基础毒理学第六章重点

根据实验结果对毒物进行毒性评价，称为一般毒性评价(evaluationfor general toxity)。

毒物的一般毒性作用研究是毒理学的重要内容；是化学物毒理学安全性评价和危险度评定的基础；防治毒物所致急、慢性中毒；制订卫生标准及管理毒理学决策均有重要意义。

一般毒性(general toxicity)分为:急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性所进行的用以观察毒效应、评价化学毒物综合毒性的哺乳动物试验分为：急性毒性试验、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验一般毒性评价目的：1.确定受试物毒作用表现和性质；2.确定受试物毒作用剂量-反应/效应关系；3.确定毒作用靶器官；4.确定损害是否可逆。

一般毒性品评价试验动物选择：物种选择：1.吸收、代谢、生物化学和毒理学特征与人类最接近；2.易于饲养和操作；3.经济、易获得；4.自然寿命不太长。

品系：品系纯化，有稳定性和可比性；选用两种以上动物级别:清洁级或以上动物；SPF(无特殊病原体动物）及GF（无菌动物）性别：一般为雌雄各半；敏感性有性别差异时应选择敏感的性别年龄、体重：1.急性毒性评价试验用成年动物2.亚慢性、慢性评价试验用年幼或初断乳动物体重不超过平均体重20%，或按规定。

检疫：检疫期内出现异常者应放弃。

染毒方式：1.经口(胃肠道）染毒:喂饲、灌胃、吞咽胶囊；2.经呼吸道染毒：吸入接触（静式吸入动式吸入）、受试物注入动物气管3.经皮肤染毒：定性试验、定量试验4.经注射途径染毒：腹腔注射、静脉注射、肌内注射、皮下注射。

急性毒性(acute toxicity)：指机体(人或实验动物)一次接触或24h内多次接触化学物后，短期(14d内)发生的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化及死亡效应。

一次接触指瞬间给实验动物染毒，如经口、经注射途径染毒。

但经呼吸道或经皮，则指在特定期间使动物持续接触化学物的过程。

“一次”含有时间因素。

此外，当化学物毒性很低需给予较大剂量时，可在24h内多次给予，这时的急性接触即为“多次”。

急性毒性试验的目的：○①测出化合物一种或几种动物的LD50及其它急性毒性参数，以了解急性毒作用强度；②探索急性毒性的剂量-反应关系，并通过观察中毒表现和死亡的情况，了解急性毒作用性质、可能的靶器官，初步评价对人损害的危险性。

③为进一步毒理学试验剂量设计提供参考。

④提供毒理学机制研究的初步线索。

急性毒性试验常用参数○1最常用的是LD50（或LC50）○2其次为Zac(LD50/Limac)○3在一些毒性上、下限指标中，目前主张用LD84/LD16或LC84/LC16的比值。

○4比较2种以上，LD50相同/近似的毒物的致死毒性时还可用毒物的剂量-反应曲线斜率(死亡率概率单位与剂量对数回归直线的斜率)表示。

急性毒性试验物种选择:以选择哺乳动物为主，首选大鼠：年龄与性别：成年大鼠，一般雌雄各半；雌、雄分别求LD50。

若是为致畸试验作准备，可仅作雌性LD50。

染毒剂量与分组：○1了解化学物的一般性质○2预实验剂量设计：有相关资料（找出近似化合物资料、设定预期毒性中值、以4倍计量差为组距设计剂量组）；无相关资料（最大耐受剂量试验、最低剂量组试验）○3正式试验剂量设计：寇氏法、改进寇氏法（又称Karber法或平均致死量法）；Horn 法；Bliss法（又称最大似然性法）。

○4经典方法替代方法：限量试验、固定剂量法、急性毒性分级法、上-下移动法【改进寇氏法：利用剂量对数与死亡率呈S型曲线设计，又称Karber法或平均致死量法。

优点：计算简便、准确率高。

要求：每组动物数相同，组距等比，死亡率呈正态分布，最低剂量组死亡率＜20％，最高剂量组死亡率＞80％。

Bliss法：又称最大似然性法，是最精确的LD50计算方法。

我国《新药临床前毒理学研究指导原则》及《新药(西药)毒理技术要求规范》均推荐此法。

设计要求不像前三法那么苛刻。

但计算较复杂，多利用计算机软件(如中山医科大编制的《多功能半数致死量软件》)运算。

Horn氏法：利用剂量对数与死亡率的概率单位呈直线关系而设计，又称平均移动法或剂量递增法。

优点：省动物；可直接查表求出LD50及其95％可信限。

缺点：LD50的95％可信限范围大，方法精确度不够。

○1分4个剂量组；每组动物数相等，4或5只；○2剂量组距为等比；按剂量范围宽窄，分2个剂量系列（组距2.15倍或组距3.16倍）。

○3根依据每组动物数、组距和每组死亡数，查表求出LD50及其95％可信限。

序贯法：利用序贯设计原理，又称平均数法、阶梯法或上-下法，先用一剂量试验，若动物死亡，则用下一个较小剂量试验，若仍死亡则以更小剂量试探；如动物存活,则以较大剂量试探，依次类推,最终求出LD50。

优点：节省动物，一般12～14±只即够。

缺点：只适于快速出现中毒反应及死亡的毒物，不适合迟发性毒物。

】动物数与分组：根据评价程序规定采用的LD50计算方法。

○1概率单位法、改进寇氏法、Bliss 法要求5~7个剂量组，每组10只动物或10只以上；○2霍恩氏（Horn）法要求4个剂量组组动物，每组4或5只；○3序贯法（平均数法、阶梯法、上-下法）：由第一只动物反应决定第二只接受剂量，一般使用12~14只；○4固定计量法：4个剂量，每个剂量至少10只；○5急性毒性分级法：平均2~4个阶段，每阶段3只。

急性毒性替代试验：○1固定剂量法：预先选定或固定的一系列剂量染毒，观察化学物的毒性反应，进行分级。

不以动物死亡为观察终点。

○2急性毒性分级法：应用于啮齿类动物，以死亡为终点从三个固定剂量中选一个，分阶段进行。

每阶段3只，根据死亡动物数进入下一阶段，以较高或较低水平进行试验。

○3上下移动法：以死亡为终点，需要选择一个较合适的剂量范围。

根据资料初步确定第一个动物接受的剂量，由该动物染毒后反应，决定第2只动物接受的剂量。

试验周期与毒效应观察：○1LD50(LC50)，要求计算染毒后14d内的死亡数。

○2对速杀型毒物，可按24h死亡率求LD50(LC50)，与14dLD50(LC50)往往无明显差别，但报告中应注明为24hLD50(LC50)，便于毒性比较。

○3观察中毒表现，对了解急性毒作用特征很重要，可补充单纯以LD50(LC50)表示急性毒性的不足。

中毒表现：○1中毒症状：出现的中毒症状、时间、发展经过、死前特征及死亡时间等。

主要观察内容见表6-2。

○2体重：在观察期14d内称存活动物体重变化，以了解毒效应持续时间。

○3病理检查及其它指标：死亡动物及时作大体解剖和病理组织学检查，观察期结束时对存活动物进行大体病理检查，必要时做组织病理学检查。

○4死亡及死亡时间：观察和记录每只动物的死亡时间，特别是最早死亡时间及各组死亡数。

LD50 意义：○1标化化学物毒作用强度，评价毒性大小；○2计算毒性剂量距离；○3为后续的试验提供参考剂量；○4比较不同途径的LD50值，提供生物利用度信息；○5LD50试验结果外推至人的致死剂量和中毒症状。

LD50试验局限性：可提供的有效信息少；波动性大；物种差异、个体差异明显；经典试验耗费动物较多。

局部刺激试验（local toxic effect）：亦称局部刺激试验，指机体暴露与化学物后，在其接触和暴露部分造成的局部毒性损伤、刺激（如眼刺激、皮肤刺激）和或变态反应等。

局部刺激试验目的：○1了解外源化学物对皮肤、眼睛的局部刺激性和腐蚀性，包括眼刺激、皮肤刺激试验。

○2在我国，农药、化学品和消毒剂试验程序规定局部刺激试验为必做项目眼刺激试验观察终点：○1眼刺激：眼前表面接触受试物后眼睛产生可逆性炎症变化；○2眼腐蚀：眼前表面接触受试物后眼睛产生不可逆性组织损伤。

观察内容：○1结膜：红、球结膜水肿、分泌物○2角膜：混浊范围及程度○3虹膜：充血、肿胀、角膜周围充血。

观察期限：一般为7天，必要时可延长至21天皮肤原发性刺激试验观察终点：皮肤刺激和皮肤腐蚀；观察内容：色斑、水肿。

观察时间：症状消失或出现不可逆刺激，不超过14天。

不适宜做皮肤刺激试验情况○1强腐蚀性物质（pH<=2,pH>11.5)；○2急性经皮试验显示强系统毒性；○3急性经皮试验染毒剂量至2000mg/kg 时无皮肤刺激。

影响因素：1.皮肤完整性；2.固态受试物物理特性；3.受试物溶解状态；4.受试物染毒时封闭严密程度；5.实验动物年龄及受试部位；6.动物种属差异；7.个人主管判断差别；8.人实际接触受试物方式与试验动物接触方式差异。

皮肤反应敏感性顺序：兔>豚鼠>人>猪；试验结果外推至人时应注意眼刺激替代试验：鸡胚绒毛膜尿囊膜试验、绒毛膜尿囊膜苔盼蓝染色试验、荧光素漏出试验皮肤刺激替代试验：人工皮肤模型皮肤致敏：对化学物的免疫介导反应在皮肤上表现出一系列症状。

人体可见瘙痒、红斑、水肿、丘疹、小水疱、大疱等。

动物反应常仅见红斑和水肿。

皮肤致敏试验分为福氏完全佐剂法、不加佐剂法（不加佐剂，抗原量增大到10~20倍）皮肤致敏试验目的：预测化学物经皮接触对人引起皮肤致敏的危害皮肤致敏试验方法：检疫——脱毛、观察有无破损—（24小时后）—诱导接触—（10～14天）—激发接触—（24h后）—观察结果（24h、48h、72h）——分析评价。

观察内容：色斑、水肿皮肤刺激试验与皮肤致敏试验的区别：○1皮肤刺激试验：一次接触一定时间后观察可逆或不可逆作用，一般观察不超过14天；○2皮肤致敏试验：a诱导接触：低浓度或中等浓度受试物对皮肤重复染毒；b间隔10~14天；c激发接触：低于诱导剂量对动物未染过毒的皮肤涂抹，观察24h、48h、72h皮肤反应短期、亚慢性和慢性毒作用蓄积作用(accumulation)储存库(depot)。

物质蓄积(material accumulation)功能蓄积(functional accumulation)蓄积作用意义：○1蓄积作用是慢性中毒的基础。

○2求出蓄积系数K，了解化学物蓄积毒性的强弱，为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供基础资料。

应用：○1若大鼠经口LD50＞5000mg/kg，或已作过代谢试验有T1/2数据者，可不做蓄积毒性试验。

○2注意急性非致死性实验主要靶器官是否与亚急性试验一致。

蓄积系数法：以生物效应为指标，用经验系数(K)评价蓄积作用，即将多次染毒与一次染毒所产生的毒性效应(或死亡)进行比较。

蓄积系数(accumulation coefficient)：是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量[ED50(n)]与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)的剂量[ED50(1)]的比值，即K＝ED50(n)/ED50(1)，试验中多用小鼠或大鼠，以死亡一半为效应指标，K值计算公式也可改为K＝LD50(n)/LD50(1)蓄积系数分级标准：蓄积系数(K) 蓄积毒性分级＜1 高度蓄积1～明显蓄积3～中等蓄积5～轻度蓄积K值↓→蓄积性↑蓄积系数法优点：方法简便，对评价蓄积作用有一定价值。