考马斯亮蓝法测蛋白质含量(1)
蛋白质含量测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和操作步骤。
2. 学习使用分光光度计进行比色分析。
3. 通过实验，掌握蛋白质含量测定的实际操作，提高实验技能。
二、实验原理考马斯亮蓝法是一种快速、简便的蛋白质定量方法。
该法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料的结合，蛋白质含量与染料结合程度呈线性关系。
通过测定溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出蛋白质的含量。
实验原理：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与考马斯亮蓝G-250染料发生结合，形成有色的复合物。
该复合物在特定波长下有特征性吸收峰，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系。
三、实验材料1. 蛋白质标准品（如牛血清白蛋白）。
2. 考马斯亮蓝G-250染料。
3. 6.0mol/L NaOH溶液。
4. 双蒸水。
5. 分光光度计。
6. 试管、移液器、吸管等实验器材。
四、实验步骤1. 标准曲线制作：将不同浓度的蛋白质标准品配制成溶液，分别加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，得出线性方程。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品中的蛋白质含量为XX g/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免污染和误差。
2. 在制作标准曲线时，应选择合适的浓度范围，保证线性关系良好。
3. 待测样品的稀释倍数应根据实际浓度选择，以保证在检测范围内。
4. 在测定吸光度时，应注意仪器校准和操作，避免误差。
七、实验总结本次实验通过考马斯亮蓝法测定了待测样品中的蛋白质含量，实验结果准确可靠。
实验考马斯亮蓝测蛋白质含量
实验考马斯亮蓝测蛋白质含量本实验旨在研究一种蛋白质染色测定的方法，即考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。
该方法基于蛋白质对酸碱滴定指示剂颜色变化的影响，使用考马斯亮蓝G-250作为染料，通过疏水作用与蛋白质相结合形成蛋白质染料复合物，再通过比色测定吸光值来测定蛋白质含量。
标准曲线的制作包括取7支试管，加入不同浓度的标准蛋白溶液和考马斯亮蓝试剂，摇匀后放置20分钟，再用分光光度计比色测定吸光值A595nm，以A595nm为纵坐标，标准蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
样品的测定包括取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液、蒸馏水和考马斯亮蓝试剂，摇匀后放置20分钟，再比色测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。
需要注意的是，该方法适用范围为0.01-1.0mg蛋白质/ml，不同蛋白质之间差异大，标准曲线线性差，且高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。
1、染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，因此与蛋白质结合的染料增加会导致试剂背景值不断降低。
当蛋白质浓度较大时，标准曲线会稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不会影响测定结果。
2、测定工作应在蛋白质染料混合后2分钟开始，力争1小时内完成。
否则，蛋白质一染料复合物可能会发生凝集沉淀，影响测定结果。
实验报告应绘制标准曲线，并将实验结果与其他蛋白质测定方法进行比较分析。
思考题：1、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理是通过蛋白质与染料结合后产生的颜色变化来测定蛋白质含量。
2、Bradford法的优点是灵敏度高，测定快速、简便，只需要加一种试剂。
干扰物质相对于其他方法较少。
缺点是不同蛋白质测定时有较大的偏差，仍有些物质干扰此法测定，标准曲线也有轻微的非线性。
在操作时，不可使用石英比色皿，应使用塑料或玻璃比色皿，并立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。
实验1考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
蛋白质含量的测定
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法（Lowry法） 双缩脲法（Biuret法） 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford法）
▪ 实验类型——基础验证型
实验目的
掌握和学习考马斯亮蓝G-250染色法 测定蛋白质含量的基本方法。
五 思考题
测定蛋白质含量还有哪些方法， 测定原理有哪些不同？
移液枪的使用方法
量程的调节 枪头（吸液嘴）的装配 移液的方法 移液器的正确放置 维护保养时的注意事项
吊钩 手柄
移液控制及调节旋纽 吸/枪头推出器
数字显示器
枪杆
移液枪的结构
1.量程的调节 ！！看清量程再调节
千万不要将按钮旋出量程， 否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出 残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的 吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中， 以免污染吸量管及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应 及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上 冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。
/mL
0
10
蛋白质浓度
(μg/mL)
A595
3
4
5
6
7
0.2
0.4
0.6
0.8 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
4.0
4.0
4.0
4.0 4.0
20
40
60
蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
实验名称：蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-燃料结合的原理。
考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。
当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，且其光吸收值与蛋白质含量（10~100μg/ml蛋白质浓度）成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
【实验准备】一、材料（1）血清二、试剂（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。
(2)标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根基其纯度用0.15mol/L NaCl配置成1.0mg/ml蛋白溶液。
（3）0.9% NaCl溶液。
三、器材（1）试管和试管架（2）722型分光光度计（3）吸量管（4）移液枪【实验步骤】一、制作标准曲线取6支干燥洁净的试管，编号按下表加入试剂光度值（A595值）。
以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。
二、血清蛋白质浓度测定测定方法同上。
1mL稀释血清加2.5mL考马斯亮蓝试剂，血清用0.9%NaCl稀释200倍，使其测定值在标准曲线的直线范围内。
用上述0号管调零，测出血清的A595值。
【实验结果】以吸光度A595（2）根据所测血清的值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，乘以稀释倍数，从而计算出血清的蛋白质浓度（mg/ml）0.26 mg/ml【实验讨论】①必须在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
②测定中蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将比色杯洗干净。
③不要将标准蛋白质和待测蛋白质搞混，以免造成实验结果的改变。
④考马斯亮蓝（ＣＢＢ）显色法测定蛋白质含量的主要缺点之一是线性关系差．通过研究显色液组分对线性关系的影响，发现显色液Ｈ＋浓度是影响线性关系的主要因素【1】。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量(1)
三、实验器材与试剂
⒈器材。 可见分光光度计、试管、试管架、研钵、离心机、离心管、 10ml容量瓶、刻度移液管、移液枪、小麦叶片或绿豆下胚 轴。 ⒉试剂。 ⑴0.9％生理盐水 ⑵考马斯亮蓝试剂 称取考马斯亮蓝G250 100㎎，加95％乙醇100ml，溶解后 加85％H３ＰＯ４， 100 ml，加水稀释至 1000ml，存于棕色瓶。 ⑶蛋白质标准溶液 准确称取经微量凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配置 1000µg/ml标准溶液。
★实验优点 （1）灵敏度高。据估计比Lowry法约高四倍，蛋白质－染料复 合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定， 只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟 至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法 那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。 ★实验缺点 （1）Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面 的偏差。 （2）标准曲线也有轻微的非线性。因而不能用Beer定律进行计 算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
考马斯亮蓝法测定 ——蛋白质含量
一、实验目的。
⒈掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原 理与方法。 ⒉熟练分光光度计的使用和操作方法。
考马斯亮蓝法出现背景
• 双缩脲法和Folin—酚试剂法的 明显缺点和许多限制，促使科学家们去 寻找更好的 蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法 （Bradford法），是根据蛋白质与染料 相结合的原理设计的。这种蛋白质测定 法具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。这一方法是 目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质得含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质得含量。
因此,制作标准曲线就是生物检测分析得一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作(一)、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0、01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4、7%(W/V)乙醇,8、5%(W/V)H3PO4。
2、标准蛋白质溶液:纯得牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0、15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
(二)、器材:1、722S型分光光度计使用及原理()。
2、移液管使用()。
(三)、标准曲线制作:1、2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。
1)、利用标准曲线查出回归方程。
2)、用公式计算回归方程。
3)、或用origin作图,测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0、999以上,至少2个9以上。
4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上得点应该在直线两侧。
(四)、蛋白质含量得测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品得A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品得A595nm值在0、1—0、05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。
(五)、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
实验一 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量【实验目的】1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。
2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。
【实验原理】1976年Bradford 等建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。
染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465 nm 变为595 nm ，光吸收增加。
蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1 g 蛋白。
染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
N CH 2CH 3CH 2N +CH 3CH 2CH 2NHCH 3CH 3O CH 2CH 3SO 3-SO 3Na蛋白质+ 蛋白质-染料复合物H +考马斯亮蓝G-250（蓝色，λmax595nm ）【仪器与试剂】1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。
2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。
【实验步骤】1．标准蛋白质溶液的配制称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成1 mg/ml 的溶液。
2．蛋白试剂的配制称取100 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。
试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。
3．标准曲线的制作取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 μl于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。
以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。
4．样品测定取含10~100 μg蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml 蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
考马斯亮蓝 法测定蛋白质含量
二、Bradford法(一）、原理：考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。
这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。
该方法快速、准确、干扰因素少。
CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。
但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。
（二）器材及试剂1、器材A. 分光光度计B. 微量加样器C. 移液管、试管及试管架D. 坐标纸2. 试剂（1）考马斯亮蓝G-250溶液：称取CBB- G-250 100毫克溶于50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升85%（V/V）磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。
（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）（3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。
(4) 血清样品(已稀释200倍)(5) 层析样品(三）、操作（标准曲线制作）：取7支试管按下表操作：混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D 值为纵坐标绘制标准曲线．以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度取试管从层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。
教学内容：实验八考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量【实验目的】1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法【实验原理】此方法是1976年Bradform建立。
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据所测A595值，于标准曲线 上查出相当标准蛋白的量，取
三重复样品蛋白含量均值
以制作标准曲线的1号试管 做空白对照，595nm测吸光度
㈢结果计算
样品蛋白质含量=—m —(µg)—×提—取液—总—体积—（m—l）
／g鲜重﹚
所取提取液体积×样品鲜重（
m为从标准曲线查得的蛋白质含量。
﹙µg
㈣、标准比较法 取三只试管，按下表操作
试管编号 待测管（U) 标准管（S) 对照管（B)
试剂
V(样品提取液）0.1 ／ml
__
__
V（蛋白质标 —
0.1
准液)ml
V(0.9％生理 — 盐水）／ml
__
0.1
V（考马斯亮 3.0 蓝试剂）／㏕
3.0
3.0
混匀放5min
A595
调零
★样品蛋白质提取液含量m(µg)=Au／ As×100
五、注意事项
（µg／0.1ml)
20 40 60
80 100 20 0 80 100
每支试管加入3ml考马斯亮蓝试剂
振荡混合后放置5分钟
A595为纵坐标、标准蛋白含量横坐标 绘制标准曲线
于595nm测定吸光度
㈡样品提取液中蛋白质含量的测定
取3支试管，各吸蛋白提 取液0.1ml，分别加考 马斯亮蓝试剂3ml
振荡混合放置5分钟
三、实验器材与试剂
⒈器材。 可见分光光度计、试管、试管架、研钵、离心机、离心管、
10ml容量瓶、刻度移液管、移液枪、小麦叶片或绿豆下胚 轴。 ⒉试剂。 ⑴0.9％生理盐水 ⑵考马斯亮蓝试剂 称取考马斯亮蓝G250 100㎎，加95％乙醇100ml，溶解后 加85％H３ＰＯ４， 100 ml，加水稀释至 1000ml，存于棕色瓶。 ⑶蛋白质标准溶液
⒈待测液中蛋白质浓度不可过高或过低，应 控制在100~800µg／ml为宜。
⒉比色测定时，考马斯亮蓝易吸附在比色皿 表面，对后续测定造成影响，因此测定结 束后用无水乙醇清洗比色皿。
预期结果
• Brandford染色液和蛋白液在酸性条件 下结合，溶液颜色由棕黑色转为蓝色。
一、实验目的。
⒈掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原 理与方法。
⒉熟练分光光度计的使用和操作方法。
考马斯亮蓝法出现背景
•
双缩脲法和Folin—酚试剂法的
明显缺点和许多限制，促使科学家们去
寻找更好的 蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法
（Bradford法），是根据蛋白质与染料
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。
★实验缺点
（1）Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面 的偏差。
（2）标准曲线也有轻微的非线性。因而不能用Beer定律进行计 算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
准确称取经微量凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配置 1000µg/ml标准溶液。
四、实验步骤
㈠标准曲线的制作 取试管6只，按下表进行编号并加入试剂，充分摇匀。
试管编号
1234 Nhomakorabea56
试剂
V（标准蛋白溶液） 0
／µl
20 40 60
V(0.9％生理盐水） 100 80 60 40
／µl
Ρ(蛋白质含量）／ 0
★在595nm下测定的吸光度值，与蛋白质 浓度成正比
★实验优点
（1）灵敏度高。据估计比Lowry法约高四倍，蛋白质－染料复 合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定， 只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟 至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法 那样费时和严格地控制时间。
相结合的原理设计的。这种蛋白质测定
法具有超过其他几种方法的突出优点，
因而正在得到广泛的应用。这一方法是
目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
二、实验原理
★考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中 与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的 位置，由465nm变为595nm，溶液的颜 色也由棕红色变为蓝色。经研究认为， 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 （特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基 相结合。