(完整word版)稳定转染细胞系的一般建立方法
稳定转染CD151或CD163的Marcl45细胞系的建立及其在PRRS疫苗生产中的应用
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１ ． １ 质粒 和 细胞
Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ —Ｃ Ｄ Ｉ ５ １ 和ｐ Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ ２ 一 Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ —Ｃ Ｄ１ ６ ３由本 实 验
１ ． ６ 细 胞接 种病 毒
按照 文献 ［ １ ２ １ 的方法 ， 用 细
室 保 存 。Ｍ ａ ｒ ｃ １ ４ ５ 细 胞 由武 汉 中博 生 物 股 份 有 限
胞生长液 （ 含体积浓度 为 ８ ％的 小 牛 血 清 的 Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ 培养 基 ） 对超 表 达 Ｃ Ｄ Ｉ ５ １ 、 Ｃ Ｄ １ ６ ３ 或Ｃ Ｄ １ ５ １ ／ Ｃ Ｄ １ ６ ３
ａ ｄ ｈ ｅ ｓ ｉ ｎ， Ｓ ｎ ） 、 波形蛋 白（ Ｖ ｉ ｍ ｅ ｎ ｔ ｉ ｎ ） 、 Ｃ Ｄ １ ６ ３ （ Ｃ ｌ ｕ ｓ ｔ ｅ ｒ ｏ ｆ
Ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ １ ６ ３ ） 分子 、 Ｃ Ｄ１ ５ １ （ Ｃ ｌ ｕ ｓ ｔ ｅ ｒ ｏ ｆ Ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ．
１ 材 料 与 方 法
Ｐ Ｂ Ｓ 洗 涤 。稍甩 干后 将 有 细胞 的一 面 朝下 用抗 荧 光 淬灭 封 片 剂将 玻 片封 固在 载玻 片 上 ， 于倒 置 荧光 微 镜 下 观察 并 采 集 图像 。 １ ． ５ Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ Ｂ ｌ ｏ ｔ 分析 分别收集 ４ 种 细 胞 并 提 取 总蛋 白， 将 样 品加 入点样孑 Ｌ 中， ５ ％ 浓缩 胶 电泳 ， 转膜 ； ５ ％的脱脂牛奶脱 色 ； 加一抗 （ Ｃ Ｄ １ ６ ３ ， Ｒ ａ ｂ ｂ ｉ ｔ ， １ ： １ ０ ０ ０ ；
织， ４ ｏ Ｃ 孵 育 过 夜 。用 Ｐ Ｂ Ｓ 洗涤３ 次 。滴 加 与一 抗 相 应 种属 的荧 光二 抗 （ ｃ ｙ ３ 标 记 山羊抗 兔 １ ： １ ０ ０ ； ｃ ｙ ３ 标 记 山羊 抗 小 鼠 １ ： ｌ Ｏ ｏ ） ， 覆 盖组 织 ， 避 光 室 温孵 育
细胞转染技术原理及应用（瞬时转染和稳定转染）
细胞转染技术原理及应用（瞬时转染和稳定转染）常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。
前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β 半乳糖苷酶等来帮助检测。
后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。
尽管线性DNA 比超螺旋DNA 转入量低但整合率高。
外源DNA 整合到染色体中概率很小，大约1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA 与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。
一些传统的转染技术，如DEAE 右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：（各种转染方法的比较）除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。
其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。
聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。
这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。
稳定细胞系的构建
二、转染
转染试剂初定为LipofectamineTM 2000 1、转染前24 h，消化牛乳腺上皮细胞并计数，以1X104个细 胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80%— 90%的融合。 2、转染前2h，更换新鲜的1640培养基(10% FBS，无双抗)。 3、用1640培养液(无FBS，无双抗)分别稀释2uL,4uL,6 uL,8uL质粒至体积为50uL，质粒浓度达到0.01ug/uL-0.04 ug/uL,轻轻混匀，室温作用5 min。 4、用1640培养液(无FBS，无双抗)稀释4份Lipofectamine 2000 4 uL至体积为50 uL，轻轻混匀，室温作用5 min 。
5、分别混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine 2000，此 时单份体积为100 uL，质粒DNA跟转染试剂比分别为（1:2， 1:1，1.5:1，2:1ug/ul）轻轻混匀，室温作用20 min。 6、将12孔板中的旧培养液吸出，用1640培养液 (无FBS） 洗两次，加入400ul1640 (无FBS） 培养液。 7、逐滴加入脂质体/DNA混合物到不同孔中，边加边前后来 回摇动培养板，轻轻混匀。同时设立未转染（500uL无 FBS1640培养液）和转染空白载体对照（4uL Lipofectamine 2000+496uL无FBS1640培养液）。 8、在细胞培养箱中孵育6 h，弃去培养液，加入1640培养液 (10%FBS) 培养48小时。
稳定细胞系的构建
一、筛选药物浓度的测定
1、G418的配制： 1gG418溶入1mlPBS中，再双蒸水到7ml，制成1mg/ml 浓度，过滤保存。 2、筛选浓度测定： 取24孔板接种细胞，待细胞长至汇合度80%~90%时吸取 培养基，PBS洗涤后加入筛选培养基。 筛选培养基G418的浓度梯度为0，200，300，400，500， 600，700，800，900，1000ug/ml，每浓度两孔，根据 细胞生长情况2~3天更换一次筛选液。 3、选定10~14天细胞全部死亡的最小浓度为筛选浓度，一半 浓度为维持浓度。
猪PBD-1稳定转染细胞系的建立
猪PBD-1稳定转染细胞系的建立传统抗生素的广泛使用导致耐药菌株大量产生,特别是多重耐药菌的出现给感染性疾病的治疗带来了许多新的问题,因此寻找和开发无耐药性的新型抗菌药物对于畜牧业具有非常重要的现实意义。
近年来在生物体内发现的防御素类物质就具有这种特殊的抗菌活性,Ganz等将其命名为防御素(Defensins)。
猪的β防御素l(porcine β defensin 1,PBD-1)广泛分布于肝、呼吸道、胸腺、脾脏、脐带等多种细胞内,在猪防御系统中有重要作用,既可用作畜禽饲料添加剂,也可用于食品保鲜剂,还可开发成新的广谱抗菌药物,因此猪防御素的成功获取能带来极大的、经济效益。
但是,猪体内天然防御素表达量低、分子小,分离困难,化学合成防御素成本又太高,所以利用基因工程技术重组表达外源基因已成为获取目标蛋白的有效途径之一[3-7]。
本研究将猪PBD-1真核表达载体稳定转染marc-145细胞,通过单克隆筛选,建立了稳定的转基因细胞系,为进一步研究猪PBD-1的生物学特性及其在兽用生物制品上的应用奠定了基础。
1材料与方法1.1主要试剂转染试剂Lipofectamine 20XX年和筛选试剂G418均由1/ 6Invitrogen公司生产;DMEM高糖培养基、胎牛血清由Gibco公司生产;胰蛋白酶、PBS等为国产。
限制性内切酶EcoRI、BamH I、T4 DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、DNA marker、DNA Gel Extraction Kit均购自华美生物工程公司;RNeasy Mini RNA 提取试剂盒由Qiagen(德国)公司生产;蛋白胨和酵母浸提液来自Oxoid公司;引物由上海生物工程公司合成。
1.2菌种、质粒和细胞大肠杆菌DH5α为本室保存,质粒pMD18-T 由TaKaRa公司提供。
质粒载体pIRES2-EGFP-PBD-1由本实验室构建。
marc-145细胞购自武汉中博生物股份有限公司,在本实验室传代保存。
稳定转染步骤
稳定转染细胞株的制备带质粒的大肠杆菌的激活和扩增（1）取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻，或者放置37℃恒温水中约2min,待冰完全融解即可使用。
（2）LB培养基的制备按照如下配方配制胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L酵母提取物(Yeast extract) 5g/L氯化钠(NaCl) 10g/L用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4，高温高压灭菌后室温保存，使用时加入氨苄青霉素(浓度为0.1mg/ml)（3）LB固体培养基的制备到200mlLB液体培养基加入3g琼脂混匀后高温高压灭菌，待冷却至约55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀，分别倒入6-7个培养皿中，用封口膜封边，并倒置放于4℃保存。
（4）扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到LB固体培养基上，待凉干后，用封口膜将培养皿封闭，然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃)，根据情况可适当延长培养时间。
观察培养基上的单克隆工程菌，待长出后，用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到10mlLB液体培养基中，放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜，第二天观察，待LB液体培养基变浑浊后，4℃冰箱保存，以待进行下一步质粒的提取。
质粒的提取准备质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液（1）取75ml扩增变浑浊的LB液体培养基置于试管中。
（2）5,000×g离心10分钟，弃去上清液，将试管倒置在滤纸上空干。
（3）取出质粒提取盒，用3ml细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。
（4）加入3ml细胞裂解液，轻轻摇晃试管混匀，室温下孵育3分钟，产生白色絮状沉淀，然后加入5ml中和液混匀（5）将Clearing Column(兰色)放入一新的50ml离心管，将上述试管中裂解后的液体倒入兰管，孵育2分钟，1500×g离心5分钟，效果不佳的话可再离心一次，离心液待用。
（6）将Binding Column(白色)放入一新的50ml离心管，取上述离心液倒入白管，1500×g离心3分钟，弃去离心液。
稳定转染细胞株（系）详细构建流程
稳定转染细胞株（系）详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。
对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。
本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。
稳定转染实验流程从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。
在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。
最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。
细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。
细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。
载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。
接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。
细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。
另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。
稳定转染实验影响因素外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
稳转细胞系构建简单原理_概述说明以及解释
稳转细胞系构建简单原理概述说明以及解释1. 引言1.1 概述在细胞生物学和遗传学领域，稳转细胞系构建是一项重要的技术，用于研究基因表达、蛋白质功能以及疾病的发生机制等。
稳转细胞系构建是指将外源基因或RNA序列引入目标细胞系中，并使其表达并稳定地传递给后代细胞。
这项技术为科学家们提供了一个探索和理解生命活动的重要工具。
1.2 文章结构本文将分为五个部分进行阐述。
首先，在引言部分对稳转细胞系构建进行概述和解释，介绍文章主要内容。
第二部分将详细介绍稳转细胞系构建的基本概念以及常用的方法。
接着，第三和第四部分将侧重于讨论关键要点一和关键要点二，并解释其原理、提供示例或案例分析，并对应用场景进行分析。
最后，在结论与展望部分，将对已述内容进行总结，并提出对未来发展的展望或建议。
1.3 目的本文的目的是向读者介绍稳转细胞系构建的简单原理，包括基本概念、构建方法和原理解释。
同时，通过讨论关键要点一和关键要点二的实例和案例分析，以及对其应用场景的分析，帮助读者更好地理解该技术在科学研究中的意义与应用。
通过本文的阅读，读者将能够对稳转细胞系构建有一个全面且清晰的认识，并为未来相关研究提供参考依据。
2. 稳转细胞系构建简单原理2.1 基本概念解释稳转细胞系是指通过基因转染或基因编辑技术，使得一种细胞在经过多代分裂之后，其特定基因的表达能够被持续稳定地维持。
这样的细胞系在科学研究和生物制药领域中具有重要的应用价值。
2.2 稳转细胞系构建方法构建稳转细胞系的方法主要包括基因转染、基因编辑和选择标记等步骤。
a) 基因转染：常见的基因转染方法包括质粒DNA介导的转染、病毒载体介导的转染以及利用脂质体或者聚合物等载体传递外源基因到目标细胞中。
b) 基因编辑：目前常用的基因编辑技术为CRISPR-Cas9系统，通过引入Cas9核酸酶和相应的寻找序列（sgRNA），实现对目标基因组进行特异性剪切、插入或敲除等修饰。
这种方法可以直接修改目标细胞内特定基因座位，从而实现特定功能蛋白的表达。
稳定转染细胞系的一般建立方法
转染克隆的G418筛选和分离对于需要建立某些基因已经整合到染色体DNA（通过稳定或永久转染）的细胞系来说，理想的是使用选择标记，通常也是必要的。
虽然有许多标记可利用，但G418(氨基糖苷类抗生素)为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。
G418是一种氨基糖苷类似物，在结构上与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似，它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。
因此在哺乳动物细胞中表达细菌APH（氨基糖苷类磷酸转移酶）基因将产生G418的解毒作用。
这一程序提供了建立G418选择条件的一般性指导，特殊条件由研究者个人决定。
1.建立死亡曲线，确定最佳筛选浓度（参考建立方法见附录）；2.细胞铺板：转染后24小时将贴壁的细胞传代（传代时，注意通过在显微镜下观察，控制细胞密度，不能使细胞太密集，应该少于生长表面的50%，参考为20%-30%）至15cm 培养皿，加入15~20ml培养基（DMEM，含血清）进行培养；3.用最佳筛选浓度的G418对细胞进行筛选：铺板完成后，再过24小时，抗性表达，用最佳筛选浓度的G418进行筛选（对于Hela细胞，一般筛选终浓度为800ug/ml）。
具体操作是去除旧的培养基，用PBS洗一次，将含有浓度为800ug/ml（以Hela为例）的培养基15~20ml加入培养皿内即可；4.换液：每日及时观察细胞，根据培养基的颜色和细胞生长情况，及时更换相同浓度（800ug/ml）的培养基，大概持续筛选一周左右，直至空白对照组（未转染组）细胞死亡大部分（至少30%以上）；5.撤药维持阶段：待空白组细胞大部分死亡后，将实验组（转染组）进行换液，此时所用培养基含G418的终浓度为200ug/ml（维持浓度），维持生长（若细胞仍有死亡，需要继续降低药的浓度，参考为50-100ug/ml），直至筛选克隆可见为止（大约2~3天）；6.分离克隆以获得最大数量细胞（提高克隆成活可能性），减少单个克隆受其他细胞污染的机会。
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转染克隆的G418筛选和分离
对于需要建立某些基因已经整合到染色体DNA（通过稳定或永久转染）的细胞系来说，理想的是使用选择标记，通常也是必要的。
虽然有许多标记可利用，但G418(氨基糖苷类抗生素)为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。
G418是一种氨基糖苷类似物，在结构上与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似，它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。
因此在哺乳动物细胞中表达细菌APH（氨基糖苷类磷酸转移酶）基因将产生G418的解毒作用。
这一程序提供了建立G418选择条件的一般性指导，特殊条件由研究者个人决定。
1.建立死亡曲线，确定最佳筛选浓度（参考建立方法见附录）；
2.细胞铺板：转染后24小时将贴壁的细胞传代（传代时，注意通过在显微镜下观察，控
制细胞密度，不能使细胞太密集，应该少于生长表面的50%，参考为20%-30%）至15cm 培养皿，加入15~20ml培养基（DMEM，含血清）进行培养；
3.用最佳筛选浓度的G418对细胞进行筛选：铺板完成后，再过24小时，抗性表达，用最
佳筛选浓度的G418进行筛选（对于Hela细胞，一般筛选终浓度为800ug/ml）。
具体操作是去除旧的培养基，用PBS洗一次，将含有浓度为800ug/ml（以Hela为例）的培养基15~20ml加入培养皿内即可；
4.换液：每日及时观察细胞，根据培养基的颜色和细胞生长情况，及时更换相同浓度
（800ug/ml）的培养基，大概持续筛选一周左右，直至空白对照组（未转染组）细胞死亡大部分（至少30%以上）；
5.撤药维持阶段：待空白组细胞大部分死亡后，将实验组（转染组）进行换液，此时所用
培养基含G418的终浓度为200ug/ml（维持浓度），维持生长（若细胞仍有死亡，需要继续降低药的浓度，参考为50-100ug/ml），直至筛选克隆可见为止（大约2~3天）；
6.分离克隆以获得最大数量细胞（提高克隆成活可能性），减少单个克隆受其他细胞污染
的机会。
具体操作是：a.用PBS洗含有克隆的培养物，圈出欲分离的克隆。
从培养皿中除去液体，准备24孔板收集克隆；b.从培养皿中用牙签或者棉棒（经过高压）挑取已分离出的克隆（具体操作是先用棉棒蘸一下胰酶，再蘸一下克隆）；c.在24孔板的一个孔中（事先已加入完全培养基，不含G418）剧烈摇动牙签，使细胞沉于孔中，继续挑取下一个克隆；
7.CO2孵箱，温育细胞约两小时；
8.两小时后，镜检培养皿，确定细胞是否附着。
如果已经附着，用新鲜完全培养基（含
50ug/ml G418）更换24孔板培养基，除去残留的胰蛋白酶，继续培养直到培养物长满；
9.一旦小量培养物长满，转接到大的培养皿（通常先是6孔板），用50ug/ml的新鲜完全
培养基维持培养，然后与同样类型的其他细胞一样处理即可。
附录：死亡曲线建立方法
1.G418的配制：取G418共1g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml中，加蒸馏水至10ml，过滤
除菌，4℃保存；
2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6h
左右开始加药；
3.制备筛选培养基：在100~1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100、400、800、
1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基；
4.加G418筛选：吸除培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基；
5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每隔3~5d更换一次筛选培养基；
6.确定最佳筛选浓度：在筛选10~14d内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选
浓度。