NEB保护碱基各种酶切位点保护碱基
酶切位点所加保护碱基
99 (2)
LITMUS 29
LITMUS 29
pNEB193
SpeI
SacI
SacI
MluI
2
SacI
BamHI
1
97 (2)
LITMUS 29
HindIII
BglII
3
100 (2)
LITMUS 29
NsiI
BsiWI
2
100 (2)
LITMUS 29
BssHII
BspEI
2
1
100 (1)
8 (2)
LITMUS 39
LITMUS 38
BsrGI
BsrGI
BsrGI
2
1
99 (2)
88 (2)
8
10
12
0
10
10
0
25
50
Not I
TTGCGGCCGCAA
ATTTGCGGCCGCTTTA
AAATATGCGGCCGCTATAAA
ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT
AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
12
16
20
24
28
0
10
10
25
25
0
10
10
90
>90
Nsi I
Enzyme
Base pairs
from End
%Cleavage
Efficiency
Vector
Initial Cut
AatII
3
2
1
88 (2)
100 (2)
95 (2)
NEB保护碱基-各种酶切位点保护碱基
0
0
0
0
0
0
0
0
75
>90
75
>90
Nhe I
GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG
0
0
10
25
10
50
Not I
TTGCGGCCGCAA
0
0
ATTTGCGGCCGCTTTA
10
10
AAATATGCGGCCGCTATAAA
10
10
ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT
酶 Acc I Afl III Asc I Ava I BamH I Bgl II BssH II BstE II BstX I Cla I
EcoR I
PCR 设计引物时酶切位点的保护
寡核苷酸序列
GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG
CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG
0
0
0
25
0
50
75
>90
Pst I
GCTGCAGC
0
0
TGCACTGCAGTGCA
10
10
AACTGCAGAACCAATGCATTGG
>90
>90
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
>90
>90
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
0
0
Pvu I
CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA
25
90
AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
酶切位点所加保护碱基
BamHI
1
97 (2)
LITMUS 29
HindIII
BglII
3
100 (2)
LITMUS 29
NsiI
BsiWI
2
100 (2)
LITMUS 29
BssHII
BspEI
2
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100 (1)
8 (2)
LITMUS 39
LITMUS 38
BsrGI
BsrGI
BsrGI
2
1
99 (2)
88 (2)
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mMTris-HCl (pH 7.6),10 mMMgCl2,5 mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
>90
50
0
0
>90
50
EcoR I
GGAATTCC
CGGAATTCCG
CCGGAATTCCGG
8
10
12
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>90
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>90
Hae III
GGGGCCCC
AGCGGCCGCT
TTGCGGCCGCAA
8
10
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>90
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Hind III
限制性内切酶酶切位点及保护碱基
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260核苷酸。
取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl,25 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看酶切位点是指特定的序列，酶可以识别并在该位置切割DNA分子。
这些位点的特异性使得酶在分子生物学中广泛应用于DNA片段的定位和切割。
然而，在一些实验中，我们可能需要保护酶切位点周围的碱基，以免酶切，并且只在特定的位置引导酶切。
因此，保护碱基引物的设计对于实验的成功非常重要。
以下是保护碱基引物设计的一些建议。
首先，保护碱基引物的设计需要考虑引物的长度。
引物的长度通常为18到30个碱基，具体的长度需要根据实验的需求和酶切位点周围的序列特征来确定。
引物的长度应足够长，以确保引物和靶序列的特异性，但不应过长，以免引物形成二级结构或与非特异性位点结合。
其次，保护碱基引物的设计需要考虑引物的碱基组成。
在设计引物时，建议尽量避免引物中出现酶切位点周围的碱基序列，以防止酶的误切。
例如，如果我们希望保护酶切位点周围的AATTC序列，可以设计一个引物，其中没有AATTC序列。
同时，引物的碱基组成应尽量避免多聚核苷酸或含有GC碱基的片段，以防止引物之间的结合或引物与非特异靶序列的结合。
此外，保护碱基引物的设计需要考虑引物的特异性。
在设计引物时，建议使用特异性的引物序列，以确保引物只与目标酶切位点结合。
可以通过使用生物信息学工具，如BLAST，来验证引物的特异性。
引物的特异性还可以通过调整引物的长度和碱基组成来进一步提高。
最后，保护碱基引物的设计需要考虑引物的热力学性质。
引物的热力学性质包括引物的熔解温度（Tm值）和引物之间的配对。
引物的Tm值与引物的碱基组成、长度和引物与靶序列之间的碱基配对相关。
可以使用在线工具，如NEB的Tm计算器，来计算引物的Tm值，并对不同的引物进行比较。
此外，引物之间的配对可以通过设计引物的末端序列来调整，例如末端的碱基配对或非配对等。
总结起来，保护碱基引物的设计需要考虑引物的长度、碱基组成、特异性和热力学性质。
通过合理设计引物，可以保护酶切位点周围的碱基，并在特定位置引导酶切，为实验的成功提供有力的保障。
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看)
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments(oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1 μg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。
但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
酶切位点所加保护碱基
28
30
32
0
10
10
0
50
75
Sca I
GAGTACTC
AAAAGTACTTTT
8
12
10
75
25
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Sma I
CCCGGG
CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
TCCCCCGGGGGA
6
8
10
12
0
0
10
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10
10
50
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Spe I
CCGATCGG
ATCGATCGAT
TCGCGATCGCGA
8
10
12
0
10
0
0
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10
Sac I
CGAGCTCG
8
10
10
Sac II
GCCGCGGC
TCCCCGCGGGGA
8
12
0
50
0
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Sal I
GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
CCATATGG
CCCATATGGG
CGCCATATGGCG
GGGTTTCATATGAAACCC
GGAATTCCATATGGAATTCC
GGGAATTCCATATGGAATTCCC
8
10
12
18
20
22
0
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0
0
75
75
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限制性内切酶酶切位点及保护碱基
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260核苷酸。
取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl,25 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
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Pme I
GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG
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Pst I
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
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注释：
1．如果要加在序列的 5’端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的
5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在 3’端加保护碱基，就
在酶切位点识别碱基序列（红色）的 3’端加上相应的碱基（黑
色）。
2．切割率：正确识别并酶切的效率
CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
GGGT(A/T)ACCC
AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
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EcoR I Hae III Hind III Kpn I Mlu I Nco I Nde I
Nhe I Not I
Nsi I Pac I
GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG
GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA
CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG
切割率%
2 hr 20 hr
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寡核苷酸序列
GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG
CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA
CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG
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Xba I Xho I Xma I
CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG
CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG
CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA
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10
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Pvu I
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Sal I
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Spe I
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Sph I
GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT
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Stu I
AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT
TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG
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075>源自075>90
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CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG
GACGCGTC CGACGCGTCG
CCCATGGG CATGCCATGGCATG
CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC
NEB 保护碱基各种酶切 位点保护碱基
19882）
集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
酶 Acc I Afl III Asc I Ava I BamH I Bgl II BssH II BstE II BstX I Cla I
PCR 设计引物时酶切位点的保护
0
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GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
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GAGTACTC AAAAGTACTTTT
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GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG
TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
3。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。