神经元细胞培养
神经细胞的培养
海马神经元的培养总结1.新生大鼠海马常规取法：断头，线剪剪去皮肤，组织剪从椎管纵向剪开颅骨，再颅顶横向剪一刀。
暴露两侧大脑半球，用小弯镊翻出大脑，延纵裂分别向两侧翻开大脑半球，在底部可见新月形的海马，用眼科镊取出置于冰浴的盐溶液中，在解剖镜下剥离周围组织和血管膜。
2.培养基：我用的接种培养基是DMEM/F12+10的胎牛血清＋胰岛素＋葡萄糖＋谷胺酰胺，维持培养基里就是多加了5uM的阿糖胞苷。
培养液的pH调至6.8—7.4可，最好不要调至7.4或高。
一般在培养液放置两周后，加入终浓度为2mM的谷氨酰胺3.胰酶：酶用0.125的。
其实一次性消化比较简单，关键是消化时间不要太长，不知你用多长时间，一般是15-20分。
4.多聚赖氨酸的配置：可以用去离子水配, 也可以用D-HANKS也配(我用的配方),或者PBS 效果都差不多. 一般先配成1mg/ml的母液, 用高压过的滤器过滤,最好分装以后放在-20度, 用的时候再稀释至0.01mg/ml.5.铺板：我的办法是将盖玻片直接经泡酸后要反复的洗干净，用单蒸后用双蒸水。
后放在75％的酒精中浸泡半个小时以上，在超净台中取出后用酒精灯烧一下，注意不要太久，以防破碎，后放在24或6孔板中，加入稀释好的多聚赖氨酸，室温放置3小时以上或过夜，切记不要照紫外，可以在上面覆盖东西。
结束后回收多聚赖氨酸，并用灭菌水或PBS等清洗三遍以上即可使用，我用的效果非常好。
6. 1. 盖玻片洗净之后, 需要泡酸过夜处理, 这样玻片会比较干净, 养原代背景会干净的多. 就算是新的也要洗(曾经有过教训).2.包被多聚赖氨酸用之前要用高压的去离子水洗3遍,再用D-HANKS过一遍.3. 多聚赖氨酸包被时,如果有条件可以放在4度振摇过夜,效果更佳.4. 神经元细胞种植之前1小时把种植培养基加进去,会提高细胞活力.7.纯化细胞方法：1.差速贴壁：接种前可将制备的细胞悬液放入底面积为75cm2的培养瓶中（未包被），然后放入37度，5%CO2培养箱中半小时，然后再过滤，转移至培养皿/瓶中。
原代神经元培养
神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。
器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。
辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。
2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。
目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。
4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。
5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。
用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。
neurobasal 神经细胞培养步骤
neurobasal 神经细胞培养步骤
神经细胞培养使用的神经基底培养基（Neurobasal）通常包括
以下步骤：
1. 准备培养器具：将所需的培养器皿（如细胞培养皿、培养瓶等）进行灭菌处理，确保无细菌或其他污染物。
2. 制备培养基：根据厂家提供的说明书，将神经基底培养基配制好。
通常需要将粉末溶解于培养基补充剂（如B27或N2）中，并加入适量的血清等。
3. 细胞分离：将神经组织（如海马、皮质等）分离并收集。
可以使用酶（如胰酶、纤溶酶等）或机械切割方法（如切割刀或离心式分离）。
4. 细胞孵化：将分离的细胞在预先灭菌的培养器皿中分散均匀，加入预先配制好的培养基。
5. 营养物质补充：在培养基中加入适量的营养物质，如氨基酸、维生素等，以促进细胞生长和分化。
6. 培养条件调节：将培养器皿放入恒温培养箱中，并保持适宜的温度（通常为37°C）和湿度，同时提供适量的CO2（通常
为5-10%）。
7. 细胞观察和维护：每天观察细胞的生长情况，检查细胞形态和健康状况。
适量更换培养基，以保持培养环境的稳定。
需要注意的是，具体的步骤可能会因实验设计的不同而有所差异，因此最好参考实验操作手册或厂家提供的指导。
此外，神经细胞培养也需要一定的专业知识和操作经验，对于初学者来说可能需要辅导或指导。
神经元细胞培养步骤
海马神经元细胞培养一、实验前准备1.手术器械、培养皿、筛网的消毒2.多聚赖氨酸的配制3.培养板处理：（培养板中可加入小的圆形玻片，多次使用）(1)用多聚赖氨酸室温包被5min，随后吸取多余液体，晾干。
(2)用PBS洗一遍，吸取PBS后晾干备用。
4.胰酶的配制5.PBS的配制二、操作步骤1. 新生一天的小鼠，酒精喷洒全身，置于干净的培养皿中，用手术剪刀剪下头部，放入另外一个干净的培养皿中（五只）。
2.用干净镊子取出全脑放于（冰）的PBS的培养皿（10cm）中，置于解剖显微镜下。
3.移入解剖显微镜下，分离出皮层或海马组织，去除血点，移入盛有HOOD下的培养皿中。
4.将皮层或海马组织剪成1-3mm的小块，用0.25%，2ml胰酶-EDTA 消化，37ºC水浴消化30分钟，每消化10分钟振摇一下。
30分钟后，用移液枪吸取可见组织，放入离心管中，并加入与胰酶等体积的DMEM （HG）+10% FBS培养液终止消化，吹打20次左右，注意动作轻柔，不要吹打出气泡。
5.如果组织明显不能吹散或粘稠的话，过一下200目筛网。
过滤液DMEM，进入大离心管中。
离心800r，3min。
弃去上清，加入DMEM 培养液，分装在培养皿（6cm）中，放入含5% CO2 的37C恒温培养箱内培养。
6.6-8小时（或第二天）后换液，用PBS液先洗两遍，并上下左右摇晃10次左右，去除一些细胞碎片，随后培养液换成Neurobasal 培养液+B27（2%）+谷氨酰胺（0.5mM）（+双抗)继续培养，并且3天半换液一次。
7.到第八天时，将培养液换成新鲜Neurobasal无B27、谷氨酰胺、双抗，开始用于实验。
神经元原代培养方法
神经元原代培养方法
从孕17-18天的雌鼠的胎儿分离神经元细胞。
孕雌鼠麻醉然后解剖，胎
儿收集到HBSS-1中然后快速断头。
剥离脑膜和白质后，大脑皮质收集
入 HBSS-2 液中机械磨碎。
皮质碎片移到有0.025%胰酶的HBSS-2液中3 7°C消化15分钟。
胰酶消化后，细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲
洗两次，用神经基础培养液重悬细胞（培养液添加了0.5mM左旋-谷氨
酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/mL庆大霉素）。
以1×105c
ell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上，放到37°C，5%CO2
湿温培养箱里进行培养。
每3天用吸管换液，一次换0.5mL。
体外培养8
天细胞就能用于实验。
选用17-18天的胎鼠能够提高神经元培养的效率，因为与乳鼠相比胚胎
组织的细胞连接还很少。
因此，用乳鼠会使神经元的分离更加困难，
会造成细胞连接不可逆的损伤，细胞之间的共同的轴突和树突更容易
发生损伤。
另外，用出生后1天内的大鼠皮质培养容易有胶质细胞污染，而用胎鼠则可以避免这种情况。
如果用的是乳鼠，一般是在培养36个
小时后加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞生长。
另外，如果把分化的影响看成是考虑的重要因素，可以用培养4天的、
8天的、18天的细胞。
其中一个例子可以是观察毒性物质对小孩和成年
的不同效应。
神经元细胞培养步骤
神经元细胞培养
灭菌准备：
1、将玻璃培养皿（3个）、滤器（清洗、换滤片、锡纸包裹）放入盒中、将盒拿到桶中灭菌
2、将显微镜搬至超净台灭菌
3、将直头镊（1个）、弯头镊（1个）放入盛有酒精的小烧杯，放入超净台
材料准备：17天孕鼠、冰块、75%酒精、50mL离心管、PBS、胰酶、培养基、双抗、注射器、灭菌的显微镜、灭菌的玻璃培养皿（3个）、10cm培养皿（1个）、计数器、包被好的培养板
1、处死孕鼠，取小鼠，放入50mL离心管（冰块上），移至超净台，
2、将小鼠倒入盛有PBS的玻璃培养皿中，关灯，开显微镜
3、将头取出（左手直头镊，右手弯头镊），放入盛有PBS的玻璃培养皿中
4、夹取皮层（皮质及髓质），放入盛有PBS培养皿中，移去显微镜
5、将PBS倒入50mL离心管
6、用枪弃去PBS，再以PBS洗3次，晃匀
7、弃去PBS，加入5mL胰酶，放于37℃细胞培养箱内5分钟
8、弃去胰酶，以PBS洗2次，吸掉
9、加入5mL PBS,对着底面吹打成悬液
10、吸至50mL离心管中，
11、灭菌后的滤器置于15mL离心管，用注射器将细胞加入，抽空气再吹数次
12、离心，25℃，1500rpm，5分钟
13、配制培养液，混匀
14、弃上清，将离心管中加入5mL培养液，吹打成悬液
15、再加入5mL培养液，再次吹打
16、加1滴加至计数器中央，显微镜下观察，
17、20—50个/每16小格，即20—50 ×104 = 2—5×105，若密度加大，则加入培养液稀释
18、加100uL至96孔板中（四边不用），晃匀，
19、放37℃细胞培养箱。
各类神经元细胞的培养方法
各类神经元细胞的培养方法神经元细胞是神经系统中的主要细胞类型之一，负责传递神经信息和调控神经功能。
神经元细胞的培养是神经科学研究和临床治疗的重要工具。
通过细胞培养，可以研究神经元的发育、功能和病理机制，同时也可以应用于药物筛选、组织工程和神经修复等领域。
下面将介绍一些常用的神经元细胞培养方法。
1.原代培养2.细胞系培养细胞系是已经建立起来的可持续增殖和培养的细胞株。
细胞系培养可以使用血清或无血清培养基。
通常，将细胞系继代传代，以保持其细胞特性和增殖能力。
细胞系培养可以持续扩大细胞数量，并用于大规模试验和应用，如药物筛选和基因表达研究等。
3.单细胞培养单细胞培养是将单个神经元细胞分离和培养。
首先，通过机械或酶消化方法将神经组织分散为单细胞悬浮液。
然后，通过单细胞分选技术，将单个神经元细胞分离并分配到各个培养孔中。
最后，单个细胞通过培养基提供的营养物和因子进行生长和分化。
单细胞培养是研究神经元个体特性、细胞发育和功能的重要手段。
4.同代培养同代培养是将同一类型的神经元细胞培养在同一培养物中，以形成功能连通的细胞群。
同代培养可以通过多孔膜培养皿、微流控芯片和三维支架等技术实现。
通过细胞之间的相互作用和联结，同代培养可以模拟神经系统的复杂性和功能，用于研究神经网络特性和神经系统发育。
5.共培养共培养是将不同类型的细胞培养在同一文化器皿中，以研究细胞之间的相互作用和信号传递。
常见的共培养方法包括胶质细胞和神经元细胞的共培养，以及神经元细胞和非神经元细胞的共培养。
共培养可以提供更接近体内情况的环境，用于研究细胞间相互作用和细胞发育过程。
成年鼠皮质神经元培养方法
成年鼠皮质神经元培养方法
神经元是大脑中最基本的神经细胞类型，对于神经科学研究具有重要意义。
成年鼠皮质神经元的培养和维持对于研究神经系统疾病、药物筛选和神经再生等方面具有重要意义。
下面将介绍一种常用的成年鼠皮质神经元培养方法。
材料和方法：
1. 成年鼠的大脑组织。
2. 无菌生理盐水。
3. 0.25% 胰蛋白酶。
4. 0.1% DNase I.
5. 神经元培养基。
6. 神经元培养补充剂。
7. 聚-L-赖氨酸涂层的培养皿。
8. 离心管。
9. 离心机。
10. 显微镜。
步骤：
1. 收集成年鼠的大脑组织，并迅速置于无菌生理盐水中。
2. 将大脑组织切成小块，加入0.25% 胰蛋白酶和0.1% DNase
I 消化酶液中，在37°C下消化30分钟。
3. 用离心机离心，去除上清液，将细胞沉淀加入神经元培养基中。
4. 将细胞悬浮液均匀地滴加到聚-L-赖氨酸涂层的培养皿中，培养皿预先用神经元培养基预涂。
5. 将培养皿置于37°C的细胞培养箱中，培养2-3周，每周更
换一次培养基。
6. 使用显微镜观察神经元的形态和生长情况。
通过以上方法，可以成功地培养成年鼠皮质神经元，为神经科学研究提供了重要的实验材料。
这种方法可以应用于研究神经系统疾病的机制、药物的筛选以及神经再生的机制研究等领域，对于推动神经科学的发展具有重要的意义。
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神经元细胞培养
1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks’平衡盐液中。
2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。
3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。
4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。
重复上述步骤2～3 次。
5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。
6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打成单细胞悬液。
7. 细胞计数，调整细胞密度按（700000个）1.5×105/cm2 种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。
(1)把细胞悬液用(DMEM＋20%FBS)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成2% B27
的neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。
（+0.5mmol/L谷氨酰胺）
鉴定
1.形态学的观察，在DIC下可以很清楚的看到神经元特有的形态，轴突树突以及胞体非常
明显。
2.免疫学鉴定：正如楼上几位所说，NF（神经丝）或者tubulin 或者MAP2等都是目前
鉴定神经元的Marker,不论你好似免疫荧光还还是免疫组化，阳性表达即可！
3.在进一步你可一做mRNA水平的实验，也就是RT-PCR了。
这就更能支持2的阳性表达
了。
4.电生理学的鉴定：测定神经元特有的电生理学也是证据之一啊！
从以上几个方面去做，应该能证明是神经元了！
错误之处还请赐教！
TUJ1。