稳定转染细胞株的制备
GPR41稳定细胞株的建立及受体激动剂筛选
GPR41稳定细胞株的建立及受体激动剂筛选吴瑨;董素珍【摘要】构建GPR41稳定细胞株,从RNA、蛋白水平验证了GPR41的表达并利用cAMP和钙流检测验证了GPR41的生物活性.实验结果表明,该细胞株可以用于筛选受体激动剂.从海藻来源的黄曲霉中提取到的次级代谢产物用于筛选GPR41的激动剂.实验结果还表明,2-吡喃酮类化合物(37号)在1μmol/L浓度条件下即可具有GPR41受体激动活性.这是首次报道2-吡喃酮类化合物具有GPR41受体激动活性.%In this study, a stable GPR41 receptor cell model was established. The GPR41 expression was detected by RT-PCR and western blot,while the function of GPR41 was confirmed by cAMP and Ca assays. These results have shown that we have successfully established GPR41 cell line which can be used for screening the agonists of the receptor in vitro. GPR41 receptor binding activity was tested by cAMP assay using secondary metabolites extracted from gulf seaweed aflatoxin c-f-3 in Putian Fujian. The results have also shown that the No. 37 compound, a new compound belonging to 2-Pyrones, has GPR41 receptor agonist activity with high affinity. This is the first report on 2-Pyrones with GPR41 receptor agonist activity.【期刊名称】《华东师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(000)006【总页数】9页(P73-80,102)【关键词】GPR41;稳定细胞株;海洋真菌次级代谢产物;配体【作者】吴瑨;董素珍【作者单位】华东师范大学脑功能基因组学教育部重点实验室、上海市脑功能基因组学重点实验室,上海200062;华东师范大学脑功能基因组学教育部重点实验室、上海市脑功能基因组学重点实验室,上海200062【正文语种】中文【中图分类】Q780 引言GPR40家族包含4个成员（GPR40、GPR41、GPR42和GPR43），该家族在人、小鼠及大鼠等物种间的氨基酸序列高度保守［1］.其中GPR41的表达分布较为广泛，在脂肪组织中的表达量最高，在单核细胞和嗜中性粒细胞中也有表达［2］.自1997年发现GPR41受体以来，因未发现其配体故GPR41一直被归为孤儿GPCR.直到2003年，Brown等人发现GPR41的配体是短链脂肪酸［3］.短链脂肪酸是指碳原子数小于6个的有机脂肪酸，乙酸盐（C2）、丙酸盐（C3）和丁酸盐（C4）是最主要的短链脂肪酸，主要由食物中不被消化的碳水化合物经厌氧菌酵解生成，为胃肠道上皮细胞提供了主要的能量来源［2］.短链脂肪酸除了作为能量来源，还可以参与诱导细胞分化和促进细胞凋亡等生理现象.GPR41的去孤儿化，促使人们重新思考短链脂肪酸在体内发挥作用的方式.已有研究表明GPR41参与调节瘦素的分泌，这表明GPR41可参与能量代谢过程［4］.鉴于GPCRs在制药领域占有极其重要的地位，对于创新药物研究意义重大，而且目前对GPR41的配体筛选以及功能所知甚少，因此本实验构建了GPR41稳定细胞株，用于筛选GPR41的激动剂或拮抗剂.在现代药物研究中，天然产物的开发和利用占据着重要的位置.而海洋资源的开发逐渐成为热点，因为海洋环境具有高盐、高压、低温等特点，海洋生物为了适应这样独特的生存环境，渐渐进化出了与之相适应的代谢系统和机体防御系统.在海洋生物及其代谢产物中，已经发现了许多新颖的生物活性物质，如抗肿瘤药物、生物毒素、酶抑制剂、抗病毒化合物以及抗菌素等［5］.在海洋生物资源中，海洋真菌具有种类繁多、分布广泛、次级代谢产物量大、生物活性物质种类丰富等特点，研究海洋真菌次级代谢产物逐渐成为开发海洋药物资源的重要内容.将GPR41受体稳转细胞模型用于筛选从福建莆田平海湾海藻来源的黄曲霉c－f－3（Aspergillusflavus）中提取到的次级代谢产物.通过cAMP检测法对上述单体化合物进行受体结合活性的筛选，希望能够找到GPR41潜在的受体激动剂，为后续的研究奠定基础.1 材料与方法1.1 材料人类基因组DNA、DNA连接试剂盒和Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司；Taq酶、脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）、限制性内切酶和Trizol 试剂购自TaKaRa公司；质粒及核酸片段纯化试剂盒、Western显影用BCIP／NBT显影液购自Promega公司；RPMI－1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素和G418购自Gibco公司；Blasticidin和兔抗c－Myc多克隆抗体购自Sigma；cAMP检测试剂盒购自法国CIS生物公司；钙流检测试剂盒购自Molecular Devices公司；大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞、pcDNA3.1－N－myc和Gα载体由本实验室保存；用于cAMP测试的单体化合物为中国海洋大学分离提纯并提供［6］；其余化学试剂均为国产分析纯试剂.1.2 实验仪器PTC100 PCR仪购自东胜创新生物科技有限公司；凝胶成像仪购自基因公司；紫外分光光度计购自Eppendorf公司；CO2培养箱购自Thermo Life sciences公司；Analyst HTTM仪和FlexStation II Reader读板仪购于Molecular Devices 公司.1.3 方法1.3.1 GPR41－pcDNA3.1质粒的构建参照GenBank中提供的人GPR41的序列（序列号NM＿005304）设计并合成PCR扩增引物，以人类基因组DNA为模板扩增得到GPR41全长序列.引物序列如下：上游引物：5′－GGGGTACCATGGATACAGGCCCCGAC－3′；（斜体表示上游酶切位点KpnI）下游引物：5′－CCGCTCGAGCTAGCTTTCAGCACAGGCA－3′（斜体表示下游酶切位点XhoI）运用酶切连接等基因工程手段将GPR41序列插入pcDNA3.1－N－myc载体，构建GPR41－pcDNA3.1重组质粒.经酶切和测序鉴定确认重组子的序列.1.3.2 细胞培养野生型中国仓鼠卵巢细胞（CHO）购自中科院上海生物研究所细胞库.该细胞用含有10%胎牛血清、100 U／mL青霉素、100μg／mL链霉素的RPMI－1640培养基培养.待实验用细胞处于对数生长期，且细胞密度达到80%～90%时进行转染实验.1.3.3 GPR41稳定细胞株的建立将GPR41－pcDNA3.1重组质粒与pcDNA3.1空载体分别转染CHO细胞，操作方法按脂质体转染试剂Lipofectamine2000说明书进行.转染48 h后，用含有750μg／mL G418抗生素的筛选培养基进行筛选.将Gα质粒与GPR41－pcDNA3.1或pcDNA3.1空载体共转染CHO细胞，操作方法如上所述.转染48 h 后，用含有750μg／mL G418和5μg／mLBlasticidin的筛选培养基进行筛选.以野生型CHO细胞作为筛选的阴性对照.待野生型CHO细胞全部死亡后，将具有抗生素抗性的稳定转染细胞株，进行单克隆筛选.经筛选的单克隆细胞株（GPR41－CHO）或（GPR41－Gα－CHO）用于后续检测鉴定.1.3.4 用RT－PCR方法检测稳转单克隆GPR41的表达提取GPR41－CHO总RNA，经反转为cDNA后，用PCR方法检测GPR41的表达.设计并合成检测GPR41基因的引物，以GAPDH基因作为内参.GPR41引物序列上游引物：5′－ttcttcaccaccatctatctcacc－3′；下游引物：5′－aattctatgacgtagaccacgctg－3′.GAPDH 引物序列上游引物：5′－catcatccctgcatccactg－3′；下游引物：5′－tgcctgcttcaccaccttct－3′.1.3.5 Western Blot检测稳转单克隆GPR41的表达根据RT－PCR的结果挑选稳转单克隆，用Western及IP细胞裂解液、1 mmol ／L PMSF和10μL／mL的Cocktail蛋白酶抑制剂提取细胞总蛋白.经BCA法测定总蛋白浓度后，用于Western Blot检测.经SDS－PAGE电泳、转膜后，用丽春红染色.经双蒸水或TBST充分漂洗后，在5%BSA中室温封闭1 h.按1∶1 000的比例稀释一抗，4℃孵育过夜.经漂洗后孵碱性磷酸酶连接的二抗，充分漂洗后用BCIP／NBT显影.1.3.6 cAMP法检测稳转单克隆GPR41的活性根据RT－PCR和Western Blot的结果筛选部分GPR41－CHO稳转单克隆，以每孔103个细胞的密度铺384孔板（孔底和孔壁均为黑色）培养24 h.因为GPR41属于Gi偶联的受体，受体激活后会导致cAMP水平降低，故需要先用10μmol／L Foskolin孵育细胞30 min后，再进行cAMP检测.按照法国CIS－Bio公司cAMP检测试剂盒的说明书操作，细胞内源cAMP与XL665标记的cAMP竞争结合cAMP抗体，根据665 nm／620 nm的荧光值计算并分析细胞内cAMP水平的变化情况.1.3.7 钙流检测稳转单克隆GPR41的活性筛选部分GPR41－Gα－CHO稳转单克隆，以每孔3×104个细胞的密度铺96孔板（透明底黑色壁），37℃培养24 h.按照Molecular Devices公司钙流检测试剂盒的说明书配制Loading Buffer，并加入终浓度1.25 mmol／L Probenecid和2.5μmol／L的Fluo－3 AM 荧光染料.混匀后，按照每孔100μL加入细胞孔内.37℃孵育1 h后，利用FlexStation II Reader读板仪收集细胞孔内的荧光信号.1.3.8 GPR41稳定细胞株受体激动剂的筛选用cAMP方法从海洋真菌次生代谢产物中筛选GPR41受体激动剂，cAMP检测方法如前所述，用于测试的单体化合物的浓度为10μmol／L，1μmol／L和100 nmol／L，每个浓度做3个平行孔.1.3.9 数据处理及分析本实验所有数据及作图均用Sigma－Plot 9.0软件处理，每组实验均重复3次.结果用平均值±标准误差表示.2 实验结果2.1 GPR41－pcDNA3.1质粒的构建从人基因组中用PCR扩增人GPR41基因全长片段，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，符合预期片段大小（1 041 bp）.琼脂糖凝胶电泳结果见图1a.GPR41－pc3.1重组质粒经酶切后电泳结果见图1b，酶切片段大小符合预期.将重组质粒测序后，测序结果与Gen－Bank检索的GPR41基因序列（序列号NM＿005304）完全一致.图1 GPR41－pcDNA3.1质粒的构建Fig.1 Construction of GPR41－pcDNA3.1plasmid2.2 RT－PCR法检测GPR41的表达提取细胞总RNA反转录为cDNA，从RNA水平检测稳定细胞株中GPR41的表达.图2的RT－PCR结果表明在空载体转染的CHO细胞中，无GPR41的扩增条带；而GPR41－CHO细胞中有明亮的扩增条带，说明在RNA水平上检测到GPR41的表达.图2 RT－PCR检测RNA水平GPR41的表达结果Fig.2 RT－PCR results to detect the RNA expression of GPR412.3 Western Blot检测c－Myc标签的表达选取部分定量结果较好的细胞克隆，用 Western Blot检验GPR41质粒所带的c －Myc标签的表达，间接反应GPR41的蛋白的表达水平.目的蛋白的大小应为GPR41与c－myc融合蛋白的大小.图3的Western Blot结果表明在野生型CHO 细胞中，无目的条带的表达；而GPR41－CHO不同的单克隆细胞株中有蓝紫色的显色条带，说明在蛋白水平上检测到GPR41的表达.图3 Western Blot方法检测蛋白水平c－myc的表达结果Fig.3 Determination of GPR41 protein levels in CHO WT and transfected cells using western blot2.4 GPR41稳转细胞株中GPR41功能的检测根据Western Blot结果，选取部分GPR41－CHO克隆用cAMP方法检测GPR41受体的功能.前人研究已经证实GPR41属于Gi／o偶联受体［7］，因此需要先用腺苷酸环化酶的激活剂forskolin诱导细胞内cAMP水平升高，当GPR41受体与其配体结合后，引起cAMP浓度降低，以此来测定GPR41的活化情况.如图4cAMP实验结果显示，10μmol／L forskolin在GPR41过表达细胞和Mock细胞中引起cAMP水平上升3倍左右.500μmol／L丁酸钠引起G41过表达的细胞株cAMP水平降低且有显著差异（P＜0.05），而在mock细胞中cAMP水平未见明显变化（P＞0.05）.选取部分GPR41－Gα－CHO克隆用于检测钙流.实验结果如图5所示.500μmol／L丁酸钠作用于对照组细胞没有引起钙流的变化，而作用于GPR41－Gα－CHO细胞株时引起了钙流的变化.上述实验结果表明GPR41稳定细胞株构建成功可以用于筛选GPR41受体的激动剂.图4 500μmol／L丁酸钠和10μmol／L forskolin分别作用于G41－CHO和Mock细胞引起的cAMP水平变化Fig.4 Effect of butyrate（500μmol／L）and forskolin（10μmol／L）on the release of cAMP in GPR41－CHO and the mock cells图5 500μmol／L丁酸钠作用于GPR41－Gα－CHO和Mock细胞引起钙流变化Fig.5 Effect of butyrate（500μmol／L）on the release of calcium in GPR41－Gα－CHO and the mock cells2.5 GPR41稳定细胞株受体激动剂的筛选结果每种单体化合物在初筛过程中选取3个作用浓度10μmol／L，1μmol／L和100 nmol／L，根据初筛结果，选取有响应的化合物进行复筛，每组设置3个平行孔，以确保筛选结果的准确.实验结果如图6所示，10μmol／L foskolin可以显著提高GPR41－CHO和mock细胞中cAMP的水平，37号化合物可以显著降低GPR41－CHO细胞的cAMP水平（P＜0.01），而mock细胞中cAMP水平则没有明显变化（P＞0.05）.该实验结果说明，37号化合物可能是GPR41受体的潜在激动剂，在1μmol／L的浓度下即可引起细胞内cAMP水平的降低.其余化合物未见类似作用.图6 （a）37号化合物作用于G41－CHO初筛结果；（b）37号化合物作用于G41－CHO和 Mock细胞引起cAMP水平变化Fig.6 （a）Primary screen results of No.37 compound on cAMP accumulation in GPR41－CHO cells；（b）Effect of No.37 compound on cAMP accumulation in GPR41－CHO and Mock cells3 讨论G蛋白偶联受体GPR41在多种组织中均有表达，而且在人、小鼠及大鼠等物种间的氨基酸序列高度保守.自从2003年发现GPR41的配体是短链脂肪酸后，已有研究表明GPR41与能量代谢密切相关.但是目前关于GPR41受体的功能和GPR41受体激动剂的研究仍需深化，因此本实验将研究目的确定为GPR41受体激动剂的筛选，为后续研究该受体的功能，以及揭示GPR41在生理和病理条件下扮演的角色打下基础.本文首先选择中国仓鼠卵巢细胞（CHO）作为细胞表达系统，因为CHO细胞具有转染效率高、细胞容易操作、背景干净、内源性干扰小等特点［2］.在构建GPR41－CHO稳定细胞株后，首先运用RT－PCR和Western Blot检测了RNA 水平和蛋白水平上GPR41的表达，但是上述检测的阳性结果并不足以说明构建的GPR41具有活性.随后利用cAMP和钙流检测，从功能水平上进行了验证.实验结果显示，当配体丁酸钠与GPR41受体相结合时，可以通过cAMP水平的高低来评估受体激动剂的活性.本实验构建的GPR41具有受体活性，过表达细胞株构建成功.短链脂肪酸作为GPR41低亲和力的配体，短链脂肪酸激活GPR41的浓度范围在微摩尔数量级（几百微摩尔至毫摩尔）［8］.短链脂肪酸相对的“低效”可能与它在血液中浓度较高以及其生理功能相关.GPR41作为短链脂肪酸的低亲和力受体，只在短链脂肪酸水平异常升高的情况下才会被激活，因此可以避免受体的持续活化［9］.除此之外，短链脂肪酸也并非GPR41特异性的配体，不同碳链长度的短链脂肪酸，对于GPR41激活有不同的效力.因此筛选特异性高、亲和力强的配体成为本课题的研究目标.筛选的范围锁定在从福建平海湾海藻来源的黄曲霉中提取的一系列次级代谢产物［10］，因为海洋真菌次生代谢产物种类繁多，生物活性物质丰富.近年来已经从海洋真菌次生代谢产物中发现了多种抗肿瘤药物、生物毒素和酶抑制剂等生物活性物质，研究海洋真菌次级代谢产物逐渐成为开发天然药物资源的重要内容.cAMP筛选结果表明，在GPR41细胞中，1μmol／L37号化合物能够降低由foskolin引起的cAMP水平升高，在mock细胞中则不会引起这种变化趋势.在另外一种GPCR－CHO过表达细胞株（GPR12－CHO）未发现cAMP水平的变化.这一现象表明37号化合物具有GPR41受体激动活性，有可能成为GPR41的潜在配体.经结构解析后发现，37号化合物是一种新化合物，属于吡喃酮类化合物［11］.这是首次报道2－吡喃酮类化合物具有GPR41受体激动活性.但是这种化合物是否是该受体特异的激动剂，仍需要进一步实验证明.综上所述，GPCR作为新药靶点的意义备受关注，但是仍有一些重要问题亟待解决，例如对GPR41生理功能的认识和病理意义的研究，又如对初筛得到的化合物进行构效关系研究.利用cAMP检测方法对海洋真菌次级代谢产物活性成分进行研究，并对初筛得到的化合物进行化学结构的修饰和优化，并研究化学结构与生物活性之间的关系，开发出有针对性和高效性的化合物，将对新药的开发和对G蛋白偶联受体的功能研究将产生重要的影响.针对GPCR开发更多特异性强、副作用小的全新天然小分子化合物，将为药物开发带来新的突破.［参考文献］［1］ 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稳定转染细胞株（系）详细构建流程
稳定转染细胞株（系）详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。
对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。
本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。
稳定转染实验流程从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。
在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。
最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。
细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。
细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。
载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。
接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。
细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。
另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。
稳定转染实验影响因素外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
稳定细胞株筛选
稳定株构建 FAQ转自微博思路迪慢病毒包装1，什么是瞬时转染和稳定转染？答：瞬时转染：顾名思义，外源片段的表达时间短暂。
这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。
而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。
这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。
稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。
在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。
稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。
稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。
因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。
质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。
不同基因传递方法对质粒稳定表达的影响见表XXXX。
2，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？∙答：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：∙1)，外源插入片段的拷贝数。
多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。
∙2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。
∙3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。
最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。
∙4)，整合后的稳定性。
不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。
∙5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。
因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。
Let-7a稳定转染尤文肉瘤细胞系的建立
７ ａ 、 ｓ Ｋ — Ｅ Ｓ 一 １ ／ ｌ ｅ ｔ 一 ７ ａ 。方 法 ： 通过 Ｇ ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｙ 克 隆技 术 ， 扩增 ａ ｔ ｔ Ｂ １ 一 Ｋ — ｅ Ｇ Ｆ Ｐ — ｌ ｅ ｔ 一 ７ ａ 一 １ 一 ａ ｔ ｔ Ｂ ２片段 ， 与ｐ Ｄ Ｏ Ｎ Ｒ ２ ２ １ 进行 Ｂ Ｐ重组反应
产生入门克隆 ， 再与母载体——ｐ Ｌ Ｖ ． Ｄ ｅ ｓ ２ ｄ ． Ｐ ／ ｎ ｅ ｏ 进行 Ｌ Ｒ重组 反应 ， 生成 目的质粒——ｐ Ｌ Ｖ ． Ｄ ｅ ｓ ２ ｄ ． Ｐ ／ ｎ ｅ ｏ — Ｅ Ｆ １ Ａ ＞ ｅ Ｇ Ｆ Ｐ ／ ｌ ｅ ｔ 一 ７ ａ ； 通 过Ｐ Ｃ Ｒ及 测序验证 目的质粒 ； 将携带 ｌ ｅ ｔ 一 ７ ａ的重组慢病毒质粒 稳定转染 Ｅ ｓ细胞株 Ａ ６ ７ ３ 和Ｓ Ｋ — Ｅ Ｓ 一 １ 获得 Ａ ６ ７ ３ ｌ ／ ｅ ｔ 一 ７ ａ 、 Ｓ Ｋ — Ｅ Ｓ 一 １ ｌ ／ ｅ ｔ 一 ７ ａ细胞 株 ； 通过 ｒ ｅ ａ ｌ — ｔ ｉ ｍ ｅ Ｐ Ｃ Ｒ检测稳定转染 细胞 株 内 ｌ ｅ ｔ 一 ７ ａ的表达水平 ， Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 检测其靶基 因 Ｃ Ｄ Ｋ ６的表达 。 结果 ： Ｐ Ｃ Ｒ证 实获得 的 目的条带与理论值相符 ， 测序分析证实携 带 ｌ ｅ ｔ 一 ７ ａ的真核表达载体插入序 列及 位点正确 ； ｒ ｅ ａ ｌ明显减少。结论 ： 成功构建稳定表达 ｌ ｅ ｔ 一 ７ ａ的 Ｅ ｓ细胞株 Ａ ６ ７ ３ ｌ ／ ｅ ｔ 一 ７ ａ 、 Ｓ Ｋ — Ｅ Ｓ 一 １ ｌ ／ ｅ ｔ 一 ７ ａ 。
【 关键词】 ｌ ｅ ｔ 一 ７ ａ ； 尤文肉瘤； Ａ ６ ７ ３ 细胞； Ｓ Ｋ — Ｅ Ｓ 一 １ 细胞 ； 慢病毒 【 中国图书分类法分类号］ Ｒ ７ ３ ８ ． １ 【 文献标志码】 Ａ 【 收稿日期】 ２ ０ １ ２ — ０ ３ — ２ ２
稳定细胞株的构建流程
稳定细胞株的构建流程以稳定细胞株的构建流程为标题，写一篇文章细胞株是一种在实验室中长期培养的细胞群体，可以用于研究细胞功能和生物学过程。
在科学研究中，稳定细胞株的构建是一项重要的技术，可以用于表达感兴趣的基因或蛋白质，并进行相关功能研究。
本文将介绍稳定细胞株的构建流程，帮助读者了解该技术的基本原理和操作步骤。
1. 选择合适的细胞株稳定细胞株的构建首先需要选择一个合适的细胞株作为基础。
常用的细胞株有HEK293、CHO、HeLa等。
选择细胞株时需要考虑其易于培养、易于转染以及适合研究目的的特点。
2. 构建表达载体表达载体是构建稳定细胞株的关键，它可以帮助将感兴趣的基因或蛋白质引入到细胞中。
常用的表达载体有质粒、病毒、RNA干扰等。
根据实验需要选择合适的表达载体，并将感兴趣的基因或蛋白质插入到载体中。
3. 转染细胞将构建好的表达载体转染到目标细胞中。
转染方法有多种，包括化学法、电穿孔法、病毒介导转染等。
选择合适的转染方法，将表达载体引入到细胞中。
4. 选择稳定细胞转染后的细胞群体中，只有少数细胞成功地表达了目标基因或蛋白质。
为了筛选出这些稳定细胞，可以加入适当的筛选物质。
例如，如果表达载体中带有抗生素抗性基因，可以在培养基中加入相应的抗生素，只有表达了该基因的细胞才能存活下来。
5. 单克隆分离从筛选后的细胞中挑选出单个细胞，进行单克隆分离。
这可以通过限稀稀释法或流式细胞分选法来实现。
将单个细胞分离培养，得到单克隆细胞株。
6. 鉴定稳定细胞株对得到的单克隆细胞株进行鉴定，确认其是否稳定地表达目标基因或蛋白质。
常用的鉴定方法有Western blot、荧光定量PCR等。
7. 扩大培养经过鉴定的稳定细胞株可以进一步扩大培养，得到足够数量的细胞供后续实验使用。
在扩大培养过程中，需要注意细胞的培养条件、培养基的配方等。
8. 长期保存为了保证稳定细胞株的长期保存，可以采取冻存的方法。
将稳定细胞株冻存于液氮中，以备将来使用。
稳转细胞系构建简单原理_概述说明以及解释
稳转细胞系构建简单原理概述说明以及解释1. 引言1.1 概述在细胞生物学和遗传学领域，稳转细胞系构建是一项重要的技术，用于研究基因表达、蛋白质功能以及疾病的发生机制等。
稳转细胞系构建是指将外源基因或RNA序列引入目标细胞系中，并使其表达并稳定地传递给后代细胞。
这项技术为科学家们提供了一个探索和理解生命活动的重要工具。
1.2 文章结构本文将分为五个部分进行阐述。
首先，在引言部分对稳转细胞系构建进行概述和解释，介绍文章主要内容。
第二部分将详细介绍稳转细胞系构建的基本概念以及常用的方法。
接着，第三和第四部分将侧重于讨论关键要点一和关键要点二，并解释其原理、提供示例或案例分析，并对应用场景进行分析。
最后，在结论与展望部分，将对已述内容进行总结，并提出对未来发展的展望或建议。
1.3 目的本文的目的是向读者介绍稳转细胞系构建的简单原理，包括基本概念、构建方法和原理解释。
同时，通过讨论关键要点一和关键要点二的实例和案例分析，以及对其应用场景的分析，帮助读者更好地理解该技术在科学研究中的意义与应用。
通过本文的阅读，读者将能够对稳转细胞系构建有一个全面且清晰的认识，并为未来相关研究提供参考依据。
2. 稳转细胞系构建简单原理2.1 基本概念解释稳转细胞系是指通过基因转染或基因编辑技术，使得一种细胞在经过多代分裂之后，其特定基因的表达能够被持续稳定地维持。
这样的细胞系在科学研究和生物制药领域中具有重要的应用价值。
2.2 稳转细胞系构建方法构建稳转细胞系的方法主要包括基因转染、基因编辑和选择标记等步骤。
a) 基因转染：常见的基因转染方法包括质粒DNA介导的转染、病毒载体介导的转染以及利用脂质体或者聚合物等载体传递外源基因到目标细胞中。
b) 基因编辑：目前常用的基因编辑技术为CRISPR-Cas9系统，通过引入Cas9核酸酶和相应的寻找序列（sgRNA），实现对目标基因组进行特异性剪切、插入或敲除等修饰。
这种方法可以直接修改目标细胞内特定基因座位，从而实现特定功能蛋白的表达。
稳定细胞株的构建流程
稳定细胞株的构建流程以稳定细胞株的构建流程为标题，写一篇文章。
一、引言稳定细胞株的构建是生物学研究中常用的实验技术之一。
通过构建稳定细胞株，可以使目标基因在细胞中稳定表达，从而对其功能进行深入研究。
本文将介绍稳定细胞株的构建流程。
二、选择适当的宿主细胞稳定细胞株的构建首先需要选择适当的宿主细胞，常用的细胞包括人类胚胎肾细胞293细胞、小鼠骨髓细胞NIH3T3细胞等。
选择宿主细胞时需要考虑其易于转染、高细胞增殖率和细胞稳定性等因素。
三、构建载体1.选择适当的表达载体：常用的表达载体有质粒和病毒载体，根据实验需要选择合适的载体。
质粒载体便于操作和大规模扩增，而病毒载体能够高效地转染细胞。
2.插入目标基因：将目标基因插入表达载体中，可以通过PCR扩增得到目标基因片段，并使用限制酶切将其与表达载体连接。
连接后进行酶切鉴定和测序验证。
3.构建转染载体：将表达载体转化至适当的细菌宿主中，利用细菌的复制机制进行扩增。
扩增后提取纯化质粒。
四、转染宿主细胞1.选择合适的转染方法：常见的转染方法有化学法、电穿孔法和病毒转染法等。
根据宿主细胞的特性和实验要求选择最适合的转染方法。
2.优化转染条件：转染条件的优化对于获得高转染效率和稳定性的细胞株至关重要。
可以调整转染剂的浓度、时间和转染温度等因素。
3.筛选转染细胞：在转染后，使用适当的筛选压力，如抗生素选择、荧光标记等，筛选出转染成功的细胞。
五、稳定细胞株的筛选和鉴定1.单克隆细胞的筛选：通过稀释法将转染细胞稀释至单个细胞，然后培养形成单克隆细胞株。
2.目标基因表达的鉴定：通过Western blot、RT-qPCR等方法对目标基因的表达进行检测，确认稳定细胞株中目标基因的稳定表达。
3.稳定性的验证：长期培养稳定细胞株，观察目标基因的表达是否稳定，并进行细胞传代实验，验证细胞株的稳定性。
六、应用稳定细胞株稳定细胞株的构建完成后，可以用于进一步的实验研究，如基因功能研究、药物筛选和蛋白质表达等。
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稳定转染细胞株的制备
带质粒的大肠杆菌的激活和扩增
（1）取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻，或者放置37℃恒温水中约 2min,待冰完全融解即可使用。
（2）LB 培养基的制备按照如下配方配制
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L
氯化钠(NaCl) 10g/L
用 NaOH 调节该培养基的 pH,使其达到 7.4，高温高压灭菌后室温保存，使用时加入氨苄青霉素(浓度为 0.1mg/ml)
（3）LB 固体培养基的制备到 200mlLB 液体培养基加入 3g 琼脂混匀后高温高压灭菌，待冷却至约55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀，分别倒入 6-7 个培养皿中，用封口膜封边，并倒置放于4℃保存。
（4）扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到 LB 固体培养基上，待凉干后，用封口膜将培养皿封闭，然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃)，根据情况可适当延长培养时间。
观察培养基上的单克隆工程菌，待长出后，用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到 10mlLB 液体培养基中，放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜，第二天观察，待 LB 液体培养基变浑浊后，4℃ 冰箱保存，以待进行下一步质粒的提取。
质粒的提取
准备质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液
（1）取 75ml 扩增变浑浊的 LB 液体培养基置于试管中。
（2）5,000×g 离心 10 分钟，弃去上清液，将试管倒置在滤纸上空干。
（3）取出质粒提取盒，用 3ml 细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。
（4）加入 3ml 细胞裂解液，轻轻摇晃试管混匀，室温下孵育 3 分钟，产生白色絮状沉淀，然后加入 5ml 中和液混匀
（5）将 Clearing Column(兰色)放入一新的 50ml 离心管，将上述试管中裂解后的液体倒入兰管，孵育 2 分钟，1500×g 离心 5 分钟，效果不佳的话可再离心一次，离心液待用。
（6）将 Binding Column(白色)放入一新的 50ml 离心管，取上述离心液倒入白管，1500×g 离心 3 分钟，弃去离心液。
（7）在白管中加入 5ml 内毒素清洗液(需加异丙醇)，1500×g 离心 3 分钟，弃去离心液，在白管中再加 20ml 柱洗液(含有乙醇)，1500×g 离心 5 分钟，弃去离心液后，继续1500×g 离心 10 分钟，以保证彻底除去乙醇。
（8）取出白管，在滤纸上轻敲白管顶端的尖嘴，以保证去除试管中的乙醇，并用滤纸擦去白管外壁上的乙醇。
（9）把白管放入一个新的 50ml 离心管中，加入 600μl 无核酸酶的水(要把水加到白管中的 DNA 结合膜上),然后 1500-2000×g 离心 5 分钟
（10）收集离心管中的滤液，并转到 1.5mlEP 管中，密封，-20℃保存。
提取质粒的 DNA 电泳鉴定
（1）制胶取 0.15g 琼脂糖，15ml 1×TAE 混匀，微波炉加热 20 分钟，使之熔化，待自然冷却 60-70℃ 时，加入 0.25μl EB,轻轻混匀。
（2）将冷却至约60℃ 的凝胶倒入准备好的胶床内，厚度约 5mm,室温静置 1h,待胶固化后，置于电泳槽中，样品端位于负极。
（3）倒入1×TAE 缓冲液，覆盖住胶面，拔起梳子
（4）在样品中按 1：6 体积比加入上样缓冲液，混匀。
（5）在加样孔中分别加入 Marker 和样品。
（6）盖上电泳槽，通上电，电压 80v,时间约 20-25min,开始电泳。
（7）电泳结束，取出凝胶，照相后观察。
提取质粒后浓度的测定
（1）取 EP 管，标上记号。
（2）其中一个加双重蒸馏水 80μl，其余加样品 80μl(样品按:提取质粒 2μl ，双重蒸馏水 78μl 混匀而成).
（3）用核酸计算器测定，并记录结果。
（4）经测定，PCI-neo-PDCD 重组质粒的浓度为 764ng/μl, PCI-neo-空质粒的浓度为 524 ng/μl.
稳定转染细胞株的筛选
（1）G418 配制取 1g G418,加入 10mlPBS 溶液，浓度为 100mg/ml,完全溶解后，过滤分装到 1mlEP 管中，密封，-20℃保存。
（2）浓度梯度试验确定 G418 的最佳筛选浓度用培养基把 G418 稀释成 100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/mll、700μg/ml、 800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml不同筛选浓度。
选对数期DU145 细胞消化后稀释成1000-2000cell/ml 细胞悬液，铺 24 孔板，每孔 1ml ，过夜使之贴壁，然后换液，换成含不同浓度 G418 的培养基，培养 10-14 天，每 3 天换一次液，在筛选 10～14 天内能够杀死所有细胞的最小 G418 浓度即为最佳筛选浓度，筛选时比该浓度再高一个级别，维持培养时使用筛选浓度的一半
（3）细胞转染。
取对数期前列腺癌 DU145 细胞，消化后用无双抗 10％血清培养液制成细胞悬液(2000cell/ml)，接种到 35mm 培养皿中过夜，培养到 70% 汇合率，进行转染。
取出培养皿，吸去培养皿中的培养液，并每皿加入 RPMI 1640 培养液约 0.5ml 重复冲洗细胞两遍，而后每皿加入 RPMI 1640 培养液 1.5ml, 转染复合物混合液 0.5ml. 轻轻混匀，放入37℃， 5％CO2 孵育箱中培养 6 h 左右，进行换液，换成含 10%血清的普通培养基，在37℃，5％CO2 孵育箱中继续培养 24h 左右.
转染复合物的制取：
250μl 无血清培养基 OPTI-MEM + 5μl Lipofectamine 2000（混合 5min）
250μl 无血清培养基 OPTI-MEM +1.9μl 空质粒（混合 5min）
上述二者混合后，室温静置 20min，即为空质粒的转染复合物。
250μl 无血清培养基 OPTI-MEM + 5μl Lipofectamine 2000（混合 5min）
250μl 无血清培养基 OPTI-MEM +1.31μl PDCD5 重组质粒（混合 5min）
上述二者混合后，室温静置 20min，即为 PDCD5 重组质粒的转染复合物。
注: 转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。
（4）稳定转染细胞株的筛选
从37℃，5％CO2 孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用 PBS 冲洗细胞 2 遍，胰蛋白酶消化，接种 1/2 的细胞到 100 mm 培养皿中，加入含 500 μg/ml G418 的新鲜培养基，每 2-3 天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。
当正常细胞完全死亡后，换用新的不含 G418 的培养基培养。
每天观察细胞生长状态。
在细胞达到60%汇合率时再用含 500 μg/ml G418 的培养基筛选一次。
当细胞达到 90%以上汇合率时将细胞转移至培养瓶中继续培养（转染后 10-12 天左右）以后每隔 4-5 天再用含 500 μg/ml G418 的培养基筛选。
直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样
品（约转染后 15 天左右）。
以后继续培养时加入的 G418 浓度降一半。
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