根尖压片技术
非洲凤仙根尖染色体制片技术及细胞学研究
非洲凤仙根尖染色体制片技术及细胞学研究孔红;王宝增;马建军;姚虹;纪鑫蕊【摘要】对非洲凤仙(Impatiens walleriana Hook.f.)进行染色体研究,旨在为多倍体育种提供细胞学资料.以非洲凤仙根尖为材料,采用常规压片法制片,光学显微镜观察染色体. 结果表明,根尖8:00~9:00取材、在4℃下0.002 mol/L的8-羟基喹啉预处理2 h的处理组合效果最佳. 间期核由一些大大小小的染色较深的异染色质颗粒构成,间期核属于前染色体型. 前期染色体由染色较深的异固缩节段和染色较浅的常染色质节段相间排列而成,较多地分布于细胞中央,前期染色体属于渐变型. 中期染色体数目2n=16,为二倍体.核型公式为:2n=2x=16=14m+2sm,其中第一对为近中部着丝点染色体,其余均为中部着丝点染色体,未观察到随体. 最长染色体与最短染色体的比值为1.56,臂比大于2的染色体占12.5%,核型属2A型,核型不对称系数为54.8%,为对称的核型. 该种的核型为首次报道.%In order to provide necessary cytology information on polyploid breeding,the cytology of Impatiens walleriana Hook.f. had been studied by the conventional squashing method. The results showed that the optional root sampling time was 8:00~9:00, 0.002 mol/L 8-Hydroxyquinoline for 2 h at 4℃ had better effect; the interphase nuclei and prophase chromosomes were found to be of the prochromosome type and the interstitial type, respectively. The number of the somatic chromosome was 16, and it was diploid. The karyotype formulae was 2n=2x=16=14m+2sm. The first pair of chromosomes were submetacentric, and oth-ers were metacentric, there was no observed satellite. The ratio of chromosome length, i.e., ratio of the length of the longest chromosome to that of the shortest one was 1.56.The percentage of chromosome with arm ratio beyond 2 was 12.5%. The karyotype was 2A and the AsK was 54.8%. The karyotype was reported for the first time.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2015(054)021【总页数】3页(P5324-5326)【关键词】非洲凤仙(Impatiens walleriana Hook.f.);细胞学;染色体;核型;染色体制片【作者】孔红;王宝增;马建军;姚虹;纪鑫蕊【作者单位】廊坊师范学院生命科学学院,河北廊坊 065000;廊坊师范学院生命科学学院,河北廊坊 065000;廊坊师范学院生命科学学院,河北廊坊 065000;廊坊师范学院生命科学学院,河北廊坊 065000;廊坊师范学院生命科学学院,河北廊坊065000【正文语种】中文【中图分类】S681.1;Q343.2非洲凤仙(Impatiens walleriana Hook.f.)为凤仙花科凤仙花属植物，原产于非洲东部热带地区。
植物染色体压片法
第一部分植物染色体压片法一实验目的1. 学习并掌握根尖处理、染色、压片及制片观察的方法。
2. 观察有丝分裂各时期染色体的形态变化，了解有丝分裂全过程。
二实验原理高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎尖生长点及幼叶等器官的分生组织(分生区)，其中根尖是最常用的材料：①根尖取材容易，操作和鉴定也比其它器官与组织方便；②实验室内采用种子萌发后所长出的新鲜幼嫩根尖，不受植物生长季节的影响和限制，并且可以大量获得；③对于某些珍贵而又稀少的试验材料，取用自然条件下生长植株的根尖，比取用茎尖、花器等对材料的伤害要小得多；④采用实验室内种子发根，切取根尖后的种苗通常还可以进行正常种植，利于后续研究进行。
有丝分裂期在整个细胞周期中所占的时间相对较短，有丝分裂制片的主要目的是进行染色体鉴定，希望观察到更多分裂相，尤其是分裂中期相，通常要对材料进行不同的预处理。
预处理主要通过抑制和破坏纺锤丝的形成来获得更多的中期分裂相；同时，预处理还可改变细胞质的粘度，促使染色体缩短和分散，便于压片和观察。
常用的预处理有物理法、化学法、混合处理法等。
植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用，分生组织的细胞壁结构将分生细胞结合成一个整体，因此在压片之前需要采用适当方法软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离，这一操作称为解离。
同时，解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。
常用的解离方法主要有酸解法和酶解法。
酸解法：步骤简便、容易掌握。
根尖分生组织经过酸解和压片后，呈单细胞。
酸解法广泛用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察及相关分析。
酶解法：常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换研究。
通过解离和压片，分生细胞的原生质体能够从细胞壁里压出，使染色体周围不带有细胞质或仅有少量细胞质，让后续制片处理直接作用于染色体。
在普通光学显微镜下观察染色体形态结构还需要对材料进行染色，通常采用染色体染色效果好而细胞质着色少的碱性染料、酸性染料或孚尔根试剂染色。
实验三 植物根尖细胞压片技术
实验三植物根尖细胞压片技术一、实验目的：通过植物根尖细胞有丝分裂制作，掌握植物根尖细胞有丝分裂过程观察的取材、固定、染色和制片方法；熟练掌握十字压片法的原理与操作要领；进一步熟悉有丝分裂的过程。
二、实验原理：有丝分裂是生物体细胞增殖的主要方式。
细胞核内染色体能准确复制，有规律的、均匀的分配到两个子细胞中，保证遗传物质的稳定性，对于物种的延续有重要意义。
有丝分裂是一个连续的过程，可分为前期、中期、后期和末期，即两次分裂的间期。
高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，由于根尖取材容易，操作和鉴定方便，因此用植物根尖为观察材料。
三、实验材料蚕豆根尖、豌豆根尖、洋葱根尖、玉米根尖等。
四、实验用具及药品恒温水浴锅、培养皿、载玻片、盖玻片、标签纸、镊子、刀片、解剖针、木夹、吸水纸、滤纸、铅笔、显微镜、电脑等。
无水酒精及梯度酒精、1mol/L盐酸、1%乙酸洋红、卡诺氏固定液、秋水仙碱、对二氯苯、8-羟基喹啉等。
五、实验步骤（1）取材：取植物根尖（2cm）2个，放入试管中，用蒸馏水冲洗2-3次洗净；（2）解离：将蒸馏水倒净，加入1mol/L盐酸至没过根尖，将试管放在60℃很温水浴锅内，解离5-20分钟（15分钟左右）。
（3）染色：然后将倒掉盐酸，用蒸馏水洗涤数次，将材料中的盐酸洗净（以便染色），取出根尖，放到载玻片上，用吸水纸将洗净的材料吸干，用刀片切下根尖1-2mm部分；用另一个干净的载玻片十字交叉盖在材料上，用力按下（不可以移动），揭开两个载玻片，分别滴上1%乙酸洋红，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余染色液，用手指轻压盖玻片可用铅笔橡皮端轻敲玻片，是根尖充分分散。
（4）镜检制好的玻片，先用低倍镜下观察，再用高倍镜（40倍），找到有丝分裂的各分裂相。
六、实验作业与结果分析提交作业，完成绘图（间期、前期、中期、后期和末期）。
分析实验结果（无论成功失败）。
压片法制片
1. 压片法在生物技术上，除用切片法观察细胞外，还可用压片法，尤其是观察细胞中的染色体数目，用压片法最为合适，不仅省事，结果也比切片法好。
压片法是将材料置载玻片上，用解剖刀或解剖针拨开，加染液一滴，盖以盖玻片，施以压力，使材料破碎，细胞分散，然后进行观察。
压片法种类很多，下面介绍两种：(1). 醋酸——洋红法此法多用于制备幼小花药，观察花粉母细胞减数分裂的压片。
而对根尖压片有时染色不好(但对洋葱根尖染色较好)。
其步骤如下：a. 将花药或根尖(先切成0.5cm长)，投入卡诺氏固定液中固定1刻钟至l小时，然后移至70％酒精中保存。
b. 取固定保存的材料放入盐酸酒精解离液(95％酒精一份，浓盐酸一份，将二者混合即成)中5～8分钟。
或置1N盐酸(取比重1.19的盐酸82.5毫升，加水至1000毫升即成)中于60℃的水浴温度下，处理6～8分钟，至透明为止。
c. 用清水冲洗干净解离液。
d. 取洗净的材料，放在载玻片上，用醋酸洋红染液(或醋酸苏木精染液)染色5～10分钟。
e. 然后将材料移至另一清洁的载玻片上。
重新用染液装片，覆以盖玻片，以铅笔的橡皮头端轻轻压盖玻片，使材料呈现分散的薄层，置镜下观察。
(2). 铁矾——苏木精法此法一般用于细胞有丝分裂中的染色体计数，由于染色体被染成紫兰黑色，用于显微照相，效果较好。
（由于各种植物有自己的特殊性，因此，取材的时间、取材的部位、预处理的时间、固定的时问、水解的时间、染色的时间等，都有可能不同。
在此只作了大致的介绍，具体材料还需作预备实验进行摸索。
另外还要注意，各次水洗一定要洗干净沾在材料上的药液，以免影响下一个步骤的结果。
）染色步骤如下(以蚕豆根尖作材料为例)：a. 取材：将蚕豆种子萌发。
待种子根长至1cm左右，在上午8时～11时之间，切下长约0.5cm的根尖，进行预处理。
b. 预处理：目的使分裂细胞的染色体缩短和比较分散，便于压片观察。
预处理是在固定以前进行，方法是将材料切下放入以下溶液：0.05～0.2％秋水仙碱水溶液中处理2～5小时；或：对二氯苯饱和水溶液中处理3-5小时；或：8-羟基奎啉(0.004～0.005％)，处理2～12小时；或：富民隆乳剂(0.01％)，处理24～48小时；或：在0～3℃下冷冻处理24小时。
根尖压片实验(使用)
实验2 植物染色体压片法
一、实验原理
植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。
二、实验目的
通过实验，掌握根尖染色体压片法。
三、实验材料
小麦的种子。
四、实验步骤
（1）催芽：5-20粒种子放入培养皿（铺两层滤纸），有一薄层水。
室温下浸种24h左右。
（2）低温预处理：待种子刚萌发时（露白），放入4℃冰箱处理1-2天（一般为1天，24～36h也可）。
（3）生根：将培养皿中的水吸干。
种子腹沟朝下。
放入25℃培养箱中17～20h，不光照。
一般在头一天的早上10点左右放，第二天10点左右取根。
一天中取根较好的时间在早上10点左右，下午4点左右。
（4）取材：当根生长到0.5-2cm时，取根尖0.5cm左右，放入盛水试管中（取根时速度尽量快）。
（5）预处理：在1-4℃下，离体处理24-36小时，最好放在冰浴中，置4℃冰箱。
（6）固定：用卡诺氏Ⅰ（C arnoy’sⅠ）固定液，无水乙醇或95%乙醇：冰乙酸(体积比)=3：1，固定2—7天，4℃冰箱中存放或冰浴中。
（7）转入70%乙醇中保存（-20℃可长期保存）。
第（8）可以不要：（8）根尖处理：将根尖从保存液（70%乙醇）中取出，清水冲洗，加入1N盐酸适量，65℃水浴7-8分钟，取出清水冲洗，
放入锡夫试剂，20分钟后观察（制片观察）。
实验一物染色体压片技1.
实验一植物染色体压片技术一、实验原理：植物染色体压片技术是利用化学或物理的方法，将具有分裂能力的细胞保持原有的分裂状态，并对其染色体进行染色，压片后观察它的染色体分裂的一种方法。
二、实验目的：植物染色体压片技术是细胞遗传学和细胞分类学等研究中应用最为普遍的基本技术，是其他新技术所不能完全取代的，是从事染色体研究的工作者首先应该掌握的一项基本的实验方法。
三、材料的制备：黑麦根尖（2n=14根尖材料的制备：1. 浸泡:大、油、壳一浸泡24h（23~25C ;小、裸的不浸泡。
2. 发根:将材料放入具有团粒结构条件的土壤中培养（锯木屑、土壤、砾石、麦杆、谷草；最适温度（23~32C;培养24h^再放入0~4°C冰处理1~7天。
目的:（1使分裂速度减慢，根尖长度整齐一致；（2调节工作时间。
再将材料从冰箱中取出又放回最适温度条件下培养1~2天;待根尖长度为1.5~2Cm即可处理。
3. 愈伤材料的制备:（适合春、夏两季用刀片将树杆割去保护组织露出伤口，用75%乙醇消毒包裹一天，再用50~75ppm赤霉素处理；几天后长出白色幼嫩的愈伤组织即可固定。
四、预处理:1. 方法:（化学和物理两种（1化学方法：（适合所有生物a. 秋水仙素0.05~0.2% （白色粉末,易溶于水的巨毒药品；b. 0.002M 8-羟基喹啉（淡黄色晶体，用少量的乙醇溶解再稀释，对禾本科植物的随体表现很清楚；C. a溴萘饱和液（淡黄色的乳浊液,易溶于乙醇和苯；难溶于水,100ml水中倒入1~2滴剧烈的振动5分钟；（以上abc三种药剂在15~18C温度下处理3~5hd.对二氯苯饱和液（淡黄色的晶体，难溶于水;具有强烈的腐蚀性，只能处理1~1.5h。
（2物理方法：（适合禾本科作物，本次实验所采用冰水混合物在0~4C温度下处理24h。
预处理的目的破坏或抑制纺锤体形成；增加中期图象，改变细胞质的粘度，使染色体缩短变粗，易于染色体的显带及研究。
根尖压片实验报告
一、实验目的1. 掌握植物根尖压片实验的基本操作步骤。
2. 观察植物细胞有丝分裂中期染色体的形态特征。
3. 学习对染色体进行计数，了解植物细胞有丝分裂过程中染色体数目的变化规律。
二、实验原理有丝分裂是植物细胞分裂、体细胞增殖的主要方式。
在有丝分裂过程中，细胞核内染色体准确地复制，并有规律地、均匀地分配到两个子细胞中，使子细胞和母细胞具有同样数目和形态结构的染色体，保证了植物细胞的遗传性状的一致。
根尖压片实验通过药物处理使细胞分裂停止在中期，便于观察染色体的形态特征和计数。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：洋葱根尖、黑麦根尖、玉米根尖、小麦根尖、蚕豆根尖等。
2. 仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、解剖针、镊子、滴管、酒精灯、酒精灯架、酒精、盐酸、无水乙醇、冰醋酸、碱性品红、苏木精、秋水仙素、饱和对二氯苯等。
四、实验步骤1. 解离：将洋葱根尖剪取2～3mm，放入盛有质量分数为15%的盐酸和体积分数为95%的酒精混合液的玻璃皿中，室温下解离3～5分钟。
2. 漂洗：用镊子取出解离后的根尖，放入盛有蒸馏水的玻璃皿中漂洗约10分钟。
3. 染色：将漂洗后的根尖放入盛有碱性品红的玻璃皿中，染色3～5分钟。
4. 制片：将染色后的根尖用解剖针轻轻压在载玻片上，盖上盖玻片。
5. 压片：用拇指轻轻按压载玻片，使根尖细胞相互重叠，便于观察。
6. 观察：在显微镜下观察根尖细胞有丝分裂中期染色体的形态特征，并对染色体进行计数。
五、实验结果与分析1. 观察到洋葱根尖细胞有丝分裂中期染色体的形态特征：染色体呈棒状，有两条染色单体，染色质均匀分布，核仁明显。
2. 对染色体进行计数，发现洋葱根尖细胞有丝分裂中期染色体数目为16条。
3. 通过对其他植物根尖细胞有丝分裂中期的观察和计数，发现不同植物根尖细胞有丝分裂中期染色体数目存在差异，如小麦根尖细胞有丝分裂中期染色体数目为14条，玉米根尖细胞有丝分裂中期染色体数目为20条。
六、实验讨论1. 实验过程中，解离、漂洗、染色等步骤对实验结果有重要影响。
广宁红花油茶根尖压片制作技术
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９ ％ 乙醇： 冰 乙酸 （ ： １ 固定 液 中 固定 ８～１ 。 ５ ３ ） ２ｈ ２ ２ ３ 解 离 将 根尖 转入 １ｍ ｌＬ盐酸 ：４ ％冰 乙酸 （ ：１ 的混合 液 ，０Ｃ水 浴 ３ ； １ｍｏ Ｌ盐 酸在 ．． ｏ ／ ５ ２ ） ６￣ ０Ｓ 或 ｌ ／ ６ ￣ 水浴 １ ０Ｃ下 ０～１ ｉ 。该方 法不 需要 先切取 根 尖 的分 生 区部分 。 ５ｒｎ ａ Ｊ
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根尖压片技术
原理：在细胞分裂周期中，核内遗传物质染色体会呈现规律性的变化，通过固定、染色和压片，在显微镜下可观察到有丝分裂各时期的细胞和染色体。
材料准备（材料培养-剪取根尖）
1、预处理
秋水仙碱0.01-0.05%1-4小时（可阻碍纺锤丝的形成，染色体变粗而平直，分散度好，便于记数）
2、固定：采用化学试剂迅速杀死细胞，保持细胞内部的原有结构，并对以后的染色体和压片没有影响的方法。
（卡偌固定液：乙醇：冰醋酸=3：1）低温下2-24小时。
3、保存：70%乙醇
操作程序
浓盐酸：乙醇=1：1 蒸馏水切成几块
解离——————————→漂洗————→选取根尖分生组织—————→染色室温下5-6分钟
改良液1-2滴
————————→盖片—→敲片—→烤片—→压片—→镜检—→石蜡封片—→标签5分钟
植物染色体压片法
一、实验原理
植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。
二、实验目的
根尖染色体压片法，是观察植物染色体最常用的方法，也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。
三、实验材料
大蒜（Aillumsativum）、洋葱（Aillumcepa）的鳞基或蚕豆（Viciafaba）的种子。
四、实验器具和药品
1.用具：染色板，载玻片，盖玻片，指管，温度计，试剂瓶，滴瓶，镊子，解剖针，毛边纸。
2.药品：无水酒精，70％酒精，冰醋酸，对二氯苯或秋水仙素，醋酸钠，碱性品红，石碳酸，甲醛，山梨醇，纤维素酶，果胶酶，中性树胶或油派胶（Euparal），二甲苯。
卡诺固定液的配制：用3份无水酒精，加入1份冰醋酸（现配现用）。
酶液的配制：以0.1mol/L醋酸钠为溶剂，配成纤维素酶（2％）和果胶酶（0.5％）的混和液。
染色液的配制：配方Ⅰ.石碳酸品红（Carbol.fuchsin），先配母液A和B。
母液A：称取3克碱性品红，溶解于100毫升的70％酒精中（此液可长期保存）。
母液B：取母液A10毫升，加入90毫升的5％石碳酸水溶液（2周内使用）。
石碳酸品红染色液：取母液B45毫升，加入6毫升冰醋酸和6毫升37％的甲醛。
此染色液含有较多的甲醛，在植物原生质体培养过程中，观察核分裂比较适宜，后来在此基础上，加以改良的配方Ⅱ，称改良石碳酸品红，可以普遍应用于植物染色体的压片技术。
配方Ⅱ：改良石碳酸品红
取配方Ⅰ.石碳酸品红染色液2—10毫升，加入90—98毫升45％的醋酸和1.8克山梨醇（sorbitol）。
此染色液初配好时颜色较浅，放置二周后，染色能力显著增强，在室温下不产生沉淀而较稳定。
五、实验说明
1.根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料，有些植物种子难以发芽，或仅有植株而无种子，也可以用茎尖作为材料。
2.植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响分裂周期，对于一个不太熟悉的实验材料，最好在特定温度下长根，掌握有丝分裂高峰期，以便得到更多的有丝分裂的细胞。
3.前处理的目的是降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成，让更多的细胞处于分裂中期，一般在分裂高峰前，把根尖放到药剂中处理3—4小时。
可处理的药剂很多，如秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉等。
4.解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易分散压平，解离方法有酸解法和酶解法。
（1）酸解法是用盐酸水解根尖，步骤简便、容易掌握，广泛应用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察。
根尖分生组织经过酸解和压片后，都呈单细胞，但是大部分分裂细胞的染色体还包在细胞壁中间。
（2）酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换等项研究，通过解离和压片，使分生细胞的原生质体，能够从细胞壁里压出，再经过精心的压片，使染色体周围不带有细胞质或仅有小量细胞质，致使多项制片措施直接作用于染色体。
六、实验步骤
（一）将大蒜或洋葱的鳞基，置于盛水的小烧杯上，放在25℃温箱中，待根长到2cm左右时，在上午九时摘下根尖，放到对二氯苯饱和水溶液，或0.02％秋水仙素溶液中，浸泡处理3—4小时。
（二）经过前处理的根尖，再放到卡诺固定液中，固定24小时。
固定材料可以转入70％酒精中，在4℃冰箱中保存，保存时间最好不超过二个月。
（三）这里介绍两个解离方法，可以根据实验需要选择使用。
1.酸解：从固定液中取出大蒜或洋葱根尖，用蒸馏水漂洗，再放到
0.1mol/LHCl中，在60℃水浴中解离8—10分钟，用蒸馏水漂洗后，放在染色板上，加上几滴改良石碳酸品红染色液，根尖着色后即可压片观察。
2.酶解：取大蒜或洋葱的固定根尖，放在0.1mol/L醋酸钠中漂洗，用刀片切除根冠以及延长区（根尖较粗的蚕豆，可以把根尖分生组织切成2—3片），把根尖分生组织放到醋酸钠配制的纤维素酶（2％）和果胶酶（0.5％）的混合液中，在28℃温箱中解离4—5小时，此时组织已被酶液浸透而呈淡褐色，质地柔软而仍可用镊子夹起，用滴管将酶液吸掉，再滴上0.1mol/L醋酸钠，使组织中的酶液渐渐渗出，再换入45％醋酸。
酶解后的根尖，如作分带或姊妹染色单体交换，可用45％醋酸压片，如作核型分析或染色体计数等常规压片，可放在改良石碳酸品红中染色，经过酶处理的组织染色速度快。
（四）压片，把染色后的根尖放在清洁的载玻片上，用解剖针把根冠及延长区部分截去，加上少量染色液，并盖上盖玻片。
一个解离良好的材料，只要用镊子尖轻轻的敲打盖玻片，分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层，再用毛边纸把多余的染色液吸干，经显微镜检查后，选择理想的分裂细胞，再在这个细胞附近轻轻敲打，使重叠的染色体渐渐分散，就能得到理想的分裂相，要达到这个目的，必需掌握以下几点：
1.压片材料要少，避免细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展的余地。
2.用镊子敲打盖玻片时，用力要均匀，若在压片时稍不留意，使个别染色体丢失，而被迫放弃一个良好的分裂相的细胞。
（五）封片。
把压好的玻片标本，放在干冰或冰箱结冰器里冻结。
然后用刀片迅速把盖玻片和载玻片分开，用电吹风把玻片吹干后，滴上油派胶加上盖玻片封片，或经二甲苯透明后，滴中性树胶，加盖玻片封片，做成永久封片。
七、结果
拍摄根尖染色体的分裂相。