盆体系也可以互相转化.我们实验室经由过程将上述AAV载体临盆体系的4种身分进行两两归并,即将帮助质粒和帮助病毒归并成一种重组的帮助病毒,将载体质粒和临盆细胞归并成AAV前病毒细胞株,成功地将其转化成一种双构成身分的新型高效临盆体系（伍志坚等,1999）.一般来说,成长新的包装计谋主如果为了以下几种目标：（1）削减临盆体系中的构成身分,简化操纵进程;（2）进步临盆效力,下降临盆成本;（3）防止或下降野生型病毒的产生;（4）防止运用难以与产品病毒分别的帮助病毒.第三节病毒载体的纯化办法重组病毒的纯化与基因工程产品的纯化既有很多共性,又有明显的不合之处.病毒可以看作是一个具有特定构造的生物大分子,一般都由位于中间的核酸和包裹于其外的蛋白外壳构成.有些病毒还具有脂质膜和糖蛋白或糖脂.很多分别纯化蛋白质的办法如离心和梯度离心.盐析.柱层析.超滤.透析等办法都可用于病毒的纯化.然而,因为病毒构造的庞杂性,纯化时不克不及采取蛋白质变性和复性的办法,因为一旦病毒蛋鹤产生变性,或病毒构造产生损坏,在体外就很难再重建成有沾染性的病毒颗粒.是以,在病毒的纯化进程中必须保持病毒的构造不受损坏,并且监测其沾染活性.病毒的纯化一般分为以下几个步调：初始物（start material）的收集或制备根据病毒产生方法的不合而采纳不合的方法.对于不导致细胞病变和逝世亡的病毒如反转录病毒,可不竭收集产毒细胞（VPC细胞）的造就上清作为初始物;对于在临盆病毒进程中宿主细胞产生病变和逝世亡的病毒如腺病毒,在病毒产生达到岑岭时,收集造就上清,并裂解细胞以释放细胞内的病毒.造就上清和细胞裂解液都可作为纯化的初始物.在实验室的小范围制备中,往往采取将造就上清与细胞一路反复冻融3～4次的办法制备细胞裂解液作为初始物.对于初始物体积大于500ml的较大范围的制备,则须要斟酌采取不合初始物的损益率.假如收集时大部分（90％以上）目标病毒仍消失于细胞中,为了削减操纵大体积初始物带来的便利,可以斟酌废弃上清中含有的目标病毒,而经由过程低速离心收集细胞,重悬于较小体积的缓冲液中进行细胞裂解制备细胞裂解液.对于腺病毒和AAV病毒的大范围制备都可以采取这种方法.假如经由过程延伸造就时光可以使大部分的目标病毒释放到造就液中,也可以只收集造就上清而弃去细胞,从而省去反复冻融的步调.除了用反复冻融办法裂解细胞外,还可以根据目标病毒的生物学性质采取其它不影响其沾染性的办法,如超声法.化学法（如在AAV病毒制备顶用脱氧胆酸或氯仿）等.初始物的浓缩当初始物体积较大时,要斟酌对其进行浓缩后再分别纯化.浓缩时最好同时能获得初步纯化对于后果. 在不影响目标病毒的沾染性的前提下,可选用盐析.超滤.透析等办法进行浓缩.盐析法不但可以用来浓缩初始物,同时也能达到必定的分别纯化后果.最经常运用的盐是硫酸铵;很多病毒如腺病毒.AAV病毒和单纯疱疹病毒用聚乙二醇/氯化钠体系沉淀可获得很好的后果并且不影响病毒的沾染性.目标病毒的分别纯化氯化铯密度梯度离心法至今仍是分别纯化各类病毒的最经常运用办法.主如果根据不合病毒具有特点性的浮力密度,使其与细胞裂解液中的其它成分分别开来.收集到目标病毒特异的组分后,用透析法除去个中的氯化铯,获得纯化的病毒.用这种办法有时可获得极高纯度的病毒.今朝在临床实验中运用的重组腺病毒大都是用这种办法进行纯化的.然而,这种办法也消失明显的弊病,主如果费时且操纵难度较大,反复性较差;并且氯化铯对人体有毒性.是以跟着基因治疗研讨和运用的成长,用这种办法纯化的重组病毒可能不克不及顺应人体内运用的请求.第五节安然性检测总的来说,病毒载体系体例剂的安然性检测重要涉及以下几个方面（Aderson RW 1996）：有复制才能的病毒（replication competent virus, RCV）RCV一般产生于重组病毒临盆进程中基因重组事宜.因为RCV具有复制才能,在临盆进程中一旦消失,就可能呈现优势发展,从而影响载体病毒的产量;别的,含有RCV的成品用于人体内可能导致轻微的病毒沾染或急性/慢性病毒血症.RCV是对用于基因治疗的病毒载体系体例剂安然性检测的特有项目.检测RCV的办法因不合的病毒载体而异.对于反转录病毒载体,检测有复制才能的反转录病毒（RCR）的办法主如果PG4 S+L- 剖析法;也可采取其它的变通办法.对于腺病毒载体,检测有复制才能的腺病毒（RCA）重要采取空斑剖析办法及PCR办法.帮助病毒对于临盆进程须要帮助病毒介入的病毒载体如AAV病毒载体,因为这些帮助病毒本身具有复制才能并对机体细胞有损坏性,是以检测病毒制剂中的帮助病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒的残存量十分重要.其它成分的污染检测指标包含细菌.霉菌.支原体.内毒素等及在纯化进程中所用试剂如氯化铯等的残存量.第六节病毒载体的成长偏向基因治疗研讨的快速成长对基因导入体系提出了越来越高的请求.病毒载体的成长也日新月异,包含对已有病毒载体的不竭改良和完美,和越来越多的其它病毒被改革成为新的病毒载体.病毒载体的成长偏向可归纳成以下几个方面：轻便.高效的病毒载体包装体系：斟酌到包装的高效性和操纵的轻便性,越来越多的病毒载体临盆体系将采取双构成身分体系.这种体系轻易用于病毒载体的大范围临盆（Liu XL et al.1999; Conway JE et al. 1999 ）.无病毒基因的病毒载体（gutless viral vector）：去除病毒载体中所有的病毒基因,只保存其复制和包装所必须的顺式感化元件,是病毒载体的重要成长偏向.这种计谋可最大限度地扩展载体的容量和削减病毒对细胞的直接毒性和病毒蛋白表达引起的免疫毒性. 腺病毒的微载体（mini-Ad）.AAV载体.HSV扩增子载体都是无病毒基因的病毒载体.这一成长偏向须要解决的重要问题是树立高效.安然（无帮助病毒污染）的包装体系.可调控表达外源基因的病毒载体：在很多疾病的基因治疗中,实现外源基因的可调控表达十分重要.如糖尿病的基因治疗,外源的胰岛素基因的表达最好能受血糖程度的调控;肾性贫血的基因治疗,EPO基因的表达最好能受血氧含量的调控等.今朝所研讨的表达调控体系重要包含各类药物引诱的表达"开关".个中四环素掌握体系（Tet-on和Tet-off）是人工设计的一种基因表达调控模式.这个体系在体外和动物体内实验中都表示出优越的表达调控感化（Fotaki ME et al.1997; Miller N and Whelan J 1997）.然而,因为个中的反式感化蛋白（tTA或rtTA）是异种蛋白,在机体内可能引起毒性感化和免疫反响,是以用于人体前还需斟酌其安然性和长期有用性.比来Binley K等（1999）报导了用缺氧反响元件（hypoxia response element ,HRE）腺病毒载体中外源基因的表达.缺氧可激活bHLH/PAS 家族转录因子的表达,它们可结合HRE焦点序列上,诱发其下流基因的表达.自我扩增型载体（self-amplifying vector）（Herweijer H and Wolff JA 1997）：今朝的基因转移办法基因转移的效力仍相对较低,尤其是在体内.为了进步外源基因表达总程度,除了进步基因转移效力外,另一种办法是尽量进步外源DNA在细胞中的表达程度.用自我扩增型的表达载体是达到此目标的办法之一.这些载体是以正链RNA病毒Sindbis病毒和Semliki Forest 病毒为基本的.用目标基因代替病毒的外壳蛋白编码序列,导入靶细胞中,病毒的复制蛋白大量复制重组的基因组,mRNA程度的大量增长导致高程度的转导基因表达.自我扩增型载体的表示情势可所以RNA,DNA和重组病毒.特异性复制型性病毒载体（specifically replicating vector）：指可在某种特点的组织中产毒性复制,而在其它组织中不增殖的病毒载体.这类病毒载体重要用于特异性裂解肿瘤细胞.如腺病毒突变株Onyx-015是55KdalE1B基因功效缺掉的腺病毒突变株,可以选择性地在p53基因突变的肿瘤细胞中增殖,而在正常组织细胞中不增殖.用这种突变株结合化疗治疗恶性肿瘤II 期临床成果令人鼓舞（Kirn D et al. 1998）,已进入III期临床实验,从此,很多人工改革的腺病毒突变体被用于肿瘤治疗研讨中.如将腺病毒E1基因的表达用甲胎蛋白（AFP）启动子掌握,使得该病毒只能在甲胎蛋白阳性的肝癌细胞中增殖导致细胞逝世亡.也可以将这种病毒的基因组分开装在两个互补的缺点性腺病毒载体上（Alemany R et al. 1999）,个中一个载体除了腺病毒复制和包装所必须的顺式感化元件外,只含有E1区基因,个中E1A基因的表达受AFP启动子的掌握;另一个载体为E1区缺掉的重组腺病毒.这两个载体同时沾染AFP阳性的肝癌细胞时,病毒可不竭增殖而引起细胞逝世亡;对于AFP阴性的细胞,E1A基因不表达,因而病毒不克不及增殖.相似的设计在HSV载体系统也有报导.除了用甲胎蛋白作为反式激活因子外,各类其它组织特异性表达的蛋白和调控序列都可被用来掌握病毒的增殖.嵌合型病毒载体（hybrid viral vector）：是指将不合病毒的基因元件进行组合,形成的重组杂合病毒.如腺病毒与AAV病毒的杂合体病毒,既具有腺病毒的沾染性和基因组特点（双链线状DNA）,又具有AAV病毒的染色体整合性（Lieber A et al. 1999）.各类病毒基因元件组合形成新的杂合载体的报导层见叠出,如单纯疱疹病毒扩增子与AAV病毒杂合载体（Johnston KM et al. 1997）.腺病毒与EB病毒复制子杂合载体（Tan BT et al. 1999）腺病毒与反转录病毒杂合载体（Caplen NJ et al. 1999）等,不一而足.这些杂合载体使重组病毒的特点多样化,以顺应不合基因转移目标的须要.靶向性病毒载体（targeted viral vector）：是指能特异性地结归并沾染某种细胞的病毒载体.靶向性病毒载体的产生重要有两种办法.一种办法是将病毒颗粒与某一靶向分子（Harari OA et al.1999 ）或特异性抗体（Bartlett JS et al. 1999）偶联;另一种办法是经由过程转变病毒外壳蛋白的构造,使其对细胞的亲嗜性产生转变（Reynolds P et al.1999;Krasnykh VN et al. 1996 ）.用各类其它病毒构成新型病毒载体：略.参考文献Aderson RW. 1996. Forum'96: Gene Therapy. P21-24Alemany R, Lai S, Lou YC et al. 1999. Complementary adenoviral vectors for oncolysis. Cancer Gene Ther. 6:21-25Bartlett JS, Kleinschmidt J, Boucher RC et al. 1999. Targeted adeno-associated virus vector transduction of nonpermissive cells mediated by bispecific F(ab'γ)2 antibody. Nature Biotechnology. 17:181-186Caplen NJ, Higginbotham JN, Scheel JR, Vahanian N et al. 1999Adeno-retroviral chimeric viruses as in vivo transducing agents. Gene Ther. 6:454-459Conway JE, Rhys CMJ, Zolotuklin I et al. 1999. High-titer recombinant adeno-associated virus production utilizing a recombinant herpes simplex virus type I vector expressing AAV-2 rep and cap. Gene Ther. 6:986-993 Ding L, Lu S and Munshi NC. 1997. In vitro packaging of an infectious recombinant adeno-associated virus 2. Gene Ther. 4:1167-1172Fotaki ME,Pink JR, Mous J 1997. Tetracycline-responsive gene expression in mouse brain after amplicon-mediated gene transfer. Gene Ther. 4:901-908Gene Ther. 6:1336-1339Graham FL and Prevec L. 1995. Methods for construction of adenovirus vectors. Molecular Biotechnology. 3:207-220Grimm D, Kern A, Rittner K et al. 1998. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum. Gene Ther. 9:2745-2760）Harari OA, Wickham TJ, Stocker CJ et al. 1999. Targeting an adenoviral gene vector to cytokine-activated vascular endothelium via E-selectin. Gene Ther. 6:801-7Johnston KM. Jacoby D. Pechan PA et al. 1997. HSV/AAV hybrid amplicon vectors extend transgene expression in human glioma cells. Hum Gene Ther. 8:359-370Kirn D, Hermiston T and McCormick F. 1998. ONYX-015: Clinical data are encouraging. Nature Med. 4:1341-1342Kramm CM, Chase M, Herrlinger U et al. 1997. Therapeutic efficiency and safety of a second-generation replication-conditional HSV1 vector for brain tumor gene therapy. Hum. Gene Ther. 8:2057-2068 Krasnykh VN, Mikheeva GV. Douglas JT et al. 1996. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. J Virol. 70:6839-6846.Lieber A, Steinwaerder.DS, Carlson CA et al. 1999. Integrating adenovirus-adeno-associated virus hybrid vectors devoid of allviral genes J Virol. 73:9314-9324Liu XL, Clark KR, Johnson PR. 1999. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using a packaging cell line and a hybrid recombinant adenovirus. Gene Ther. 6:293-299Miller N and Whelan J. 1997. Progress in transcriptionally targeted and regulatable vectors for genetic therapy. Hum. Gene Ther. 8:803-815Pyles RB, Warnick RE, Chalk CL et al.1997 A novel multiply-mutated HSV-1 strain for the treatment of human brain tumors. Hum. Gene Ther. 8:533-544Reynolds P, Dmitriev I, Curiel D. 1999. Insertion of an RGD motif into the HI loop of adenovirus fiber protein alters thedistribution of transgene expression of the systemically administered vector.Rolling F and Samulski J. 1995 AAV as a viral vector for human gene therapy. Molecular Biotechnology. 3:9-15Summerford C and Samulski J. 1999 Viral receptors and vector purification : new approaches for generating clinical-grade reagents. Nature Med. 5:587-588Tan BT, Wu L, Berk AJ. 1999. An adenovirus-Epstein-Barr virus hybrid vector that stably transforms cultured cells with high efficiency. J Virol . 73: 7582-7589Xiao X, Li J, Samulski J. 1998. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72:2224-2232Zhou XH and Nicholas Muzyzca. 1998. In vitro packaging of adeno-associated virus DNA. J Virol. 72:3241-3247.伍志坚,吴小兵,侯云德. 1999. 具有AAV载体包装功效的重组HSV的产生. 科学传递. 44（5）：506-509吴小兵,董小岩,伍志坚等. 1998. 以粘粒为基本产生重组单纯疱疹病毒HSV1-lacZ的研讨. 病毒学报. 14:359-364。
慢病毒载体,稳定表达
慢病毒载体，稳定表达一、慢病毒逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。
主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。
慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。
最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。
慢病毒结构：2个调节基因：（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。
（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。
4个辅助蛋白（附属）基因：（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；（2）vpr和nef参与疾病的表现。
慢病毒的优势：1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因；2.可感染分裂和非分裂细胞；3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；4.可以更换特异性启动子；5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；二、慢病毒载体慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒包装过程：慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
蛋白表达载体常用标签综述
蛋白表达载体系统重组蛋白表达技术和重组蛋白表达载体现已广泛应用于生物学各个具体领域,尤其是体内功能研究和蛋白质的大规模生产。
GeneCopoeia的蛋白表达载体按照表达宿主的不同分为3类:B类，M类和Lv 类。
B类的表达宿主为大肠杆菌，M类的宿主为哺乳动物细胞，Lv类是慢病毒载体，宿主可以为哺乳动物细胞或原代细胞。
除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将各类载体按荧光蛋白标签、多功能标签、促溶解度标签和抗体免疫共沉淀标签四种，先将几种主流的标签功能初步介绍如下：eGFP/eCFP/eYFP/mCherry分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白标签,具有不同的激发波长和发射波长，均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来。
就eGFP而言，相对于GFP，其荧光强度更强、荧光性质更稳定。
同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。
mCherry是从DsRed演化来的性能最好的一个单体红色荧光蛋白，可以和GFP系列荧光蛋白共用，实现多色标记体内、外实验表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白时，荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响。
这些荧光标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：1.不用破碎组织细胞、不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。
2.其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。
3.同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测效果更快速、简便、灵敏度高而且重现性好。
4.其低消耗、高灵敏度检测的特性，十分适用于高通量的药物筛选。
现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。
维真生物-如何阅读基因载体图谱
如何阅读基因载体图谱1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞，进行感染的分子机制。
可发生于完整活体或是细胞培养中。
可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。
用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件：（1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒；（2）介导外源基因的转移和表达；（3）对人体不致病；（4）在环境中不会引起增殖和传播。
非病毒载体一般是指质粒DNA。
2、按进入受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体、穿梭载体（含原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达）。
3、按功能分类：克隆载体、表达载体克隆载体：具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段（外源基因）的载体。
表达载体：克隆载体中加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA顺序）有关的元件即成为表达载体。
1、复制起始位点Ori：即控制复制起始的位点。
Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。
2、抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+（1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。
（5）hygr：使潮霉素β失活。
3、多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段，它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
还要再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
三种病毒表达系统的异同点
三种病毒表达系统的异同点⼀、病毒表达系统简介病毒载体是指以病毒为基础的载体，也是⽬前最常⽤的基因导⼊⽅式之⼀。
通过对病毒基因组的遗传改造，使之能够携带外源⽬的基因和相关的病毒元件，并被包装成病毒颗粒。
病毒进⽽侵染宿主，使携带的外源基因在宿主体内表达。
病毒的基因组可分为编码区和⾮编码区。
其中，编码区包含病毒的必需基因和⾮必需基因，可分别表达产⽣病毒的结构蛋⽩和⾮结构蛋⽩；⾮编码区则含有病毒复制和包装所需的全部顺式作⽤元件。
由于野⽣型病毒常常具有致病性，为了避免实验或治疗中使⽤的病毒恢复成野⽣型，必须对病毒载体进⾏⼀系列的遗传改造。
譬如删除病毒基因组的⾮必需区，将顺式作⽤元件和反式作⽤元件分开连接⾄不同的载体上，或结合利⽤不同种病毒的必需蛋⽩等，最⼤程度地保证实验的安全性。
哺乳动物病毒表达系统常常包含⼀到多个载体，将所需的载体转染包装细胞后，在反式因⼦的作⽤下，病毒复制、包装所需的顺式作⽤元件和外源基因表达盒即可被包装，最终产⽣带有外源基因的病毒颗粒。
经浓缩和纯化后的病毒液即可⽤于侵染⽬标宿主细胞或动物体，实现外源⽬的基因在宿主体内的表达。
⼆、病毒表达系统的优势病毒的转导效率⽐常规真核表达载体⾼很多，因此特别适合于介导外源基因在难转染甚⾄⽆法转染的哺乳动物细胞中表达。
三、辉骏⽣物病毒服务简介辉骏⽣物的病毒产品包括慢病毒、腺病毒和逆转录病毒，服务项⽬包括：各类病毒载体的构建和病毒包装，以及慢病毒介导的稳定表达株建⽴等。
慢病毒表达系统：⼀种很常⽤的哺乳动物病毒表达系统；慢病毒感染宿主细胞时，可将携带的外源基因随机、稳定地整合⼊宿主细胞基因组中，实现⽬的基因稳定、长期的表达，⾮常适合于基因过表达稳定细胞株的建⽴和RNAi研究。
图1 慢病毒感染宿主细胞原理图腺病毒表达系统：⼀种很常⽤的哺乳动物病毒表达系统；但与慢病毒不同的是，腺病毒基因组及其携带的外源基因不会整合⼊宿主细胞的基因组中，⽽是游离于宿主基因组外独⽴表达，因此可实现⽬的基因瞬时、⾼丰度的表达，同时还避免了因整合⽽引发的潜在的基因突变和随机效应，安全性和可控性⾼。
腺病毒载体的分类及包装方法
腺病毒载体的分类及包装方法1.腺病毒载体分类第一代腺病毒载体：指E1或E3基因缺失的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量为6.5-8Kb；(2)适用于大多数基因治疗，且容易获得高滴度的病毒；(3)可用于表达重组蛋白质或将外源基因导入对其他转染方法不敏感的细胞株中；(4)若未经纯化使用，容易引发机体产生强烈的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用。
第二代腺病毒载体：指E2A或E4基因缺失的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量增加，可达14Kb；(2)病毒蛋白表达降低，引发机体的免疫反应比第一代弱；(3)外源基因表达时间较长；(4)病毒产量较低，且滴度降低。
第三代腺病毒载体：也称为空壳载体或辅助病毒载体，指全部或大部分腺病毒基因组缺失，仅可保留ITR和包装信号序列的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量大幅度提高，可达37Kb；(2)无病毒蛋白表达，降低了机体的免疫反应，提高了安全性；(3)外源基因可长期稳定表达；(4)需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒；(5)可反复应用，无需考虑机体的抗腺病毒中和抗体的影响。
2.腺病毒载体包装方法传统的双质粒共转染法将插入了外源基因的穿梭载体质粒与携带腺病毒基因组的质粒共转染293细胞，这两种质粒在293细胞内通过随机的同源重组（同源序列的DNA分子之间或者分子之内的重新组合），形成重组腺病毒载体基因组，并包装成病毒颗粒。
局限性：(1) 操作较复杂，因其易被亲代病毒污染，需经过多次纯化和鉴定；(2) 重组效率低，耗费时间较长。
注：此方法适用于临床。
(1)Ad-Easy法将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的质粒共转染RecA+细菌，在细菌RecA 重组酶的作用下，经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其酶切纯化后转染293细胞，包装成重组病毒颗粒。
特点：(1) 酶切和连接步骤少，操作简便；(2) 可选择的穿梭载体多；(3) 同源重组率达60%以上，效率相对较高；局限性：(1) 某些腺病毒基因容易发生突变；(2) 设备和技术要求较高。
基因治疗的三大类基因传递载体与基因传递效率评估
基因治疗的三大类基因传递载体与基因传递效率评估基因治疗是利用基因传递载体将修复或替代基因传递到患者的细胞中，以治疗遗传性疾病、癌症等难治性疾病的一种方法。
在基因治疗过程中，选择合适的基因传递载体和评估基因传递效率是非常重要的一步。
本文将介绍基因治疗中的三大类基因传递载体以及基因传递效率的评估方法。
第一类基因传递载体是病毒型载体。
病毒型载体可以将基因传递到目标细胞内，并整合到宿主基因组中，实现长期稳定的基因传递效果。
常用的病毒型载体包括腺病毒（Adenovirus）、逆转录病毒（Retrovirus）和腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）等。
这些病毒型载体具有高效率的基因传递能力，但也存在一些问题，比如免疫反应、随机插入等。
然而，病毒型载体在基因治疗中仍然是最常用的载体，因为它们可以针对不同类型的细胞和组织进行基因传递。
第二类基因传递载体是非病毒型载体。
非病毒型载体是指没有感染细胞的能力，通常可以通过物理或化学手段将基因传递到细胞中。
常见的非病毒型载体有质粒DNA、利用电穿孔或超声波破裂、脂质体等。
相比病毒型载体，非病毒型载体有许多优点，如安全性高、简易制备、规模化生产等。
然而，非病毒型载体的缺点是传递效率相对较低，对于某些细胞类型的基因传递效果较差。
第三类基因传递载体是基因编辑工具。
基因编辑工具一般用于精确修改基因，包括锌指核酸酶（Zinc Finger Nucleases，ZFNs）、类转录因子效应子（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和CRISPR/Cas9等。
这些工具可以通过靶向特定的DNA序列来实现基因的精确修饰，比如基因敲除、插入和突变等。
基因编辑工具具有高效的基因传递能力和精确性，但也面临着安全性和伦理问题的挑战。
为了评估基因传递效率，科研人员通常会采用多种方法来确定基因传递的效果。
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慢病毒
杰特伟
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基
础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能 力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将 外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能 力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮 细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在 美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景
随后Gossen等对tTA的氨基酸序列进行了改造，构建了 受四环素正调节的Tet-on基因表达系统，该系统在没有 四环素的情况下启动子不被激活，而 在加入四环素或强 力毒素后目的基因高效表达。
四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动 物细胞诱导表达系统，该系统具有严密、高效可控制性 强的优 点。
siRNA载体 的所有特色； 1.诱导性启动子 2.与stratagene的 adEasy 腺病毒载体
系列的兼容 4。保留少量的MCS 3.cGFP的筛选标记
杰特伟
慢病毒载体系统
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逆转录病毒siRNA 载体
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siRNA的CK 载体序列
一，萤火虫荧光素酶的siRNA的阳性对照载体 二，海肾荧光素酶的siRNA的阳性对照载体 三：CGFP siRNA的阳性对照载体 四；阴性对照siRNA的载体系统
质粒siRNA 表达载体
去除CMV启 动子
和EGFP荧 光蛋白， 质粒较小，
最好 使用 的 RNAi质粒之一
杰特伟
质粒siRNA 表达载体
CMV启 动子
和EGFP荧 光蛋白
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诱导性的siRNA 表达启动子
四环素
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强力霉素
Tet-on基因表达系统的小常识
杰特伟
Gossen等构建了受四环素负调节的Tet-on基因表达系 统。
常用的病毒载体的特点：
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病毒载体
反转录病毒载体 单链 RNA 病毒 8~10kb
腺病毒载体 双链 DNA 病毒 36kb
A AV 病 毒 载 体 单链 DNA 病毒 ~5kb
HSV 病 毒 载 体 双链 DNA 病毒 152kb
生物学特性
适用范围
可感染分裂细胞； 整合到染色体中； 表达时间较长； 有致癌的危险； 可感染分裂和非分裂细胞； 不整合到染色体中； 外源基因表达水平高； 表达时间较短； 免疫原性强； 可感染分裂和非分裂细胞； 整合到染色体中； 无致病性；免疫原性弱； 可长期表达外源基因； 在骨骼肌、心肌、肝脏、视 网膜等组织中表达较高；
E x vivo 基 因 治 疗 ； 肿瘤基因治疗。
In vivo 基 因 治 疗 ； 肿瘤基因治疗； 疫苗。
In vivo 基 因 治 疗； E x vivo 基 因 治 疗 ； 遗传病基因治疗； 获得性慢性疾病的 基因治疗。
具有嗜神经性；可逆轴突传 递； 可潜伏感染； 容量大； 可感染分裂和非分裂细胞；
病毒表达载体
技术支持：龙桂根
Gene
Gene expression system
Gene vector system Gene delivery system
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哺乳动物表达载体的特点；
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特点：哺乳动物细胞表达载体元件包含（1）原核序列、（2）
启动子、增强子、（3）选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号 等。
诱导性的siRNA 表达启动子
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腺病毒siRNA穿梭载体
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主要分为两大类： 一； 与clontech 的adeno-x expression系统兼容 二； 与stratagene的adEasy 腺病毒载体兼容
与clontech 的adeno-x expression系统兼容 杰特伟
去除CMV启动子 和EGFP荧光蛋白，
逆转录病毒载体系统
杰特伟
选用的背景：由于重组腺病毒对于一些细胞类型难以转染，比如
各种类型的原代细胞、体内细胞，同时希望基因永久性表达，即将基 因整合入靶细胞的基因组中，此时可以考虑选用逆转录病毒。
逆转录病毒简介： 反转录病毒载体是常用的病毒载体之一，是
由具有感染性的小鼠的白血病病毒改造而来，能将非病毒基因导入细 胞体内或体外进行有丝分裂。这些载体能产生病毒基因组的单一拷贝 并高效准确地整和到宿主染色体 。
选用哺乳动物表达载体的优势：
由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方
更 面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统， 接近于天然蛋白质。
外源基因进入哺乳动物细胞的方法
将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过类方法 ：
一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞，
二是通过脂质体法、显微注射法 、磷酸钙共沉淀法及DEAE一葡聚糖法 等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。外源基因的体外表达一般采 用质粒表达载体，如将重组质粒导入CHO细胞可建 立高效稳定的表达系 统，而利用COS细胞可建立瞬时表达系统。
目前，病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力工具，在临床基因 治疗的探索中也发挥了重要 作用。
痘苗病毒由于其基因的分子量相当大(约187kb)，利用它作为载体可同时 插入几种外源基因，从 而构 建多价疫苗。另外，逆转录病毒感染效率 高，某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因，但要注意的是逆转 录病毒可整合入宿主细胞染色体，具有潜在的危险 性。
质粒较小， 最好使用的RNAi 质粒之一。避免了E
GFP荧光蛋白 对RNAi实验检 测可能造成的冲突。
与clontech 的adeno-x expression系统兼容 杰特伟
与stratagene的adEasy 腺病毒载体兼容 杰特伟
与stratagene的adEasy 腺病毒载体兼容
注意到，此载体 集金思特
三大类病毒表达载体
一；腺病毒（adenoviral)表达载体 二；逆转录病毒(retroviral)表达载体 三；慢病毒表达(lentiviral)载体 四；三大类病毒表达载体的差异与联系 五；其它病毒表达系统
杰特伟
腺病毒表达载体
杰特伟
产生的背景；人们希望基因能在哺乳动物细胞 中表达目的
基因，而传统的办法做不到。
腺病毒是一种线状DNA肿瘤病毒，基因组内有14个基因。目前
对该病毒的分子生物研究已经很深入，而且对该病毒转染后的免 疫应答也了解佷清楚，目前应用范围最广的病毒，其转染效率也 很高，不管是分裂细胞，还是静止细胞，都是如此。
缺陷：不能整合至靶细胞的基因组，只能瞬时表达，更为致命
是腺病毒的某些抗原表达，也很容易引起人体的免疫反应。
CGFP siRNA的阳性对照载体
杰特伟
神经系统疾病的基 因治疗； 肿瘤的基因治疗。
基因载体系统
杰特伟
DNA/RNA DNADNADNA-
DNA
病毒载体系统
非病毒载体系统
反
腺
腺
单
慢
转
病
伴
纯
病
录
毒
随
疱
毒
病 毒 载
载 体
病 毒 载
疹 病 毒
载 体
体
体
载
体
裸
阳
蛋
阳
离
白
子
质
脂
复
质
合
离 子 多 聚
嵌 合 物
复
物
物
合
物
细胞内包装
细胞外包装
公司相应的病毒表达载体