考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的具体方法及步骤
考马斯亮蓝法测定蛋白浓度
4.计算蛋白浓度。根据荧光强度的值，使用标准曲线法计算出蛋白浓度。
考马斯亮蓝法是一种快速、准确的测定蛋白浓度的方法，广泛应用于生物学研究、药物分析、食品工业等领域。该方法测定结果精确，但受到样品纯度、测量温度、pH值等因素的影响。因此，在使用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度时，应注意控制样品的质量，保证测量的准确性。
此外，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度时还应注意：
样品的处理应尽量简单，以免影响测定结果的准确性。
考马斯亮蓝溶液的配制应精确，以免影响测定结果的准确性。
在测量过程中应保持室温，以免影响测定结果的准确性。
考马斯亮蓝法是一种常用的测定蛋白浓度的方法。该方法的原理是：蛋白质中含有苯并嘧啶基团，当蛋白质与考马斯亮蓝发生反应时，会产生蓝色的荧光。因此，可以根据荧光的强度来测定蛋白浓度。
测定蛋白浓度的具体步骤如下：
1.准备样品。取一定量的蛋白样品，加入适样品中，搅拌均匀。
蛋白质浓度测定(考马斯亮蓝法)
三、主要仪器：
（1）分析天平、台式天平 （2）具塞刻度试管 （3）吸管 （4）研钵 （5）漏斗 （6）离心机、离心管 （7）容量瓶 （8）微量取样器 （9）分光光度计
四、试剂：
（1）标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并 定容至100ml，制成 100 μg／ml的原液。
（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G－ 250，溶于50ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100ml，最 后用蒸馏水定容到 1000ml。
（1）准确称取约200mg新鲜绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏 水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入 10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上 清液，定容至刻度。 （2）另取2支具塞试管，准确加入0.5 ml样品提取液，再加入0.5 ml蒸 馏水，4ml考马斯亮蓝G－250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲 线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
剂法（Lowry法）
2．制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混
合？（将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测
定时，结果会有较大偏差，使ห้องสมุดไป่ตู้准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。）
3．如何正确使用分光光度计？
八、实验报告：按常规。
分光光度计的使用与注意事项
1. 接好电源线。 2. 启动电源开关，仪器显示“F7230”，预热20分钟（要打开比 色皿盒盖）。 3.（1）设置年、月、日、时、分： 按“CLEAR”键，仪器显示“YEA”进入年份设置，按数字键，输入
4 蛋白质浓度测定(考马斯亮蓝结合法)
实验三、蛋白质浓度测定
（考马斯亮蓝结合法）
六、注意事项：
比色出现蓝色应在2 min～l h内完成。（蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的
反应十分迅速，在2min 左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测 定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。）
七、思考题：
质定量法？（微量凯氏（Kjeldahl）定氮法、双缩脲法（Biuret法、紫外吸收法、Folin—酚试
分光光度计的使用与注意事项
5. 调节波长旋纽使波长移到所需之处。 6. 四个比色皿，其中一个放入参比试样（装量要合适），其余三个放入待 测试样。将比色皿放入样品池内的比色皿架中，夹子夹紧盖上样品池盖。 7. 将参比式样推入光路（注意听‘咔嚓’声），按‚100%t‛键，至显示 ‚T100.0‛（调100）。 8. 打开样品池盖，按‚0%t‛键，仪器显示‚T0.0‛（调零）。 9. 盖上样品池盖，按‚100%t‛键，至显示‚T100.0‛（调100）。 10. 然后将待测试样推入光路，显示试样的‚T‛值（测定）。 11. 如需测定‚A‛或‚C‛，则‚MODE‛键转换即可。 12. 如果要想将待测试样的数据记录下来，只要按‚PRINT‛键即可（打 印）。
实验三、蛋白质浓度测定
（考马斯亮蓝结合法）
一、实验目的：
蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生 物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产 品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手 段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮 蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏 度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。 通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理， 了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
(完整word版)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
如核糖核酸酶或溶菌酶。
去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。
如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。
染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。
注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
适用范围考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。
当考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm 变为595nm。
在考马斯亮蓝G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250 从吸收峰为465nm 的形式转变成吸收峰为595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。
一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
尺度曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、尺度曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作尺度曲线，然后根据尺度曲线查出所测物质的含量。
因此，制作尺度曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—尺度曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、尺度蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、尺度曲线制作：1、1）、利用尺度曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操纵步调1操纵，测出样品的A595nm，然后利用尺度曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，防止温度变更。
4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。
药品的配制（磷酸缓冲液的配制）一、药品的配制步调（一）、实验准备：1、准备所需的药品和玻璃仪器。
考马斯亮蓝结合法
牛奶（酸奶）和豆浆中蛋白质浓度的测定一、目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。
二、原理考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物的高消化效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。
在一定范围内，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物成色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。
故可以用于蛋白质浓度的测定。
三、实验器材1..试管8支2.吸管3. 722型分光光度计4.容量瓶1000ml5.量筒100ml四、实验试剂1.0.9%NaCl溶液2.标准蛋白液：牛血清白蛋白（0.1mg/ml),准确称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至2000ml3.染液：考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸（即市售的质量百分浓度为85%的磷酸），然后加蒸馏水定容到1000ml。
4.样品液：取牛血清白蛋白（0.1mg/ml)溶液，用0.9%NaCl稀释至一定浓度。
五、操作1.标准曲线的制备取7只干净试管，按表1进行编号并加入试剂。
混匀，室温静置3min，以第一管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（ug/ml)作为纵坐标作图得标准曲线。
表1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的制备试剂管号1（空白）2 3 4 5 6 7标准蛋白液/ml0.9%NaCl/ml考马斯亮蓝染液/ml 蛋白质浓度/(ug/ml)——1.04.00.10.94.0100.20.84.0200.30.74.0300.40.64.0400.60.44.0600.80.24.080A595nm2.样液的测定另取一支干净试管，加入样品液1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min,于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
考马斯亮蓝测蛋白
考马斯亮蓝测蛋白法
试剂：蛋白标准液母液：
精确称取10mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于50mL生理盐水中得0.2mg/mL标液；取
0.2mg/mL标液1mL+19mL生理盐水得10μg/mL溶液，配置1-10μg/mL一系列浓度；
考马斯亮蓝G―250染料试剂：
称10mg考马斯亮蓝+5mL 95%乙醇+12mL 85%的磷酸，定容至100mL。
步骤：（1）制作标准曲线:
① 4.5 mL样品（按照标线进行一定的稀释后的样品，可提前离心PBS清洗去除
培养基）加入0.2 mol/L NaOH溶液0.5 mL；
②100℃沸水浴10min并10,000rpm离心10min；
③取4 mL上清再加配制的考马斯亮蓝试剂1 mL，混合静置5 min；
④测试450nm与595 nm处吸光值，以595/450的值做回归
（2）样品中蛋白测定：
将取样的第二组5mL溶液离心分离上清液测PH，底下沉积物加入4.5mL蒸馏水，然后按照步骤①进行测试即可。
试剂：
①Tris－HCl缓冲液（0.05mol/L）：称取三羟甲基氨基甲烷0.6037g，加0.1mol/L的
HCl 17.2mL，蒸馏水定容至100mL，pH为8.4；
②氯化三苯基四氮唑（TTC）（0.1％）：称取0.05gTTC溶于50mL蒸馏水中，即成
0.1％的TTC溶液（每周新配）；
③亚硫酸钠（0.36％）：称0.3657g亚硫酸钠溶于100mL蒸馏水中；
④丙酮、甲醛（分析纯）；
⑤10%硫化钠：称取10g硫化钠（分析纯），定容至100mL棕色容量瓶中；
⑥0.1mol／L葡萄糖溶液：称取1．98179葡萄糖(分析纯)溶于100mL蒸馏水。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量的流程
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考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的具体方法及步骤
蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。
实验原理
考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
考马斯亮蓝染色法的突出优点是：
(1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1 mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
(2)测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在
1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
(3)干扰物质少。
如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。
试剂与器材
一、试剂
考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL。
二、标准和待测蛋白质溶液
1. 标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15 mol/L NaCl配制成1 mg/mL蛋白溶液。
2. 待测蛋白质溶液。
人血清，使用前用0.15 mol/L NaCl稀释200倍。
三、器材
试管1.5×15 cm(×6)，试管架，移液管管0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒温水浴;分光光度计。
操作方法
一、制作标准曲线
取7支试管，按下表平行操作。
试管编号0 1 2 3 4 5 6
标准蛋白溶液
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 （mL）
0.15mol/LNaCl
0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 （mL）
考马斯亮蓝试剂 5 mL
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595 nm处比色
绘制标准曲线：以A595 nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
二、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。
根据所测定的A595 nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
注意事项
在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。