考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量.doc..
实验二 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
实验二考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量一、目的与要求1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法。
二、实验原理考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。
附：（一）、分光光度法原理：光的吸收定律（朗伯-比尔定律）：一束单色光(强度为I0)通过某吸光物质的溶液时,其光能量的被吸收与该物质浓度的关系符合朗伯—比尔定律即当入射光波长、温度和溶液的厚度一定时，吸光度与溶液的浓度成正比。
用公式表示为：T = I／I0则A = lg（1／T）=Kbc式中T —透光率I —透过光强度I0—入射光强度 A —吸光度K —比例常数 b —溶液的厚度 c —溶液的浓度（二）、离心机的使用说明：1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。
2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。
3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。
（三）、分光光度计的使用说明：1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。
2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=0.00。
3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。
4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。
5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
蛋白质的含量测定
目前常用的5种经典方法： 凯式定氮法（Kjedahl法） 紫外吸收法 双缩脲法（Biuret法） Folin-酚试剂法（Lorry法） 考马斯亮蓝法（Bradford法）
（一）凯式定氮法
原理： 蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催 化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与 硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离， 用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根 据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。
Bradford 法的优点
(1)灵敏度高 其最低检测蛋白质含量可达1ug/ml,
这是因为蛋白质与染料相结合后产生 的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有 更高的吸光系数 ,因而光吸收要比Folin –酚试剂法大得多。
(2)测定快速,简洁
只需要加一种试剂，完成一个样品 的测定，只要5分钟左右。由于染料与 蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即 可完成，其颜色可以在1小时内保持稳 定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的 稳定性最好。
(3)干扰物质少 一些阳离子如K+、Mg+、Na+和硫酸铵 等不干扰测定。
干扰物质：去污剂、 SDS、TritonX-100 、0.1 MNaOH
Bradford 法的缺点
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含
量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较
大的偏差，最好选用与待测样品氨基酸成份相同 的标准蛋白。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质 有去污剂等。 (3)标准曲线也有轻微的非线形，因而不能用比尔定 律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。
缺点： 操作比较复杂、费时（8-10小时） 灵敏度低，适用于0.2-1.0mg氮测定。
考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量：分光光度的使用
2．校正 （1）打开吸收池暗室盖，调节[0% T]旋钮， 使数字显示为“00.0”，将参比溶液置于光路， 盖上吸收池盖，调节透光率[100% T] 旋钮， 数字显示为“100.0”。 （2）如果显示不到“100”，则可适当增加电 流放大器灵敏度档数，当改变灵敏度 后必须重 新校正“0”和“100”。 （3）按（1）连续几次调整“00.0”和 “100.0”后，将选择开关置于“A”，调节吸光 度调零旋钮，使数字显示为“.000”，即可进行 吸光度A的测量.
考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋 白质含量：分光光度的使用
【实验目的】
1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测
定蛋白质的原理与方法。 2. 熟练分光光度计的使用和操作
方法。
【实验原理】 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量 属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸 收峰在465nm；当它与蛋白质通过范 德华键结合成复合物时变为蓝色，其 最大吸收峰移至595nm，而且消光系 数更大。
灵敏度
0
100
暗盒盖
调波长旋钮
比色皿拉杆
1．调整
（1） 接通电源。 （2） 调波长调节器至所需波长。 （3） 开启电源开关，指示灯亮，选择开关置
于“T”，将灵敏度旋钮调至”1”档位，调节透 光率[100%T]。预热20min . 预热仪器应在不测定时，将比色皿暗箱盖打开， 使光路切断。
液。残渣用2.0ml蒸馏水悬浮，
4000rpm离心10min，合并上清液并含量测定:
取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，
加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡
混合,放置5min后，测 A595值。
3. 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋 白含量。
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重) =）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μSDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
图1 考马斯亮蓝标准法根据线性拟合公式y=a x+b计算所测溶液的蛋白质的含量。
（二）SDS干扰数据和图表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格根据表2，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。
实验九考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含( Bradford 法)
1
0 1.0
2
0.1 0.4
3
0.2 0.3
4
0.3 0.2
5
0.4 0.1
6
0.5 0
考马斯亮蓝
蛋白质浓度 (μg/ml) O.D595
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
混匀，室温静臵３min，以第１管为空
பைடு நூலகம்
白，于波长595nm处比色，读取吸光度，
以吸光度为纵坐标，各标准液浓度为
横坐标作标准曲线．
２、样液的测定
另取2支干净的试管，加入样品液0.5
ml及考马斯亮蓝染液3.0 ml，混匀，
室温静臵3 min, 于波长595nm处比色，
读取吸光度，由样品的吸光度查标准
曲线求样品含量。
思考题
在考马斯亮蓝法测定蛋白质含量中 需要注意那些事项？
量的去污剂如Triton X-100，SDS，玻璃去污剂有少
量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
考马斯亮蓝染色法的缺点：
1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的
含量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较
大的偏差。因为研究发现，染料主要是与蛋白质中的
碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相
结合。 2.显色剂的稳定性较差。 3.溶液中有大量去污剂的存在是对颜色影响太大,不 宜使用此法测定蛋白质含量。
三、试剂和器材
1、试剂 （1） 考马斯亮蓝试剂 考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100 ml 85%磷酸，用蒸馏 水稀释至1000 ml。 （2） 标准蛋白质溶液 牛血清蛋白或卵其清白蛋白等，预先测 定其蛋白纯度，再根据纯度用蒸馏水或0.9 ％NaCl 准确配制。
蛋白质含量测定法
实验一 蛋白质含量测定法[实验目的]1． 掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法 2． 掌握紫外吸收法测定蛋白质含量的方法一．考马斯亮蓝法（Bradford 法）[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+-[器材与试剂]（一） 器材1． 722型和753型可见光分光光度计 2． 漩涡混合器 3． 试管16支 （二） 试剂1． 标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.03mg/ml 和0.103mg/ml 。
2． 考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]1． 标准方法 （1） 取10支试管，分别编号后按 表1-1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
（2） 加完染料20min 后，使用722分光光度计（灵敏度4），塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A 595。
（3） 用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，查表即可求得未知样品的蛋白质含量。
2． 微量法取10支试管，分别编号后按 表1-3 剂量依次加入稀释的标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
其他步骤同上，不过使用753分光光度计（狭缝4）。
3． SDS 干扰实验 （1） 取5支试管，分别编号后按表1-5剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
（2） 加完染料20min 后，使用753分光光度计（狭缝4），塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一） 标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 （1.03mg/ml ） 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 未知蛋白质 （约0.5mg/ml ）0.04 0.08 0.10 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.06 0.02 0 考马斯亮蓝 G-250试剂 3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0对应的吸光度A 5950.200 0.311 0.362 0.483 0.624 0.752 0.845 0.387 0.501 0.572根据表1，以A 595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg ）为横坐标，作图1。
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250m ax λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重)=）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μ以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
计算出回归方程。
如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度 SDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
(完整word版)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
如核糖核酸酶或溶菌酶。
去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。
如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。
染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。
注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
适用范围考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。
当考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm 变为595nm。
在考马斯亮蓝G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250 从吸收峰为465nm 的形式转变成吸收峰为595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。
一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。
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分光光度计的分类
红外分光光度计: 测定波长范围为 大于760 nm的 红外光区
可见光分光光度计:
测定波长范围为 400~ 760 nm的 可见光区
测定波长范围为 200～400 nm的 紫外光区
紫外分光光度计:
可见光谱
可见光范围内波长和颜色的关系
分光光度计的基本结构
无论哪一类分光光度计都包括：光源、单 色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光 度计各部件的次序如图所示:
A=lg(1/T)=Kbc
A为吸光度; T为透光度,是透射光强度比上入射光强度（I/I0); c为吸光物质的浓度; b为吸收层厚度(光程）.
物理意义 当一束平行单色光垂直通过某一吸光物质时,其吸 光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比.
思考题
1.蛋白质的测定方法有几种？比较各种方法
考马斯亮蓝法（Bradford法） 测定蛋白质含量
【实验目的】 1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量
测定蛋白质的原理与方法。
2. 熟练分光光度计的使用和
操作方法。
【实验原理】
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于 染料结合法的一种。 考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕 红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白 质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色， 其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数 更大。
【器材与试剂】
（一）器材 1. 可见光分光光度计 2. 刻度移液管 3. 移液枪 （二）试剂 1. NaCl （0.15mol/L） 2. 考马斯亮蓝试剂 3. 蛋白质标准液 （1mg /mL） 4. 待测蛋白质溶液
试管编 号 标准蛋 白溶液 （mL） 0.15mol/ L NaCl （mL） 考马斯 亮蓝试 剂（mL）
的优缺点。 2.在考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度时，当蛋 白质浓度偏高时，为什么曲线会适当下斜?
0
1
2
3
4
5
6待测
0
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.10
0.10
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0
5
5
5
5
5
5
5
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
A595nm 0 ？ ？ ？ ？ ？ ？
1.如黑板上表格操作 2.绘制标准曲线：以A595nm为纵坐
标，标准蛋白含量为横坐标，在坐 标纸上绘制标准曲线。
入射光 强度 Io 单色器 样品池 透射光 强度 I
光源
检测器 及仪表
光照射到物质上，物质的分子结构决定 哪些特定波长的光被吸收。这一现象符 合符合朗伯－比耳定律。
入射光强度 Io 透射光强度 I
样品浓度c
光程 b
当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部 分被吸收，一部分透过溶液(I)
朗伯—比尔定律:
3.算出待测蛋白质浓度？
【分光光度法的基本原理和分光光度计的 使用方法】
定义: 分光光度法是利用物质所特有的吸 收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。 特点: 灵敏、精确、快速和简便，在复杂组 分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的 极少量物质。 应用: 生物化学研究中广泛使用的方法之 一，广泛用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定 量检测。
质反应虽然比较缓慢， 但是可以被洗脱下去， 所以可以用来对电泳条 带染色。
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）, 蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
由于蛋白质－染料复合物具有很 高的消光系数，因此大大提高了蛋白 质测定的灵敏度（最低检出量为 1µg）。
Hale Waihona Puke 考马斯亮蓝G-250在游离状态
下呈红色，最大光吸收在 465nm；当它与蛋白质结合 后变为青色，蛋白质-色素结 合物在595nm波长下有最大 光吸收。其光吸收值与蛋白质 含量成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G250的
结合十分迅速，约2min即可 反应完全，其复合物在1h内 保持稳定。
考马斯亮蓝R250与蛋白