实验五讲义 线粒体的分离与观察
实验报告线粒体观察
实验报告线粒体观察实验报告：线粒体观察引言线粒体是细胞内的重要器官，它们在细胞呼吸过程中起着至关重要的作用。
线粒体的结构和功能对细胞的生存和代谢过程有着重要影响。
因此，对线粒体进行观察和研究，可以帮助我们更好地理解细胞的生物学功能和疾病的发生机制。
实验目的本实验旨在通过显微镜观察细胞中线粒体的形态和数量，并探讨不同条件下线粒体的变化。
实验材料和方法1. 细胞培养物2. 显微镜3. 荧光染色剂4. 细胞培养基5. 细胞培养器具实验步骤1. 将细胞培养物放置在显微镜下，调节放大倍数至适当的范围。
2. 使用荧光染色剂染色细胞，使线粒体呈现出荧光信号。
3. 观察细胞中线粒体的形态和数量，并记录观察结果。
4. 在不同条件下重复以上步骤，比较不同条件下线粒体的变化。
实验结果在显微镜下观察，我们发现线粒体呈现出不同形态和数量。
在正常细胞中，线粒体呈现出椭圆形或长圆形，分布均匀，数量适中。
而在受到外界刺激或疾病影响的细胞中，线粒体的形态和数量可能发生变化，出现肿胀、变形或减少的情况。
讨论与结论通过本次实验，我们成功观察到了细胞中线粒体的形态和数量，并发现了不同条件下线粒体的变化。
这些观察结果为我们更深入地了解线粒体在细胞生物学过程中的作用提供了重要的参考。
未来，我们可以进一步探讨不同疾病状态下线粒体的变化，以及寻找针对线粒体的治疗方法，为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
结语线粒体观察实验为我们提供了重要的信息，帮助我们更好地理解细胞的生物学功能和疾病的发生机制。
通过不断深入的研究，我们相信线粒体观察将为细胞生物学和医学领域的发展带来新的突破和进展。
小鼠线粒体的分离与观察
小鼠肝线粒体的分离与观察生科三班2011/5/2实验目的1 了解提取线粒体的基本原理及其过程，掌握差速离心法分离细胞器。
2 通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般形态。
3 巩固普通染色步骤及注意事项。
实验原理线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。
正由于这样，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中，大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取，当所用样品较少时（如电镜和光镜的观察）可采用从组织培养细胞中提取。
本实验是介绍从小鼠肝细胞中提取线粒体并在光镜下观察的方法。
线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，是能量转换的重要细胞器。
细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心。
在一给定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内食物，由于沉降速度不同将停留在不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可一次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程注意使样品保持4℃，避免酶失活。
本实验用的是Ringer缓冲液作为悬浮介质。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法，詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由此吸引堆积在线粒体膜上，线粒体 cell色素氧化酶，使该料保持在氧化状态，呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
细胞器线粒体的分离与观察
细胞器线粒体的分离与观察高熹1120152430（李安一）（北京理工大学生命学院16121501班）摘要：差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。
此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。
离心分离出细胞核与线粒体，进行染色，对细胞核和线粒体的形态进行观察并记录。
关键词：差速离心法；细胞核；线粒体；实验。
1 引言差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
线粒体是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。
细胞种的能源物质——糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸华生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行的。
制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。
在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一均匀悬浮介质中离心某一时间内，组织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉降的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意样品保持4，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。
实验五用高倍显微镜观察叶绿体和线粒体
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果与分析 • 结论与讨论
01 实验目的
掌握高倍显微镜的使用方法
熟悉显微镜的结构和 操作步骤，包括调节 焦距、对光、移动载 玻片等。
了解显微镜的保养和 维护，确保实验结果 的准确性和仪器的使 用寿命。
用纸巾轻轻按压盖玻片，去除多余的 液体。
用镊子夹取染色后的组织块，放在载 玻片上，盖上盖玻片。
用高倍显微镜观察叶绿体和线粒体
将制作好的临时装片放在显微镜 的载物台上。
调整显微镜的焦距，使观察到的 图像清晰。
仔细观察叶绿体和线粒体的形态、 分布和数量。
记录观察结果
01
用笔记录观察到的叶绿体和线粒体的形态、分布和 数量。
高倍显微镜的工作原理
高倍显微镜是一种光学仪器，通过透镜的放大作用，将微小的物体放大并清晰地呈 现出来。
高倍显微镜通常配备有多个透镜，包括物镜、目镜和聚光镜等，以实现更高的放大 倍数和更好的观察效果。
在观察叶绿体和线粒体时，高倍显微镜能够提供足够的放大倍数和分辨率，使观察 者能够清晰地看到它们的形态和分布。
掌握高倍显微镜的使 用技巧，如选择合适 的放大倍数、调整光 圈大小等。
了解叶绿体和线粒体的形态和分布
通过观察不同植物或组织切片， 了解叶绿体和线粒体的形态特征，
如大小、形状、数量等。
学习如何识别和区分叶绿体和线 粒体，了解它们在细胞内的分布
情况。
了解叶绿体和线粒体在不同类型 细胞中的差异分布和功能特点。
培养实验操作技能和观察能力
通过实验操作，培养学生对微 观世界的观察能力和动手能力。
训练学生使用显微镜进行观察、 记录和分析实验结果的能力。
细胞核和线粒体的分离和观察
结果： 描述5张涂片镜下情况
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简 意赅地阐述观点。
讨论：
一． 实际情况和理论预期是否符合？为什么？ 二． 本实验步骤有哪些可以改进的地方？
二、实验原理
杆状玻璃匀 浆器法
融法
超声波处理 法
细胞破碎的方法
#2022
细胞破碎的注意事项：
二、实验原理
（二）分离纯化的方法
根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心成为亚细胞 组分分离过程中最广泛应用的技术
离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差 异进行分离、浓缩和提纯的一种方法
布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒 体 显 色 ， 而 胞 质 中 的 染 料 被 还 原 成 无 色 。 （ 也 可 使 用 罗 丹 明 1 2 3 或 M i t o Tr a c k e r 等 荧 光 探针标记法等） 细胞核：DNA——亚甲基蓝、甲苯胺蓝、Hoechst染料等
滤液以 2500rpm，离 心15分钟；
一．缓缓取上清液，移入高速离 心管中，保存于有冰块的烧杯 中，待分离线粒体用；
二．同时涂一张上清液片②做好 标记，自然干燥；
三．余下的沉淀物进行下一步骤。
用6ml 蔗糖一Tris-HCI溶液悬浮沉淀 物，以2500rpm离心15分钟弃上清， 将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴 于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。
03
缺点是：①分离效果差，不 能一次得到纯颗粒；须经反 复悬浮和离心加以纯化。② 壁效应严重，特别是当颗粒 很大或浓度很高时，在离心 管一侧会出现沉淀；③颗粒 被挤压，离心力过大、离心 时间过长会使颗粒变形、聚 集而失活。
线粒体的分离与观察一、实验目的1.初步掌握用差速离心
三、实验用品
1.材料：鸡肝脏 2.器材：高速离心机、解剖刀剪、烧杯、冰浴、漏斗、纱布、匀浆器、高压灭菌锅 3.试剂：0.9%灭菌的生理盐水、1%詹纳斯绿B 染液、 0.25mol/L 蔗糖十
盖玻片，镜检。 结果：线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
五、实验报告
1. 分别描述三张涂片的结果(如平均每个视野中所见完整的细胞核数量,完整的 细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少等)
2. 描述两张线粒体装片的观察结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体 的纯度如何?
六、实验建议
1.注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长， 以保持组分生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中进行。
2.将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防匀 浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。
3.姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应用液不可使用。
差速离心提取鸡肝线粒体流程如下图：
分离细胞核
鸡肝2克匀浆
↓
匀浆过滤
↓
滤液
↓
将滤液2ml覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上
↓
1200rபைடு நூலகம்min 离心10min
↓
↓ 沉淀（涂片①自然干燥）
↓ 上清液1
（细胞核及碎片）
↓
洗涤（加0.25mol/L预冷蔗糖溶液 2ml 混匀，2500r/min 离心15min）
上清液
3. 分离物鉴定
(1) 细胞核：取细胞核沉淀1 滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹 干，滴1滴Gimesa染液染色10min。自来水冲洗，干燥后，镜检。
线粒体的分离及活性测定实验原理及步骤
实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内唯一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。
线粒体结构和功能上的研究至今一直是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。
一、仪器与设备：1.冰冻高速离心机，或万转/分离心机。
2.组织捣碎机或匀浆器。
3.冰浴，研钵、漏斗、纱布（尼龙布）、量筒、微量注射器、移液管、试管等。
4.瓦氏呼吸器（氧极普测试系统）。
5.显微镜、冰浴。
6.分光光度计。
二、材料与试剂：1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。
2.TriS-HCl（0.05M，pH7.2）缓冲液。
3.磷酸缓冲液（0.2M，Ph7.2）。
4.提取洗涤液：在1000ml溶液中含有甘露醇（0.35M）、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml），EDTA（0.001M），TriS-HCl（0.01M，pH7.2）缓冲液。
5.悬浮液（同试剂4，但不加BSA）。
6.反应液：在1000ml溶液中含有甘露醇（0.35M）、蔗糖（0.25M）、KCl（10ml，pH7.2）、EDTA（0.2mM）、MgCl2（5mM）、TriS-HCl（10mM，pH7.2）。
7.反应底物：α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。
三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素（物理和化学的）作用而失活，特别是膜的完整性极为重要，因为只有完整的线粒体才能进行有氧呼吸。
所以在分离操作中要掌握以下几个要点：[1].整个过程要保持在低温下（0-4 o C）进行。
[2].要注意分离介质的pH值，pH值应和被采用的材料一致。
[3].捣碎时间要控制得当，或匀浆适度，争取获得更多的完整线粒体。
实验五 用高倍显微镜观察叶绿体和线粒体
实验目的
1．使用高倍显微镜观察叶绿体和线粒体的形态和分布。
2．识别光学显微镜下的叶绿体和线粒体。
2．实验原理
（1）叶绿体的观察植物绿色部位的细胞中含有叶绿体。如果将叶片的横切片制成临时装片，就可以在显微镜下观察到叶绿体。某些植物幼嫩的叶也可直接用于观察叶绿体。
②健那绿染液先称取10 mg健那绿溶于1 mL等渗溶液中，用滤纸过滤。再取滤液加入49 mL等渗溶液中，即为染色液。
4．操作要点
（1）制作临时装片
①在观察黑藻前10 min，用40 °C的水浸泡黑藻的叶。这样的叶用于制作临时装片，便于观察到黑藻的叶绿体随细胞质而流动。
②在适宜的温度下制作人的口腔上皮细胞临时装片。可以将健那绿染液保持在37 °C，尽可能使人的口腔上皮细胞在染色期间保持在生活状态。
③用健那绿染液染色时，要染色10～15 min。在此期间要适当添加染液，以保证细胞不干燥。
（2）观察
①观察时，注意通过调整光圈来调节反射光线的强弱，使进入物镜的光线不要太强。
①观察时，注意通过调整光圈来调节反射光线的强弱，使进入物镜的光线不要太强。
分析Байду номын сангаас论
1．选择观察叶绿体的实验材料时，应注意什么问题？
2．具有较多线粒体的细胞在功能上有什么特点？
3．为什么用健那绿染液作为观察线粒体的染色剂？
4．细胞中的叶绿体和线粒体的共同特点是什么？
操作指南
1．材料 藓类、菠菜或黑藻的叶，人的口腔上皮细胞，洋葱内表皮细胞。
2．用具 显微镜，载玻片，盖玻片，滴管，镊子，消毒牙签。
3．试剂及配制方法
（1）试剂 清水，健那绿染液。
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精品
一、实验目的
1.对分离得到的线粒体进行活性鉴定。 2.掌握用差速离心技术分离制备线粒 体的方法。
二、实验原理
细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能 性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就 要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种 物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织 制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释 放出来。
离心技术概述
离心技术是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受 到一个向外的力这一原理而发展起来的一种分离 技术。
离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运动受到 一个向外的力。与角速度和旋转半径有关。
相对离心力又称相对离心加速度，是指离心力相 当于重力加速度的倍数，表示“数字×g”。
离心力g＝1.11×10-5n2r
（二）密度梯度离心
（density gradient centrifugation）
A等速度沉降，B等密度沉降
用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度 梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重 力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
密度梯度离心法是用密度具有梯度的介质来替换 离心管中的密度均一的介质，使介质分为不同的 层次，浓度的低的在上层，浓度高的在底层。将 细胞匀浆加在最上层，随后离心。这样，不同大 小、形态、密度的颗粒就会以不同的速度向下移 动，集中到不同的区域，可以分别收集。
差速离心法是指有低速到高速逐级沉淀分离，使 较大的颗粒先在较低速中沉淀，再用较高的转速 将原先悬浮于上清夜中的较小颗粒分离沉淀下来 ，从而使各种亚细胞组分得以分离。
但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心 十是均匀分布于整个离心介质中的，故每级分离 得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，需 经反复悬浮和离心加以纯化。
涂片过程：
五、实验结果
光学显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或 哑铃状。
五、实验报告
实验目的 实验用品 实验原理 实验方法 思考题
六、思考题
1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进行 ？
2.绘制玉米黄化苗的线粒体装片的观察结果,根据你 的实验结果,分析所分离的线粒体的纯度如何?
细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗 糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相，在一 定程度上，能保持细胞器的结构和功能，保持酶 的活性，避免细胞器的聚集。
三、实验材料、用品 1.器材： 剪刀，漏斗，研钵，纱布，离心管，显微
镜，冷冻高速离心机等。 2. 材料： 玉米黄化苗
四、玉米线粒体及细胞核的分离 从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能
研究外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核 外基因――线粒体DNA等目的。
分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差数 离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L 甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去 后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。 牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为 竞争性底物削弱蛋白酶的作用。
r为离心机中轴到离心管远端
的距离
n为离心机每分钟的转速（
r/min）
1000g=9.8牛（N）
离心技术类型
离心技术可用于细胞器的分离。 离心技术一般包括：差速离心和密度梯度离心
（一）差速离心
（differential centrifugation）
在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离 不同大小的细胞和细胞器。
实验方法 1）剪取1～2cm长的玉米黄化苗15g，剪碎；加3倍体积 的预冷的分离介质，冰浴上研磨成匀浆。 2）匀浆用双层纱布过滤. 3）滤液700Xg离心10分钟，除去核和杂质沉淀 。 4）上清夜10 000Xg离心10分钟。 5）沉淀为线粒体,可以存于0.3mol/L甘露醇中。 6）涂片，立即滴加1% 詹纳斯绿B染液，染色20分钟， 盖上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。 PS:以上匀浆化及离心均控制在0~4℃进行。
(1)匀浆(Homogenization)低温条件下， 将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质( 即0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之成 为各种细胞器及其包含物的匀浆。
(2)分级分离(Fractionation)由低速到高速离 心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀， 再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉 淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、 线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和 密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整 个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉 淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮 和离心加以纯化.
(3)分析 分级分离得到的组分，可用细胞化 学和生化方法进行形态和功能鉴定。
中性红-詹纳斯绿染色
詹纳斯绿（Janus green B）是对线粒 体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱 性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积 在线粒体膜上。由于线粒体内具有细胞色 素氧化酶系，能使詹纳斯绿保持在氧化状 态（淡蓝绿色），在胞质区詹纳斯绿则被 还原为无色。中性红的阳离子可与带有一 定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原 生质与细胞核染色。
1.试剂 1）分离介质：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的 Tris-HCl缓冲液（pH7.4），3 mmol/L EDTA ，0.75 mg/ml BSA（牛血清蛋白）。 2）保存液：0.3 mol/L 甘露醇（pH7.4）。 3）20% NaClO（次氯酸钠）溶液。 4）1% 詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 2.器材 剪刀，漏斗，研钵，纱布，离心管，显微镜， 冷冻高速离心机等。
细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异， 因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同 。根据这一原理，常用不同离心
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀 浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进 行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级 分离和分析三步，这种方法已成为研究亚 细胞成分的化学组成、理化特性及其功能 的主要手段。