考马斯亮兰G_250法测定苹果浓缩汁生产中的蛋白含量
考马斯亮蓝测蛋白实验报告(干货分享)
考马斯亮蓝测蛋白实验报告实验二：分光光度计的学习之考马斯亮蓝G—２50法(Bradｆord法)测定蛋白质含量定一实验目的学习分光光度计的基本原理和使用方法，并使用考马斯亮蓝Ｇ-２5０法测定蛋白质含量.二实验原理考马斯亮蓝Ｇ－2５0（Coomassiｅbrilｌｉanｔbｌｕe G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种.考马斯亮蓝G—2５0 在游离状态下呈红色,最大光吸收在48８nm；当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质－色素结合物在595ｎm 波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定.蛋白质与考马斯亮蓝Ｇ－250 结合在2ｍiｎ左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。
该法是1９76年Bｒaｄｆord 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏,灵敏度比Lｏwry 法还高4 倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~１0０0μｇ／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
...文档交流仅供参考...三实验材料1．实验材料：未知浓度的牛血清样品2。
主要仪器:试管、移液枪、分光光度计等。
3．试剂：蛋白试剂考马斯亮蓝G—2５0 的配制:称取1０0ｍg 考马斯亮蓝G—250，溶于5０mL９0%乙醇中，加入85％(Ｗ/V）的磷酸10０mＬ,最后用蒸馏水定容到１0０0ｍＬ。
此溶液在常温下可放置一个月。
...文档交流仅供参考...四实验步骤标准曲线制作:取6 支10mL 干净的试管，按表1 取样。
摇匀后放置2min ,用1cm 光经的比色杯在595nｍ波长下比色,记录测定的光密度OD５９5nm,并做标准曲线.表１低浓度标准曲线制作...文档交流仅供参考...上图数据标准曲线如下：拟合标准方程：y=7.7３２9x+0。
11４2２．未知蛋白质浓度的测定另取2 支1０mＬ试管，按下表取样。
吸取测定液0．1mL，蒸馏水0.９mL放入试管中，加入5mＬ考马斯亮蓝G－250 蛋白试剂,充分混合，放置2ｍin 后用１cm 光径比色杯在595ｎm 下比色,记录光密度OD595nm,并通过标准曲线查得待测品提取液中蛋白质的含量X（μｇ）。
考马斯亮蓝G250
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量定二、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。
该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
二、材料、主要仪器和试剂1．实验材料香椿种子2．主要仪器（1）（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架（4）研钵（5）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）微量取样器（8）分光光度计3．试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。
（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
（3）乙醇（4）磷酸（85％）四、操作步骤1．标准曲线制作（1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。
盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作（2）0~1 000μg／mL 标准曲线的制作：另取6 支10mL 具塞试管，按表2 取样。
实验8考马斯亮蓝法测蛋白质的含量
对实验条件进行优化，如调整PH值、反应时间、温度等，以提高实验
结果的稳定性。
03
应用拓展
进一步研究考马斯亮蓝法在特殊蛋白质或不同来源蛋白质测定中的应用，
拓展其应用范围。同时，可以探索与其他蛋白质测定方法的比较研究，
为蛋白质定量分析提供更多选择。
THANKS
[ 感谢观看 ]
标准曲线的绘制
加样
将标准蛋白溶液分 别加入相应的试管 中。
测定光密度值
在特定波长下测定 各试管的光密度值， 记录数据。
准备标准蛋白溶液
制备一系列不同浓 度的标准蛋白溶液。
显色反应
向每个试管中加入 适量的考马斯亮蓝 溶液，混合均匀。
绘制标准曲线
根据测得的光密度 值与标准蛋白浓度 绘制标准曲线。
加样
样品稀释
根据实验需求，将蛋白质 样品进行适当稀释，以便 后续测量。
样品标记
对每个样品进行标记，以 便后续结果分析时能够准 确对应。
考马斯亮蓝溶液的配制
准备试剂
储存与使用
按照实验要求准备考马斯亮蓝溶液所 需的试剂。
将配制好的考马斯亮蓝溶液储存于棕 色瓶中，避免光照，使用前摇匀。
配制溶液
将各试剂按比例混合，制备出考马斯 亮蓝溶液。
影响因素
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时，PH值、反应时间、温度等因素 可能影响实验结果。
适用范围
考马斯亮蓝法适用于大多数蛋白质的定量测定，但对于某些特殊蛋 白质或不同来源的蛋白质可能存在一定误差。
对实验的改进建议与展望
01
标准化操作
为提高实验准确性，建议对实验操作进行标准化，减少人为误差。
02
优化条件
考马斯亮蓝与蛋白质结合的机制
实验 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
实验五考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一、实验目的1.掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法2.熟练分光光度计的使用和操作方法。
二、实验原理考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。
离心机的使用说明： 1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。
2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。
3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。
分光光度计的使用说明： 1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。
2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=0.00。
3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。
4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。
5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。
三、试剂与器材：1. 试剂：（1）0.9％NaCl：9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。
（2）标准蛋白质：称取50mg结晶牛血清蛋白定溶于50ml容量瓶里。
（3）染液：考马斯亮蓝G-250 0.5g，溶于250mL95%乙醇，再加入500mL85％(W／V)磷酸，保存于棕色瓶中，称为母液。
取150 mL然后加蒸馏水定容到1000mL，保存于棕色瓶中，备用。
2.器材：试管；吸管10mL、l5mL、lmL、0.1mL；722分光光度计四、操作方法1.标准曲线的制备取6支试管，按下表加入各试剂：以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
仪器和试剂
1．仪器：
722型分光光度计；微量注射器；试管及试管架；刻度吸 管
2．试剂：
（1）标准蛋白质溶液：称取100mg 牛血清白蛋白，溶于蒸 馏水并定容至100ml，制成1mg/ml 的溶液。 （2）考马斯亮蓝G-250染液：称取100mg考马斯亮蓝G-250， 溶于50ml 95%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，最 后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液不宜久存，在常温中可 放置1-2个月。
3．若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈， 以免产生大量气泡而难于消除。
思考题
1． 说出你所知道的几种蛋白质定量测定的 方法，并与考马斯亮蓝染色法相比较各有 何优缺点？
2．根据下列所给的条件和要求，选择一种 或几种常用的方法测定蛋白质的浓度。 （1）样品不易溶解，但要求结果较准确； （2）要求在短时间内测定大量样品。 （3）要求很迅速地测定一系列试管（如30 支）中溶液的蛋白质浓度。
实验二
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
实验目的
掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的 原理和方法
学习分光光度计的原理及使用方法
实验原理
根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。 考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复 合方法。考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状 态下呈棕红色，当与蛋白质结合后呈青蓝色。在 一定范围内，也就是当蛋白质含量在0~1000μg范 围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与 蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。
双蒸水（ml） 考马斯亮蓝染液 蛋白质含量（μg）
0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 0 20 40 60 80 100
考马斯亮蓝G-250
本次蛋白质含量对比评测中，我们运用可溶性蛋白质含量测定的方法：《考马斯亮蓝G -250法(刘延林等，1998)》来进行两种样品的对比标准曲线的制作：以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白质。
称50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL 95%乙醇和50 mL 85%(w/v)的磷酸混合液中，用蒸馏水定容至500mL，快速滤纸过滤后储存于棕色瓶中备用。
称取100mg BSA，溶于蒸馏水中，定容至100mL，则其浓度为1000μg/mL。
按表在6支具塞试管中分别加入BSA溶液和蒸馏水，配制成0～100μg/ml牛血清蛋白溶液各1ml，混匀后加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，盖塞、混匀，室温静置2min，用分光光度计在5 95nm处检测吸光度。
以测得的吸光值为纵坐标，表中各管蛋白浓度为横坐标，做标准曲线。
蛋白质标准曲线溶液配制表吸取待测样品1～5ml，放入具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2分钟后用10mm光径比色杯在595nm下比色，记录其消光值，并通过标准曲线得到每毫升溶液中的蛋白质含量。
样品蛋白质含量(mg/L)=标准曲线上求得的蛋白质含量(μg)/测定取样体积(ml)实验结果：1 ，标准曲线与回归方程2 ，样品测定(稀释250倍)计算后得出灭菌奶的蛋白值含量比值是：伊利金典/蒙牛特仑苏＝1. 2. 1溶液的配制标准蛋白溶液的配制:精确称取牛血清白蛋白100 mg,用蒸馏水定容至100 mL,配成110 mg/mol的标准溶液。
考马斯亮蓝G - 250溶液的配制:精确称取考马斯亮蓝G - 250 100 mg,溶于50 mL 95%的乙醇,再加入120 mL 85%的磷酸,稀释定容至1 000 mL备用。
1. 2. 2乳制品中蛋白质含量的测定分别准确移取一定量的乳与乳制品样品于试管中,加入410 mL 考马斯亮蓝G - 250溶液,用蒸馏水定容至510 mL,摇匀,在室温下反应5 min,以空白(不加乳制品) 溶液作参比溶液, 分光光度计595 nm波长处测定样品组的吸光度。
考马斯亮蓝测蛋白实验报告
实验二：分光光度计的学习之考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）测定蛋白质含量定一实验目的学习分光光度计的基本原理和使用方法，并使用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。
二实验原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。
该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三实验材料1. 实验材料：未知浓度的牛血清样品2. 主要仪器：试管、移液枪、分光光度计等。
3. 试剂：蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
四实验步骤标准曲线制作：取6 支10mL 干净的试管，按表1 取样。
摇匀后放置2min ，用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作管号 0 1 2 3 4 51mg/ml标准蛋白(ml)0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝G-250（ml）555555蛋白浓度（mg /ml）00.02 0.040.060.080.10OD595nm00.3390.4910.6010.7750.799上图数据标准曲线如下：拟合标准方程：y=7.7329x+0.11422．未知蛋白质浓度的测定另取2 支10mL 试管，按下表取样。
实验三-考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
思考题
（1）试比较该法与其他几种常用蛋白质定量测定 方法的有缺点。
水产示范中心
实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
一.目的:掌握考马斯亮蓝G－250染色法测定蛋 理和操作.
二.原理 三.仪器与用具 四.实验试剂 五.实验操作 六 实验报告
白质的原
水产示范中心
二.原理:
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含 量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色， 最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色 素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量 成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
水产示范中心
五.实验操作
1
(蛋白质含量为0～100μg／ mL)的绘制
牛血清蛋白溶液:浓度为100 μ g／ mL,按照表格配制
混合数次，放置5Min后，用1CM光径比色杯在595nM下比色。以蛋
白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
水产示范中心
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定
吸取样品提取液1.0 ml( why?) ，放入 试管中 ，加入
水产示范中心
三.仪器与用具
721分光光度计；10 mL量筒1个；研钵；烧杯；量 瓶；移液管：1 mL 3支，0 1 mL 3支；10 mL具塞 刻度试管14支。
水产示范中心
四.实验试剂
标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质 50溶液：称取100μg考马斯亮蓝G250，溶于50 mL 90％乙醇中，加入85％的磷酸 100 mL ，最后用蒸馏水定容到1000 mL ，贮放在 棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。
考马斯亮蓝G 法测定蛋白质含量
实验七考马斯亮蓝G 法测定的蛋白质含量一、实验目的：1、学习分光光度计的原理及操作；2、学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度。
二、基本原理：1、根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光谱法或分光光度法。
该法所用的仪器称为分光光度计或吸收光谱仪。
该法所使用的光谱范围包括可见光和紫外光，即包括波长在200 - 800 nm之间的光。
2、分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。
3、紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。
由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即200nm-400nm。
可见光区为400nm -800nm。
Beer-Lambert 定律（朗伯-比尔光吸收定律）：A＝－lgT＝ε b cA：吸光度，又称光密度“O.D”。
T：透光度，T＝I / I。
（I。
为照射到吸收池上的光强，I为透过吸收池的光强）ε：摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L·mol－1·cm－1）。
b：样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。
c：样品浓度（mol/L）。
由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。
摩尔吸光系数：物质对某波长的光的吸收能力的量度。
ε越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。
ε值越大，说明电子跃迁的几率大，通常ε＝10-105：一般认为ε＞104为强吸收；ε＝103-104 为较强吸收；ε＜102 为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。
因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A＝0.001, 所以，当b＝1cm, ε＝105时，可检测的溶液最小浓度是C＝10-8 mol/L。
考马斯亮蓝G250法：原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后，其最大吸收波长从465nm改变为595nm,该蛋白－染料复合物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定1μg /mL的蛋白质，染料和蛋白结合只需要2分钟，颜色在1小时内稳定。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
（一）标准曲线的制作
1、配置试剂：
①考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶解于50ml95%乙醇中，加入100ml85%（w/v）的磷酸，用水定容至1000ml，过滤（大约4小时，用一层滤纸，中间换一次）。
此试剂常温下可保存30d。
②标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清白蛋白10mg，加水溶解定容至100ml,即为100ug/ml的标准蛋白质溶液。
2、制作曲线：
在6支5ml离心管中分别按照上表中加入配好的牛血清白蛋白溶液，再加入2.5ml 考马斯亮蓝，盖上盖子，摇匀。
放置5min后再595nm波长下比色测定，1h完成比色。
以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
饮料工业 B everage Industry
2005 1
45
考马斯亮兰 G-250法测定苹果 浓缩汁生产中的蛋白含量
许淑芳 , 朱
* ** 1
江 , 刘邻渭
1 ,2
1
, 李元瑞 , 刘永建
1
2
( 1 西北农林科技大学食品科学与工程学院, 陕西杨凌 712100 ; 2 海升果业发展股份有限公司 , 陕西乾县 713300)
[ 1] 张
3 结论 总结以上实验结果 , 认为果汁中的糖和酸均不 会影响其对蛋白的测定, 用考马斯亮兰 G-250 法测 定果汁中的蛋白是合适的。 参考文献
峰 , 仇农学 . 苹果浓缩汁后混浊的形成机 理及控制 [ J] . 1~ 4
表 6 回收率测定结果
牛血清白蛋白 加入量 ( 0 10 20 50 l) 测得量 ( 回收率 ( % ) g / m l)
[ 3] o
做标准曲线, 分别为 y= 0 0067x+ 0 0131 ( r = 0 9989), y= 0 0065x + 0 0306 ( r= 0 9973) , y = 0 0065x + 0 0327 ( r= 0 9969) 。 结果表明 , 以不同糖液做测蛋白的空白 , 其吸 光度相对于去离子水没有明显变化 , 而且所做曲线 的线性较好。 同时对不同糖液配制的 104 8 g /m l的牛血清 白蛋白溶液做最大吸收曲线 ( 图 1)。
30 088 83 331 80 768 77 441
D eterm ination of protein in app le ju ice con cen trate production by Coo m assie Br illian t B lue G-250 M ethod
测定 , 结果见表 4 。 表 4 果汁生产线中不同工序的蛋白测定结果
样品 前巴浊汁 澄清罐浊汁 超滤出口清汁 树脂吸附出口清汁 成品 ( 11 5 Bx) 取样量 ( m l) 1 1 1 1 1 A 595 0 215 0 178 0 160 0 038 0 031 蛋白含量 ( 30 088 25 647 22 000 4 059 3 029 g/ m l)
), 女 , 山东夏津人 , 硕士研究生 , 研究方向 : 食品化学。
46
饮料工业 Beverage Industry
2005 1
第 8卷第 1期 V ol 8 N o 1
贮存于棕色瓶中。 1 2 2 样品测定 生产线前巴浊汁、澄清罐浊汁、超滤出口、树 脂吸附出口样品经滤纸过滤后 , 用考马斯亮兰 G250法比 色测 定; 成品 果汁 调至 11 5 Bx 后, 过 滤 , 测定。 2 结果与讨论 2 1 标准曲线的制作
[ 4] m ax [ 1, 2 ] [ 1]
723型分光光度计 ( 上海分析仪器总厂 )、分析 天平 (METTLER AE100)、天平 ( Sartoriu s BL310) 、 SK-1型快速混匀器 (金坛市华峰仪器有限公司 )、微 量移液器 (上海求精生化试剂仪器有限公司 )、试管 等。 1 1 2 试剂 牛血清清蛋白 ( Bov in e Serum A lbum in, BSA )、 考马斯亮兰 G-250 、无水乙醇、磷酸、葡萄糖、果 糖、蔗糖、苹果酸 , 均为分析纯。 1 1 3 材料 浓缩苹果汁取自陕西海升果业发展股份有限公 司。 1 2 实验方法 1 2 1 标准溶液的配制 ( 1) 标准蛋白质溶液 : 称取 10m g 牛血清清 蛋白 ( BSA) , 溶于去离 子水并定 容至 100m , l 配 制成 0 1mg /m l的标准蛋白质溶液。 ( 2) 考马斯亮兰 G-250 染料试剂: 称 100m g 考马斯亮兰 G-250 , 溶于 50m l 95% 的乙醇后 , 再 加入 120m l 85 % 的磷酸 , 用水稀释至 1L, 过滤后
取 7 支试管 , 编号后 , 按表 1 加入试 剂, 混 匀 , 放置 2m in 后在 595nm 波长下比色测定 ( 比色 应在 1h 内完成 ) 。以牛血清白蛋白含量 ( 0 0068x + 0 0104 , r= 0 9993 , mol
-1 -1
g) 为 10 L
2 5
横坐 标, 以吸 光 度 为 纵 坐l灵敏度 S= 0 146g 表 1
0 引言 目前世界果汁加工过程中不同程度地存在着 4 大技术难题 : 后混浊、果汁褐变、营养素损耗和芳 香物质逸 散, 其 中尤 以果 汁后 混浊难 以解 决 果汁中蛋白是影响果汁后混浊的因素之一 很有必要。 由于苹果汁中的蛋白含量较少, 必须选用适合 于测定微量 蛋白的方法。 1976 年由 Bradford 建立 的考马斯亮兰 G-250 法 ( B radford 法 ) , 是根据蛋 白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮兰 G250染料, 在酸性溶液中与蛋白质结合, 使染料的 最大吸收峰的位置 ( 进行比 色测 定 的应用。 1 实验部分 1 1 仪器、试剂和材料 1 1 1 仪器
由表 5 中数据可知, 考马斯亮兰法对果汁生产线物料中的蛋白含量的测定结果精密度较好。 2 5 加标回收率 取前巴浊汁 , 过滤 , 移取 1m l测定蛋白含量 ; 另取试管, 加入不同量的 1 048mg /m l牛血清白蛋 白和 1m l前巴浊汁, 按实验方法测定 , 测得结果见 表 6 。由表可知 , 回收率在 97 76 % ~ 103 20 %之 间。
介质 0 6 5 % 果糖 蛋白质浓度 ( g/ m l) 104 8 0 705 0 689 0 699
10 48 20 96 41 92 62 88 83 84
0 000 0 074 0 174 0 298 0 457 0 575
结果表明 , 苹果酸不影响果汁中蛋白的测定。 同时对其配制的 104 8 g /m l的牛血清白蛋白溶液 做最大吸收曲线 ( 图 2) 。
10 48 20 96 41 92 62 88 83 84
0 002 0 078 0 159 0 308 0 451 0 568
2 6 % 葡萄糖 0 001 0 108 0 177 0 309 0 459 0 572 1 5 % 蔗糖 0 002 0 099 0 191 0 327 0 454 0 572
图 2 最大吸收曲线
第 8卷第 1 期 V ol 8 N o 1
许淑芳 , 朱
江 , 刘邻渭 , 等 : 考马斯亮兰 G-250法测定苹果浓缩汁生产中的蛋白含量
47
由图 2 可知 , 在苹果酸存在的情况下 , 牛血清 白蛋白溶液的最大吸收波长与报道的也一致。因此 认为其不干扰果汁中蛋白的测定。 2 2 3 果汁颜色对标准曲线的干扰 以去离子水为参比, 测定 595 下生产线果汁得 吸光度为 0 005 左右, 影响很小 , 可以忽略 , 或从 吸光度中扣除。 总结以上实验结果, 认为果汁中的糖和酸均不 会影响考马斯亮兰 G-250法对蛋白的测定 , 直接用 去离子水配制标准蛋白溶液, 做标准曲线 , 测定果 汁中的蛋白是合适的。 2 3 果汁生产中不同工序物料中蛋白含量的测定 对果汁生产中不同工序物料中的蛋白含量进行
介质 0 2 2mg /m l 苹果酸 蛋白质浓度 ( g / m l) 104 8 0 701
2 2 干扰实验 2 2 1 果糖、葡萄糖和蔗糖对标准曲线的干扰 苹果浓缩汁的主要成分为糖, 其中果糖约占清 汁的 6 5 % , 葡萄糖约占 2 6 % , 蔗糖约占 1 5 %。 配制相当于果汁中浓度的果糖、葡萄糖和蔗糖 , 再 用其分别配制牛血清白 蛋白系列溶液 , 做标准曲 线 , 看其是否有干扰。同时以去离子水为空白 , 测 定不同的糖液空白配制的牛血清白蛋白系列容液。 如表 2 : 表 2 果糖 、葡萄糖和蔗糖对蛋白测定的干扰
饮料工业 , 2004 , 7 ( 2) : [ 2] 王 处理 [ J]
志 , 黄惠华 , 等 饮料 中的多酚 -蛋白质 反应及其 稳定化 食品工业科技 , 2002, 23 ( 12) : 81 ~ 84
[ 3] 陈毓荃 . 生物化学实验方法和技术 [ M ] . 西安 : 世界 图书出 版公司 , 1999 46 ~ 48 103 20 99 80 97 76 [ 4] BRAD FORD, A R ap id and Sen sitiveM ethod for the Q uan titation of M icrogram Q u ant ities of P rotein U tilizing th e Princip le of Protein -D ye B ind ing [ J] A nal B iochem, 1976 ( 72) : 248~ 254
。
, 选
择建立适合于果汁生产过程的快速检测蛋白的方法
) 由 465n m 变 为 595nm,
溶液的颜色也由棕黑色变为兰色, 可在 595nm 处 。 其突 出的 优 点为 : 灵 敏度 高 , 测定快速、简便 , 干扰物质少。因而正在得到广泛
* **
收稿日期 : 2004- 11- 22 作者简介 : 许淑芳 ( 1978
管号 蛋白质标准液 ( m l) 去离子水 ( m l) 考马斯亮兰 G-250试剂 ( m l) 蛋白质浓度 ( g / m l) 0 10 20 40 60 80 100 5 5 5 5 5 5 5 0 1 0 0 1 0 9 0 2 0 8 0 4 0 6 0 6 0 4 0 8 0 2 1 0 0 1
c m。 图 1 最大吸收曲线 由图 1 可知, 在果糖、葡萄糖和蔗糖存在的情
5 6 7
试剂加量表
2 3 4
况下 , 牛血清白蛋白溶液的最大吸收波长与报道的 一致。因此认为其不干扰果汁中蛋白的测定。 2 2 2 苹果酸对标准曲线的干扰 苹果酸是果汁中主要的酸 , 浓汁中的含量约为 1 5 % , 相当于清 汁中含有 2 2m g /m l苹 果酸 , 以 此浓度的苹果酸作为介质配制牛血清白蛋白系列溶 液, 测定 595nm 下的吸光度 ( 表 3) , 同 3 2 做标 准曲线为 y= 0 0067x+ 0 0149 ( r= 0 9983)。 表 3 苹果酸对蛋白测定的干扰