肠神经干细胞研究进展

肠神经干细胞研究进展神经干细胞主要有两类：中枢神经干细胞和外周神经嵴干细胞。

中枢起源的神经干细胞研究颇多，而外周起源的神经干细胞研究还刚刚起步。

两者具有很多相似性。

目前研究表明，在肠道内有神经嵴来源的神经干细胞池[1]。

本文就肠起源的神经干细胞—肠神经干细胞（(Enteric neural stem cells，ENSCs)），对其生物学特性，迁移分化调控因素，应用前景等做一概述。

一．肠神经干细胞与肠神经系统具有多向分化潜能的干细胞可以从出生以后的人类及啮齿类动物的大脑、胰腺、肝脏、骨髓等获取，进行体外培养并研究其相关性状。

有报道，从肠管也可以获取干细胞[2] 。

这种细胞在个体中一生都存在，且可以分化为神经元、神经胶质细胞以及其他细胞，具备自我更新和多向分化潜能等干细胞特性，这种细胞即为“肠神经干细胞”(Enteric neural stem cells，ENSCs)。

肠神经干细胞起源于神经嵴。

在个体发育过程中，其通过迷走神经嵴在胚胎早期迁移进入肠道，从头端至尾端向成熟分化，发育形成肠神经系统[3]。

国内外研究者对其不同的命名，但通过分离培养以及生物学性状的研究证实为同一种细胞。

Morrison[4]等将其称为肠神经嵴细胞（Enteric neural crest cells ，ENCC）或肠神经嵴干细胞（Enteric neural crest stem cells，ENCSC），在胚胎发育时期或成年组织中，从消化道中分离出神经嵴干细胞,进行体外培养，并进行了一系列鉴定，证明其具备干细胞特性，且主要分化为神经元和神经胶质细胞。

Natarajan[5]等在研究中则将其称为“肠神经系统源性的多能祖细胞”(Enteric nervous system derived multipotential progenitor cells,ENSPCs)，从小鼠胚胎或出生后的肠管中制取单细胞，行体外培养后可以获取。

国外学者Y oung[6]和Suarez-Rodriguez [2]等在研究中则称其为“肠神经干细胞”（Enteric neural stem cells，ENSCs）。

肠神经干细胞和肠神经系统的发育密切相关。

脊椎动物的肠神经系统是外周神经系统中最复杂的部分。

它是由大量的、不同种类的神经元和神经胶质细胞构成的。

相互连接的神经节，围绕肠壁、外肌层、以及内部的粘膜下层的辐射轴，排列成两个同心圆状。

如同外周神经系统的绝大多数细胞一样，肠神经系统完全起源于神经嵴。

大多数肠神经系统的祖细胞产生于1-7 体节听泡后方的后脑迷走神经嵴。

从神经管脱离不久，迷走神经嵴亚群向腹外侧移动，聚集在中间后肢区，移向主动脉背侧颈丛腹外侧，在局部信号的影响下，迷走神经嵴细胞会诱导表达RET酪氨酸激酶受体。

在孕9.5 天至10 天这些RET+迷走神经嵴侵入前肠肌层，称为“肠神经嵴细胞”,即肠神经干细胞，接下来的 4 天，则会向尾侧迁移以定位于整个肠段。

发育过程中，如果肠神经干细胞迁移、定位失败，就会导致肠神经节的缺失，形成神经节细胞缺失症。

这种情况发生在结肠部位，会形成先天性巨结肠症，即神经节细胞缺失，导致分泌调节障碍和严重的肠道阻塞[6]。

肠神经干细胞与肠神经系统的发育密切相关。

肠神经干细胞的出现为研究肠神经系统的发育提供了一个较为理想的模型，可以来研究肠神经形成过程中的分化、调节的影响因素，为阐明神经发育提供有力的证据由此可解释肠神经系统发育和修复的一些机制，此外，肠管作为器官，易于进行活检，且肠神经分布丰富，其与中枢神经系统具有许多共性。

据此，可以就有可能采用肠神经干细胞对一些中枢或外周神经缺失性疾病行细胞移植替代治疗了。

二．肠神经干细胞的生物学特性作为干细胞，其特性简要概况即：①可自我复制更新，产生与自己相同的子代细胞，维持稳定的细胞储备②处于较原始的未分状态，无相应的成熟细胞的特异性标志③具有多向分化的潜能，即演变成不同类型成熟细胞的能力。

要识别肠神经干细胞，可以从三个方面加以鉴别：一是分裂能力；二是具有能分化成各种类型神经细胞的能力；三是具有未分化的原始神经细胞的表面标志物。

[7]其中第三点是在实践中应用最多，也最方便。

现将肠神经干细胞的几个表面标志物介绍如下：1. SOX10 基因早期的胚胎肠神经干细胞标记物是SOX10，由SRY BOX10 编码。

此基因属于一个高活性家族，在胚胎期的组织器官发育过程中起重要作用，因而在动物界广泛存在。

该基因的蛋白产物有DNA结合区，作为转录调节子在神经嵴来源的细胞中发挥作用。

SOX10 在未分化肠神经干细胞中表达，它可以抑制神经干细胞向神经节和神经胶质细胞的分化，因而对维持干细胞状态有重要作用[8]。

2003年Bondurand等[9]发现，SOX10 阳性的干细胞有增殖性，可自我更新，具多向分化潜能，并能够形成神经球。

同时这些细胞也可和GDNF反应，一旦有神经细胞分化形成，SOX10 的表达就会下调。

因此，SOX10 可作为未分化细胞很好的标记物。

2. p75p75是表面抗原低亲和力生长因子受体，一种跨膜糖蛋白，是鉴定神经嵴细胞的经典标记物。

p75表达于细胞膜表面，与BDNF，NT-3,NT-4/5有不同的亲和力。

在出生后的肠管中，该标记物表达于粘膜下层，神经血管丛处[10] 。

P75 表达强阳性的细胞具有多向分化潜能。

生后5－10天的动物细胞用P75 来分选培养，可得到肠神经干细胞。

仅有1－2％的细胞P75 表达阳性，所以获得的多向分化潜力的细胞的数量会比较少，而P75 随着培养时间会出现下调现象[1]。

3. RetRet是参与肠神经系统发育中最重要的基因。

它编码Ret酪氨酸蛋白激酶受体，是GDNF 家族的受体。

细胞培养中，GDNF 促进神经嵴干细胞迁移，但不影响分裂和生存。

Ret缺乏的大鼠肠道，其尾部很少有神经嵴干细胞移居。

因此，Ret基因对于神经嵴干细胞在肠道的迁移是必要的。

Ret在出生后培养的鼠肠未分化细胞中不再表达，因为它与PGP9.5 协同表达，而后者在完全分化的神经元细胞中呈阳性表达[9]。

4. NestinNestin是一种中间丝蛋白，又称巢蛋白VI，出现在神经上皮干细胞中，而当干细胞成熟时，该标记物表达就会消失。

Suarez-Rodriguez等[2]在研究中发现，体外培养肠神经干细胞，在培养早期（培养第 1 或 2 天），大约有30%的细胞对特异性的单克隆抗nestin抗体阳性（nestin+）。

Nestin表达在初期有所增长，然后维持一种相对稳定的状态，至培养后期，总细胞中仍有少量nestin+细胞。

免疫组化显示，伴随细胞向神经元和神经胶质细胞分化，这种表达会逐渐减少以至消失。

而Ehrmann[11]和Rauch[12] 却认为，虽然目前巢蛋白作为神经干细胞的标记物，但却不是一个特异性很高的标记。

因为在其它细胞类型中，如内皮细胞，CD34＋纤维原细胞，周细胞中也会有阳性表达。

而分化成脉管表面的周细胞看起来就是内皮细胞浸润的未分化间叶细胞[13]。

2002 年，V anderwinden [14]指出，如此广泛的表达使得巢蛋白特异性降低。

综上，目前尚无十分完美的肠神经干细胞标记物。

肠神经干细胞的鉴定仍需借助其生长、分化特性来综合考虑。

三．移植治疗肠神经系统的神经元和神经胶质细胞绝大多数是起源于迷走神经嵴干细胞。

胚胎发育早期，迷走神经嵴干细胞迁入近端肠管，并逐渐向远端肠管迁移，最后定位于整段肠管。

如果神经嵴细胞不能完全定居于肠管，就会形成先天性巨结肠，其特征是在远端肠管缺乏神经节。

先天性巨结肠是人类最常见的神经嵴病，在新生儿中发病率约为1：4500[15] ，其具有散发性和家族性，且常常伴有其他的发育疾病。

目前对于先天性巨结肠的治疗主要方式：手术切除无神经节的肠段，对剩余肠管进行缝合连接。

手术目的主要在于，去除肠道阻塞，修复肠管蠕动功能。

而手术的效果并不十分满意。

因为常伴有术后综合症，以及对肠管长期功能修复的失败。

对于全结肠型患儿，目前尚无有效的治疗方法。

现在还不清楚，术后蠕动功能失调，是由于手术本身造成的，还是因为患者有神经节的肠管部分也伴有神经节缺乏而造成的。

随着肠神经干细胞体外分离、纯化、培养的成功，设想将肠神经干细胞移植到无神经节的肠管上，使其分化为有功能的肠神经系统网络，以恢复肠管的正常功能。

这一设想如果成功，应用肠神经干细胞移植治疗神经缺乏性疾病将成为一种新型的、微创的治疗方法。

目前已经有科学家在这一方面进行了实验研究。

肠神经干细胞移植替代疗法具有可行性。

近年，已有科学家在啮齿类动物进行了实验，即将体外培养的肠神经干细胞移植到无神经节的肠上，观察到肠神经干细胞可以存活，并分化为神经元和神经胶质细胞。

Bondurand等[6]将从小鼠胚胎或出生后肠管中分离培养的干细胞神经球，用示踪剂DiI标记，接种到从E11.5正常小鼠分离出的肠管上，然后将肠管进行器官培养。

结果发现：移植后24h之内，细胞就会向四周迁移，并在最初移植部位周围形成一道DiI的光晕。

同样，将胚胎或生后肠管获取的神经球接种到离体的无神经节细胞症肠管上（Ret k-基因突变，肠管突变部位缺乏神经元和神经胶质细胞），进行肠器官培养后，神经球会发生类似的迁移现象。

应用免疫染色技术，移植区可以分别检测到神经元和神经胶质细胞的标志Tuj1和GFAP。

而非移植区及周围则检测不到相应标志。

从而证实体外培养的肠神经干细胞移植后可以存活，并会发生迁移及分化。

Sarah等[16]进行了类似的实验，成功分离、培养出胚胎或出生后的肠神经干细胞，并证实肠神经干细胞移植到无神经节的肠管上时，这些细胞能分化为神经元和神经胶质细胞。

除能从动物胚胎和生后个体中分离、培养肠神经干细胞或肠神经球外，现在已能从人类胚胎和生后个体的肠管壁成功获取神经干细胞。

Rauch等[17]使用来自人孕9周胎儿到5岁儿童的肠管标本，粉碎后在高浓度的EGF和FGF下进行细胞培养、获得神经球，并能够分化、植入离体的无神经节细胞肠管中后能够生长。

新近，Almond等[18]从人类新生儿提取肠神经干细胞，并在非粘附条件下培养产生神经球，移植入肠无神经节细胞症胎鼠的肠管组织培养块中，用免疫荧光显微镜观察细胞增殖、迁移和分化。

显示肠神经干细胞能从神经球中移行出来，分化成为胶质细胞和神经元。

Pachnis的实验室通过内镜微创组织收集，显示ENSCs能够来自肠段的活检，人类生后个体ENSC可来自各种不同诊断和年龄病人的肠管组织，尤其是从患先天性巨结肠儿童的正常肠管可以获得ENSC [19]。

上述与以下观点一致，即：从先天性巨结肠病人来源的ENSC发育而获取的神经元没有内在缺陷，以及神经干细胞生后早期存在于整个肠道。