黑色素细胞中黑色素含量的测定和酪氨酸酶活性的测定
细胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量检测试剂盒产品
细胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过酪氨酸酶反应系统中底物酪氨酸氧化后，产生多巴色素，呈现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定细胞裂解悬液样品中酶活性的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种人体和动物细胞，尤其是黑色素细胞和黑色素瘤细胞裂解悬液样品中酪氨酸酶的活性检测，以及抑制剂筛选。
产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景酪氨酸酶（tyrosinase；EC1.14.18.1）是一种单酚单加氧酶（monophenol monooxygenase），又称为单酚酶（monophenolase）或单酚二羟基苯丙氨酸：O2氧化还原酶（monophenol dihydroxyphenylalanin：O2 oxidoreductase），具有双功能的含铜糖蛋白，广泛存在于植物、酵母和动物组织中，其蛋白结构、大小、糖基化方式、激活特征等都不同。
人体酪氨酸酶是一个跨膜蛋白，而催化结构域在黑色素细胞（melanocyte）或色素细胞的黑色素器（melanosome）里。
酪氨酸酶通过催化L-酪氨酸（L-tyrosine）等的o-羟基化（o-hydroxylation）反应变成L-多巴（L-dopamine），进而氧化产生黑色素底物多巴醌（dopaquinone），从而由多巴色素（dopachrome）转化为黑色素（melanin）中的真黑素（eumelanin），以及其它色素，包括毛发和眼睛色素。
紫外线可以激活酪氨酸酶活性，严重时，会引起色素沉着（hyperpigmentation）。
酪氨酸酶基因突变将导致I型眼皮肤白化病（oculocutaneous albinism）。
酪氨酸酶抑制剂成为增白化妆品的重要元素。
基于底物酪氨酸，在酪氨酸酶的催化下，产生多巴色素，通过其吸光值的变化（475nm波长），来定量测定酪氨酸酶的活性。
黑色素细胞体外培养技术的研究及应用
黑色素细胞体外培养技术的研究及应用维普资讯 ////0>.堑堡匿堂生箜墨鲞黑色素细胞体外培养技术的研究及应用新疆维吾尔自治区人民医院刘熔李红健综述一、体外培养技术的建立表皮培养而设计的培养液,钙离子浓度为.。
.概述:黑素细胞起源于外胚层的神经嵴,其数量与部但对一些要求较高的基础性研究来说,由于血清位、年龄有关与肤色、人种、性别等无关。
几乎所成分非常复杂,常使研究结果影响较大,同时血清中有组织内均有黑素细胞,但以表皮、毛囊、黏膜、视网也含有一定的细胞:莓性物质和抑制剂,对细胞有去分膜色素上皮等处为多。
位于表皮的基底层,与化作用,影响某些细胞功能的表达。
因此现在的研究者都在寻找不含血清或其他天然培养基成分的培养表皮细胞共同组成表皮黑素单位,其主要功能是产生液。
黑素小体保护皮肤免受损害。
最近研究表明,在某些不良条件刺激下,黑色素细胞可发生分裂、增殖、黑素无血清培养基一般包括基础培养液及辅加成分形成、移行等一系列行为参与机体代谢。
两部分。
无血清培养基的基础培养液一般采用人工应用细胞培养技术建立的体外纯培养,是研合成培养基,常用 /、培养液等。
究皮肤色素障碍性疾病的重要手段。
因此体外培养 .影响黑色素细胞生长的因子:人是人们十分关注的一项研究课题。
黑色素细年等在培养基中加入和胞的培养可以追溯到年代,但是直到年代才真首次成功地培养出了黑素细胞。
其机理是除正建立了可靠的黑色素细胞培养方法。
年了可以刺激黑素细胞自分泌特定的生长因子外,在化学结构上与二酯酰甘油类似,可以取代首先报告体外培养人黑色素细胞以来,由于培养技术没有突破,而未能培养出大量纯化的人活化蛋白激酶,是以为代表黑素细胞。
随着细胞生物技术的迅速发展,年的佛波酯类化合物的主要受体和靶点,通过信号转导美国和在含有辅助致癌因子途径/刺激黑素细胞增殖。
也有人认为培一一一一,或 ? 养成功的关键是对角质形成细胞有毒性作用,一一一 , 、霍舌毒可以抑制成纤维细胞生长,从而避免角质形成细素 ,和 %胎牛血清的培养液中, 胞和成纤维细胞污染,使黑素细胞快速生长。
化妆品中美白活性成分检测
化妆品中美白活性成分检测1美白活性成分作用机制白种人肤色较浅，是因为他们皮肤中含有较多的褐黑色素，而黄种人皮肤中含有较多的真黑色素，使得黄种人看起来更黑一些。
因此，阻断褐黑色素以及真黑色素的形成就成为美白祛斑的有效途径。
1.1 黑色素的形成[1-5]紫外线、活性氧等环境甚至是某些食物都可能导致皮肤变黑，这是因为这些直接或间接地参与了黑色素生成。
黑色素的形成依赖于三种酶：酪氨酸酶、多巴色素互变酶以及DHICA氧化酶。
酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴，多巴继续在酪氨酸酶的作用下生成多巴酿，多巴醍是形成褐黑素的前体；同时多巴醍在酪氨酸酶催化作用下生成多巴色素，接着多巴色素在多巴色素互变酶作用下，大部分生成二羟基口引噪(DHI),小部分生成二羟基口引口朵竣酸(DH1CA),二者在DHICA 氧化酶作用下，生成DH1-黑色素和DHICA-黑色素两种真黑色素。
从黑色素的形成过程中可以看到，酪氨酸是形成黑色素的主要原料，减少酪氨酸的摄入，有利于从源头上减少黑色素的形成，同时可以发现，酪氨酸酶是形成黑色素的决定性酶，可以说没有酪氨酸酶，黑色素将难以形成。
因此，体内的酪氨酸酶活力越高，含量越高，形成黑色素的可能越大。
1.2 美白祛斑机制美白祛斑类化妆品的作用机制是干扰甚至阻断黑色素的形成。
目前有4种原理可用来解释美白活性成分的作用机制[6]o1.2.1 还原作用美白活性成分直接作用于黑色素）各具有明显黑色的黑色素加以还原，变为无色的还原型色素。
1.2.2 凝结作用一般而言，蛋白质发生凝结，会失去其本身的活性。
而酪氨酸酶是一种蛋白质，通过凝结作用，促使酪氨酸酶失活，失去催化的活性，从而使得色素细胞不能生成黑色素。
酚类化合物对蛋白质有凝结作用，苯酚、对苯二酚（氢酿）、熊果甘、曲酸及其衍生物等采用的就是这种原理。
1.2.3 嵌合作用酪氨酸酶是一种含铜离子的酶，其中铜离子作为辅酶。
嵌合作用就是作用于酪氨酸酶中的铜离子，使其发生络合作用，从而使酶的活性降低甚至失去催化功能□o1.2.4 破坏作用通过破坏自由基，从而导致黑色素小体结构改变，最后造成黑色素的细胞破坏。
酪氨酸酶提取及活性研究
荧光光谱法
总结词
荧光光谱法是一种利用荧光物质与酪氨酸酶相互作用产生的荧光信号变化来研究酶活性 的方法。
详细描述
荧光光谱法通过测量荧光信号的强度和波长变化，可以分析荧光物质与酪氨酸酶的结合 情况以及酶的催化过程。该方法具有高灵敏度和选择性，适用于生物体系中的酪氨酸酶
活性研究。
紫外可见光谱法
总结词
紫外可见光谱法是通过测定酪氨酸酶在紫外可见光区的吸收光谱来研究酶活性的方法。
有机溶剂萃取法
• 有机溶剂萃取法：利用有机溶剂将目标物质从水相中萃取 出来。常用乙醚、氯仿等。
离子交换法
• 离子交换法：利用离子交换剂将目标物质与溶液中的其他离子进行交换，从而实现分离。常用DEAE-纤维素 、CM-纤维素等。
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药物研发
基于酪氨酸酶的催化机制，开发具有治疗作 用的新型药物或药物前体。
生物工程
利用酪氨酸酶在酶工程领域进行蛋白质改造 和优化，提高酶的催化效率和稳定性。
感谢您的观看
THAபைடு நூலகம்KS
在食品工业领域的应用
• 酪氨酸酶在食品工业中主要用于生产 食品添加剂和调味品。例如，它可以 催化产生茶多酚和咖啡色素等天然色 素，为食品提供丰富的色泽。此外， 酪氨酸酶还可用于生产香精和调味剂， 提高食品的口感和风味。
几种复配美白剂的美白功效研究
几种复配美白剂的美白功效研究文/罗婷婷 孙祥灵 赵昆 段国梅 李土桂 何秋星本文通过对7种不同美白剂原料进行复配研究，采用单因素试验、正交试验以及综合评价，优选最佳美白复配组合，通过B16细胞试验评价美白复配组合的美白功效，以此探讨美白复配原料对皮肤色素沉着的改善作用，旨在为今后美白复配化妆品的开发提供依据。
关键词美白剂；复配；黑色素瘤细胞中国素有“一白遮三丑”的审美观念，追求“肤如雪，凝如脂”历来是中国女性关注的热点话题。
目前，大多数美白剂的美白作用机制主要通过抑制酪氨酸酶活性、阻断黑色素合成过程、加速黑色素角质细胞脱落、抑制黑色素向角质细胞迁移、清除自由基等方面来改善皮肤黑色素沉着、肤色暗沉等问题[1-2]。
因此，美白型护肤品在化妆品领域的研究中具有较为广阔的市场和发展潜力。
实验部分01试剂与仪器烟酰胺、熊果苷、维生素C、凝血酸、光甘草啶、谷胱甘肽、白藜芦醇，广州品赫生物技术有限公司；FeSO4、水杨酸，天津市福晨化学试剂厂；三羟甲基氨基甲烷，上海润捷化学试剂有限公司；DPPH、邻苯三酚、酪氨酸酶，上海宝曼生物科技有限公司；B16小鼠黑色素瘤细胞株，北京北纳创联生物技术研究院；DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清，美国Gbico公司；DMSO、MTT、TritonX-100，美国MP Biomedicals公司。
UV-2600，CH紫外分光光度计，岛津公司；SC-3610低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；二氧化碳细胞培养箱，上海圣科仪器设备有限公司；Infinite M200 PRO酶标仪，帝肯贸易有限公司。
02实验方法2.1 单因素试验将维生素C(0.10、0.12、0.14、0.16、0.18mg/mL)、白藜芦醇(0.04、0.08、0.12、0.15、0.20mg/mL)、谷胱甘肽(0.03、0.05、0.08、0.10、0.12mg/mL)、光甘草叮(0.05、0.08、0.10、0.12、0.15mg/mL)、凝血酸(0.02、0.05、0.08、0.12、0.14mg/ mL)、熊果苷(0.25、0.30、0.35、0.40、0.45mg/mL)和烟酰胺(0.14、0.16、0.18、0.20、0.25mg/mL)分别以DPPH 自由基清除率为指标，考察7种美白原料的浓度对DPPH 自由基的抗氧化作用，根据其结果筛选出对DPPH自由基清除效果最好的3种美白原料，其为组合1。
黑木耳黑色素的研究综述
第34卷第1期 海南师范大学学报（自然科学版）V〇l.34N〇.l 2021 年3 月Journal of Hainan Normal University(Natural Science)Mar.2021Doi ： 10.12051/j.issn. 1674-4942.2021.01.010黑木耳黑色素的研究综述陈雅，徐苗，王欣宜，单欣荷，季琳凯，张拥军*(中国计量大学生命科学学院，浙江杭州310018)摘要：黑木耳是中国一种分布极为广泛且具有独特的营养价值与保健功能的食用菌，含有多 种生物活性化合物，其中黑色素是主要生物活性成分之一，且具有极高的安全性，可进一步开发具 备保健作用的功能色素，该方面的研究已初见成效且应用前景广阔。
文章综述了黑木耳黑色素的 理化性质、分子组成与结构表征、分离制备手段以及其清除自由基、抑菌抗病毒、抗辐射、改善肝损 伤、保护D N A等生物活性的国内外研究现状，分析了限制黑木耳黑色素开发应用的实际问题并提 出展望，并为今后黑木耳黑色素生物活性作用机制的研究及其在食品、药品、化妆品等领域的应用 提供参考。
关键词：黑木耳；黑色素；分离提取；生物合成；分子结构；生物活性中图分类号:0629.1 文献标志码:A文章编号：1674-4942(2021)01-0063-07Summary of Melanin of A u ricu la ria au ricu laCHEN Ya, XU Miao, WANG Xinyi, SHAN Xinhe, Jl Linkai, ZHANG Yongjun' (College of L ife Science,China Jiliang University,Hangzhou 310018, China) Abstract：Auricularia auricula is an edible fungus with a unique nutritional value and healthy function and is widely distributed in China. It contains a variety of bioactive compounds. Melanin is one of the main bioactive components with high safety. It can be further developed into func tional pigments with health care function. The research in this field has broad application prospects. In this paper, the physicochemical properties, molecular composition, structural characterization, separation and prej)aration methods of Auricularia auricula melanin, as well as its biological activities such as scavenging free radicals, antibacterial and antiviral, antiradiation, improving liver injury, protecting DNA and so on, were reviewed. The problems limiting the development and application of Auricularia auricula melanin were analyzed, and the prospects were put forward, which would be helpful for the study of the biological mechanism of Auricularia auricula melanin and its application in food, medicine, cosmetics and other fields.K ey w〇r d s：/lz/m*z//rtrirt ai/rzcw/a;melanin;separation and extraction;biosynthesis;molecular stnicture;biological activity黑木耳(4w r/c a/a r i Y/aur/cu/fl)隶属担子菌亚门（Basi(liomycotina)层菌纲（Hymenomycetes)木耳目（Auricu- I a r i a les)木耳科(A u r i c u1a riaceae)木耳属(yWfcw/rmVz )，为中国珍贵的药用和食用菌，早在19世纪，黑木耳就被 用于民间医药，用于治疗咽喉痛、眼痛、黄疸等病症，并作为收敛剂"_21。
负载酪氨酸酶抑制肽的牛奶外泌体抑制酪氨酸酶活性及黑色素生成研究
负载酪氨酸酶抑制肽的牛奶外泌体抑制酪氨酸酶活性及黑色素生成研究栗瑞斌;王倩;张雷杰;荆韧威;尹海芳【期刊名称】《天津医科大学学报》【年(卷),期】2022(28)4【摘要】目的:探讨酪氨酸酶抑制肽(YRS)功能化的牛奶外泌体(mEXOYRS),对酪氨酸酶活性及黑色素生成的抑制作用。
方法:通过超速离心法获取牛奶外泌体(mEXO);利用外泌体特异锚定肽CP05将YRS修饰在mEXO表面,获得mEXOYRS,随后通过流式细胞仪分析YRS的负载效率;在黑色素瘤细胞B16-F10中,检测细胞对mEXOYRS的摄取效率以及YRS与酪氨酸酶的共定位效率,评估mEXOYRS对B16-F10黑色素瘤细胞酪氨酸酶活性的抑制效果及对黑色素合成的抑制作用;进一步将mEXOYRS均匀涂抹于Nude BALB/c小鼠黑色素瘤细胞B16-F10所成皮下瘤模型上,评估其在体内对黑色素合成的抑制作用;通过对C57BL/6小鼠表面皮肤涂抹mEXOYRS,评估其对小鼠毛囊的着色程度及小鼠皮肤的美白效果。
结果:YRS通过外泌体特异锚定肽CP05高效负载至mEXO,并且不影响mEXO的形态结构及标志性蛋白的表达;在B16-F10黑色素瘤细胞摄取实验中,mEXO能够增强YRS与细胞内酪氨酸酶共定位的效率,在1周、2周及6周时均显著抑制细胞产生黑色素(F=56.117、48.954、560.006,均P<0.05);在Nude BALB/c小鼠黑色素皮下瘤模型中,与YRS组相比,mEXOYRS更好的抑制了黑色素的产生;在C57BL/6小鼠模型中,mEXOYRS降低了黑色素的产生,并显著降低了黑色素含量(F=173.083,P<0.05)及酪氨酸酶活性指标(F=34.156,P<0.05),取得了美白效果。
结论:YRS修饰的mEXO可通过内体转运途径,靶向运输到酪氨酸酶处,降低酪氨酸酶活性,并有效抑制黑色素生成,提高YRS的美白效果。
B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性测定方法
酪氨酸酶活性测定
一．实验材料
（一）仪器：倒置显微镜、96孔板、微量移液器（枪及枪头）、恒温培养箱、喷壶、脱脂棉、封口膜、培养瓶100ml、点滴瓶(250ml、500ml)、烧杯（500ml、50ml）、酒精灯、移液管、吸球、吸管架及瓶架、镊子、标签贴、超净台、酶标仪、超低温冰箱或液氮冷冻罐
（二）试剂：胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶、PBS液、75%酒精、左旋多巴、TritonX-100液
二．实验方法
采用多巴速率氧化法。
取对数期B16黑素瘤细胞，弃去培养液，用PBS液清洗2次。
调
节细胞浓度为0.5×104
—1×10
4
/孔相当于干细胞悬液5×10
4
—10×10
4
个（ml
-1
）,加入96
孔板中，每孔加入100ul。
过夜后（12h），细胞贴壁，使用同MTT法同浓度同体积的含药培养基加入，并设置对照组（细胞+培养基）和空白对照组（培养基），每个浓度组设置5个复
孔，培养基中均含5%胎牛血清，于37摄氏度5%CO2恒温培养箱中培养56h后，吸去培养液
后，用PH=7.4的PBS液洗涤2次，然后每孔加入1%TritonX-100液50ul，迅速与-80摄氏度冷冻30min,室温下融化，由于速冻过程是细胞破裂，加入0.5%左旋多巴20ul，37摄氏度下反应4h,酶标仪490nm处测吸光度A，以A表示酪氨酸酶活性。
（酪氨酸酶活性率=（A含药组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%）。
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黑色素细胞中黑色素含量的测定
和酪氨酸酶活性的测定方法
一、黑色素含量的测定
1.B16小鼠黑色素瘤细胞的准备
离心收集约107个细胞，再用PBS洗2次，离心条件为1000rpm、5min，细胞沉淀备用。
2.除杂
向细胞沉淀中加入200µL纯水重悬细胞，再加入1mL乙醇/乙醚混合液（体积比为1:1），充分摇匀并于室温下静置15min。
时间到后，该混合物于3000rpm，5min条件下继续离心，弃上清液，沉淀备用。
3.黑色素颗粒溶解与检测
向所得细胞沉淀中加入1mL10%的DMSO（用1MNaOH配制），充分振荡后于80℃条件下封口放置30min。
时间到后于470nm波长处检测吸光度值。
黑色素含量计算：
黑色素含量=A/细胞数
二、酪氨酸酶活性的测定
1.B16黑色素瘤细胞的准备
离心收集约107个细胞，再用PBS洗2次，离心条件为1000rpm、5min，细胞沉淀备用。
2.细胞裂解
想细胞沉淀中加入1mL0.5%脱氧胆酸钠，于0℃条件下放置15min。
3.酪氨酸酶活性的测定
时间到后，向以上混合物中加入3mL0.1%L-dopa（用0.1MpH=6.8的磷酸缓冲液配制，该反应混合液应在配制后2h内使用），反应温度37℃，于475nm波长处检测反应0min和10min时的吸光度值。
酪氨酸酶活性计算：
酪氨酸酶活性=（A0-A10）/细胞数。