考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白

考马斯亮蓝法测定实验报告

考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量吴凡郭梦雨摘要:本实验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH值、外源添加物对果肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法，以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。

结果说明：外源添加PVP和EDTA以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。

实验最终确定的提取条件为0.1mol/L pH9.0 Tris-HCl提取缓冲液(含1mmol/L EDTA和1% PVP),此条件下苹果果实可溶性蛋白的有效测定含量为34.93%。

关键词：苹果、考马斯亮蓝法、Tris-HCl缓冲液、外援添加物1 实验局部1.1 实验原理果蔬可溶性蛋白质含量(soluble protein content)是一个重要的生理生化指标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。

许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成局部，参与果蔬多种生理生化代过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。

考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。

在一定的蛋白质浓度围，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间到达平衡，完成反响十分迅速；其结合物在室温下1h保持稳定。

该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反响非常灵敏，灵敏度高，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

但该方法线性围窄，需要选择适宜的提取缓冲液及缓冲液浓度、pH值和外源添加物等，以使测定方法有较高的灵敏度，测定值与真值相近。

实验28 植物体内可溶性蛋白质含量的测定

实验28 植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。

在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。

因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。

常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。

本实验将分别介绍这两种方法。

一、考马斯亮蓝法【原理】考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。

在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。

故可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

【仪器与用具】分光光度计，10ml量筒1支；研体；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度试管14支。

【试剂】（1）牛血清白蛋白配成1000μg/ml和100μg/ml；（2）考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。

此溶液在常温下可放置一个月；（3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。

【方法】1.标准曲线的绘制（1）0～100μg/ml标准曲线的制作取6支试管，按表28-1数据配制0～100μg/ml 血清白蛋白液各1ml。

准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml 考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。

表28-1 配制0～100μg/ml血清白蛋白液管号 1 2 3 4 5 6100μg/ml牛血清蛋白量(ml)蒸馏水量(ml)蛋白质含量(mg)1.00.20.80.020.40.60.040.60.40.060.80.20.081.00.10（2）0～1000μg/ml标准曲线的制作另取6支试管，按表28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。

考马斯亮蓝法测定(实验报告)

考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量吴凡郭梦雨摘要:本实验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH值、外源添加物对果肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法，以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。

结果表明：外源添加PVP和EDTA以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。

实验最终确定的提取条件为0.1mol/L pH9.0 Tris-HCl提取缓冲液(内含1mmol/L EDTA和1% PVP),此条件下苹果果实可溶性蛋白的有效测定含量为34.93%。

关键词：苹果、考马斯亮蓝法、Tris-HCl缓冲液、外援添加物1 实验部分1.1 实验原理果蔬可溶性蛋白质含量(soluble protein content)是一个重要的生理生化指标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。

许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。

考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。

在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。

该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度高，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

但该方法线性范围窄，需要选择适宜的提取缓冲液及缓冲液浓度、pH值和外源添加物等，以使测定方法有较高的灵敏度，测定值与真值相近。

(完整word版)可溶性蛋白质含量的测定

植物体内可溶性蛋白质含量的测定方法:考马斯亮蓝G－250染色法1.原理：考马斯亮蓝G－250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G－250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm,后者在595nm。

在一定蛋白质浓度范围内（1～100μg)，蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定.蛋白质与考马斯亮蓝G－250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

该反应快速灵敏、易于操作、干扰物质少（考马斯亮蓝G－250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小,除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大)，可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。

但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。

2.仪器：721分光光度计;10ml量筒1个；研钵；烧杯；量瓶;移液管；1ml3支;5ml3支；10ml 具塞刻度试管14支。

3.试剂:90乙醇％(无水乙醇20瓶以下8元1瓶,每瓶500ml)；85%磷酸（500ml磷酸标准溶液0。

1mol/ml，16元钱1瓶)；考马斯亮蓝G－250（80元钱1瓶，1瓶10g）；牛血清白蛋白。

考马斯亮蓝G－250溶液：称取100μg考马斯亮蓝G－250,溶50ml90％乙醇，85%的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。

4。

标准曲线的绘制4.1、0～100μg/ml标准曲线的制作:取6支试管，按表1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml.准确吸取所配各管溶液0。

1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G—250试剂，盖塞,反转混合数次，放置2min后,在595nm下比色，绘制标准曲线。

考马斯亮蓝法测定(实验报告)

考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量吴凡郭梦雨摘要:本实验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH值、外源添加物对果肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法，以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。

结果表明：外源添加PVP和EDTA以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。

实验最终确定的提取条件为0.1mol/L pH9.0 Tris-HCl提取缓冲液(内含1mmol/L EDTA和1% PVP),此条件下苹果果实可溶性蛋白的有效测定含量为34.93%。

关键词：苹果、考马斯亮蓝法、Tris-HCl缓冲液、外援添加物1 实验部分1.1 实验原理果蔬可溶性蛋白质含量(soluble protein content)是一个重要的生理生化指标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。

许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。

考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。

在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。

该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度高，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

但该方法线性范围窄，需要选择适宜的提取缓冲液及缓冲液浓度、pH值和外源添加物等，以使测定方法有较高的灵敏度，测定值与真值相近。

可溶性蛋白

可溶性蛋白含量的测定一：原理考马斯亮蓝G－250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G－250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G－250 在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nM，后者在595nM。

在一定蛋白质浓度范围内(1～100?g)，蛋白质与色素结合物在595nM 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G－250 结合在2Min 左右的时间内达到平衡，速完成反应十分迅，其结合物在室温下1H 内保持稳定。

该反应快速灵敏(灵敏度比ＦolIn－酚法还高4 倍)、易于操作、干扰物质少(考马斯亮蓝G－250 和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大)，可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。

但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。

二：试剂1：标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质100?g／Ml 的标准蛋白溶液;（可不要）2：90％乙醇；:85％磷酸(W／V)；3：考马斯亮蓝G－250 溶液：称取100?g 考马斯亮蓝G－250，溶于50Ml 90 ％乙醇中，加入85％的磷酸100Ml，最后用蒸馏水定容到1000Ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1 个月。

三：方法1:称取鲜样0.5g，用5ml 蒸馏水或缓冲液研磨提取，再用5ml 蒸馏水洗涤，转入到10ml 的试管中。

4000rpm 离心20m. 2:吸取样品提取液 1.0ml，放入具塞试管中(每个样品设置两个重复)，加入5ml 考马斯亮蓝G－250 溶液，充分混合，放置2Min 后在595nM 下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量(只需知道相对含量即可)。

**标准曲线：四：结果用光吸收值来表示相对含量。

考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白

考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量原理：考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（1-1000µg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

考马斯亮蓝G-250于蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。

其结合物在室温下1h内保持稳定。

此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。

其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

材料、仪器设备及试剂1、材料小麦叶片、马铃薯块茎、或其他植物材料2、仪器设备分光光度计、研钵、烧杯、移液管3、试剂（1）标准蛋白质溶液：100µg·Ml-1牛血清白蛋白：称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。

（2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。

方法：1、标准曲线的绘制取6支具塞试管，按表加入试剂。

混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，在595nm下比色测定吸光度。

以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水量（ml）1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量（µg） 0 20 40 60 80 1002、样品测定（1）样品提取：取鲜样0.5g，加入2ml蒸馏水研磨，磨成匀浆后用6ml蒸馏水冲洗研钵，洗涤液收集在同一离心管中，在4000r/min下离心10min，弃去沉淀，上清液转入容量瓶，以蒸馏水定容至10ml，摇匀后待测。

可溶性蛋白含量测定法

可溶性蛋白含量测定（考马斯亮蓝染色法）1. 试剂配制（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）磷酸，再用蒸馏水定容到1L。

在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。

90% 乙醇配制：95%乙醇和75%乙醇按3:1体积比混合配制，即95%乙醇，75%乙醇或取45ml 无水乙醇直接定容至50ml。

（2） 100 g/ml 牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取10mg BSA定容至100 ml即为100 g/ml。

或称取25 mg BSA加蒸馏水水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40 ml蒸馏水定容至100ml。

（3） mol/L，磷酸配制：A母液， mol/L磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO412H2O (分子量 g，用蒸馏水定容至500 ml。

B母液， mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O (分子量 g，用蒸馏水定容到50 ml。

磷酸：分别取A母液，B母液，用蒸馏水定容至1000ml。

2. 标准曲线绘制取6支具塞试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，5min 左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

试剂0号1号2号3号4号5号标准蛋白体积/ml蒸馏水体积/ml蛋白质含量/g020*********3. 样品测定（1）样品提取：取鲜样—，用蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min—4000r/min离心10min，上清液备用。

（2）吸取样品提取液（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复两次），加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min带反应完成，在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查蛋白质含量。

4. 蛋白质含量计算可溶性蛋白含量（mg/g）=(C VT)/1000VS（mg/g）C—查标准曲线值，g；VT—提取液总体积，ml；WF—样品鲜重，g；VS—测定时加样量，ml。