重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选
重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选
重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选作者：徐腾飞, 张文卿, 于红, 李丹【摘要】目的: 构建人表皮生长因子受体（HER2）胞外区（1 896 bp）基因的真核表达质粒（pcDNA6/v5his HER2）, 转染小鼠乳腺癌细胞（EMT6）, 获得其稳定表达细胞株(EMT6/ HER2)。
方法: 用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列; 经酶切、连接构建pcDNA6/v5his HER2; 转化大肠杆菌DH5α, 筛选阳性克隆, 对其进行酶切及测序鉴定; 以PEI法将pcDNA6/v5his HER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞, 经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选1～2周, 获得抗性克隆EMT6/HER2; 用RT PCR检测EMT6/HER2中HER2 mRNA, 免疫组化法检测其HER2蛋白的表达。
结果: PCR产物与预期片段大小一致; pcDNA6/v5his HER2经酶切、琼脂糖凝胶电泳后, 可见与PCR产物大小相同的片段; DNA测序结果显示, pcDNA6/v5his HER2 中HER2 基因序列无误, 读码框正确; 用RT PCR可在EMT6/HER2中检测到HER2 mRNA, 免疫组化法证实, EMT6/HER2中有HER2的阳性信号。
结论: 成功地构建了HER2胞外区真核表达载体, 获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株, 为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础。
【关键词】HER2; 真核表达; 转染［Abstract］AIM: To construct an eukaryotic vector encoding extracellular domain of human epidermal growth factor receptors (HER2), pcDNA6/v5his HER2, and to screen HER2 positive clones from mouse breast cancer cell line EMT6. METHODS: The extracellular domain of HER2 was amplified from pcDNA3.1HER2 by PCR. pcDNA6/v5 his HER2 was prepared by inserting the fragment into the plasmid pcDNA6/v5his. Then the recombinant vector was identified by restriction enzyme and sequencing. Next, pcDNA6/v5his HER2 was transfected into the EMT6 cell line and the positive clones (EMT6/HER2) were screened with blasticidin. Finally, the expression of HER2 in EMT6/HER2 was detected by RT PCR and immunohistochemistry. RESULTS: The fragment of HER2 was amplified and pcDNA6/v5his HER2 was prepared successfully. No errors were found both in the sequence and ORF of the acquired fragment. The expected fragment of HER2 (1896 bp) was amplified from EMT6/HER2 by RT PCR and positive signals of HER2 were detected in EMT6/HER2 by immunohistochemistry. CONCLUSION: An eukaryotic plasmid encoding HER2 (pcDNA6/v5 his HER2) has been constructed and a cell line expressing HER2 stably has been prepared successfully.［Keywords］HER2 ; eukaryotic expression; transfection人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptors, HER2)属于表皮细胞生长因子受体(EGFR)家族成员, 是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的单链跨膜糖蛋白, 相对分子质量(Mr)为185 000。
tTS真核表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系的建立
tTS真核表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系的建立帅丽芳;赵勇;张若霜;银涛;唐博恒【摘要】为了构建tTS真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系,采用PCR方法,以质粒pTet-tTS为模板扩增tTS基因的编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pApoE-rtTA-Neo,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用RT-PCR、Western blot法检年测tTS的表达,成功构建了pApoE-rtTA-tTS-Neo真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的基因.真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究tTS 的功能奠定良好的实验基础.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(030)004【总页数】4页(P336-339)【关键词】tTS;基因表达;真核表达载体;HepG2细胞系【作者】帅丽芳;赵勇;张若霜;银涛;唐博恒【作者单位】广州军区疾病预防控制中心,广东,广州,510507;中山大学,实验动物中心,广东,广州,510080;中山大学,实验动物中心,广东,广州,510080;广州军区疾病预防控制中心,广东,广州,510507;广州军区疾病预防控制中心,广东,广州,510507【正文语种】中文【中图分类】Q785动物模型研究是疾病研究中的重要手段,合适的动物模型对于人类疾病的研究意义尤其重大。
但是由于转基因技术是一种基因全表达或不表达的技术,基因表达常不局限在一个器官,一个组织,简单的转基因技术无法回答基因功能的细节问题。
此外,转基因动物转入的外源基因常常由于某些基因表达产物使细胞或胚胎不耐受,从而妨碍了转基因动物的建立。
故目的基因表达在时序和水平上的有效调控,将有益于基因功能的研究、动物模型发育期间基因表达的分析以及基因治疗过程中基因的运载。
重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响
重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响目的构建针对慢性粒细胞白血病bcr-abl b3a2型mRNA的双表达逆转录病毒载体,初步探讨其对K562细胞表型的影响.方法以逆转录病毒载体pMSCV-neo为骨架,构建eGFP及针对bcr-abl b3a2型mRNA的反义RNA双表达载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40AS,同时构建对照载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40S和pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL80AS,酶切及测序鉴定各重组载体;以脂质体法转染各载体到PT67包装细胞后,G418筛选稳定的病毒产生细胞株,再以NIH3T3细胞测定病毒滴度并感染K562细胞,计数细胞数绘制细胞生长曲线,FCM检测细胞凋亡情况、并用Western blot检测PKR激活情况.结果酶切及测序结果证实各重组载体构建完全正确;G418筛选到高滴度重组逆转录病毒生产细胞株:PT67-MSCV/GFP、PT67-40as、PT67-40s和PT67-80as,且PT67-40as上清感染组K562细胞生长受抑制,其24 h 时早期细胞凋亡率为22.54±3.19%,与除PT67-80as组外的其余各组相比有显著差异(P＜0.05);PT67-40as和PT67-80as处理组细胞PKR 磷酸化水平分别增高了59.20%和60.33%,2AP能抑制PT67-40as的作用.结论成功构建重组逆转录病毒双表达载体,并发现其能抑制K562细胞生长并引起细胞凋亡,通过激活PKR抗肿瘤可望成为肿瘤新的靶向治疗策略.作者：曾建明冯文莉王小中赵世巧白卫君罗云萍温健萍涂植光黄宗干 ZENG Jian-ming FENG Wen-li WANG Xiao-zhong ZHAO Shi-qiao BAI Wei-jun LUO Yun-ping WEN Jian-ping TU Zhi-guang HUANG Zong-gan 作者单位：曾建明,冯文莉,王小中,赵世巧,白卫君,罗云萍,ZENG Jian-ming,FENG Wen-li,WANG Xiao-zhong,ZHAO Shi-qiao,BAI Wei-jun,LUO Yun-ping(重庆医科大学临床血液学教研室,临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室,重庆,400016)温健萍,WEN Jian-ping(Canadian Blood Services,Hamilton,ON L8S 1H8 Canada)涂植光,TU Zhi-guang(重庆医科大学临床生物化学教研室,重庆,400016)黄宗干,HUANG Zong-gan(重庆医科大学临床学院血液科,重庆,400016)刊名：第三军医大学学报ISTIC PKU英文刊名：ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE 年，卷(期)：2006 28(21) 分类号：Q782 R329.28 R733.722 关键词：慢性粒细胞白血病 PKR 反义RNA 逆转录病毒载体基因克隆。
HER2基因真核表达载体的构建及其抑瘤效应研究
HER2基因真核表达载体的构建及其抑瘤效应研究贺丽清张存李维娜张路张英起(第四军医大学生物技术中心，陕西西安710033)【摘要】目的构建HER2基因真核表达载体，研究其对肿瘤生长的抑制作用。
方法通过RT-PCR方法从HER-2+SKBR3细胞株中获得HER-2基因胞外段编码区cDNA，构建pRC-CMV-信号肽-hHER2-ECD真核载体，于大肠杆菌DH5α中进行扩增；用获得的质粒免疫小鼠，ELISA法和ELISPOT法分别检测体液及细胞免疫情况，然后用EMT-6细胞接种肿瘤，观察肿瘤生长情况。
结果构建的pRC-CMV-信号肽-hHER2-ECD真核载体经酶切和DNA测序分析，结果表明该基因的序列与设计的序列完全相同。
pRC-CMV-信号肽-HER2真核表达质粒转染细胞后，目的基因在mRNA水平的表达与预期结果一致。
获得的质粒能够引起较低的体液免疫，但其可诱导较高的T细胞反应，并且可明显降低小鼠成瘤率。
结论构建的HER2基因真核表达载体可在细胞中表达且对小鼠实体瘤的生长具有一定的抑制作用。
【关键词】真核表达载体HER2转染肿瘤Construction and antitumor effect of HER2 DNA eukaryotic expression vector He li-qing Zhang cun（The department of biotechnology center，The Fourth Military MedicalUniversity，Xi’an 710033，China）【Abstract】AIM: To construct an eukaryotic expressing vector of HER2 and investigate the inhibitory effect on the growth of tumor by the expression of the plasmid in vivo．．Methods：The cDNA of HER2 extracellular domain was prepared through RT-PCR from HER-2+SKBR cell line, then it was cloned into pRC-CMV vector and DH5α,the immunocompetence of the plasmid was study by ELISA and ELISPOT. Incubated mice with EMT-6 and the tumor growth was observed. RESULTS: DNA sequencing and restriction enzyme digestion proved that HER-2 gene was correctly connected.After transfection with plasmid pRC-CMV-signal peptide-HER2,293 cells could produce HER2 mRNA. The plasmid can induce low immune but high T cell response and it can restrain the growth of tumor obviously. CONCLUSION: P1asmid can express in cells,The plasmid Can inhibit the growth of solid tumor．【Key words】eukaryotic expressing vector ; HER-2; transfection; tumorHER2/neu基因编码分子量为185kDa的受体酪氨酸激酶HER2/neu蛋白，它与细胞恶性转化有关，是癌症病因学中的一种生物学相关蛋白。
PCV2真核表达载体的构建及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达
PCV2真核表达载体的构建及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2, PCV2）作为一种病毒感染引起的猪病，给养猪业造成了重大损失。
为了进一步探究PCV2的致病机制及开展疫苗研发，需要构建PCV2的真核表达载体，并在哺乳动物体内表达，以模拟自然感染状况。
一、PCV2真核表达载体的构建1.1 PCV2基因组的测序和分析起首对PCV2的基因组进行测序和分析，确定其中的开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）和调控序列。
通过该基因组信息，设计并合成了PCV2 Cap的全长基因。
Cap基因是编码PCV2的结构蛋白的基因，对病毒的感染和复制起着重要作用。
1.2 载体的选择与构建为了在哺乳动物细胞中表达PCV2的Cap基因，需要选择合适的真核表达载体。
依据需要，选择了pCDNA3.1(+)作为基本载体。
将合成的PCV2 Cap基因与pCDNA3.1(+)载体进行酶切后，接受毗连酶的作用将两者毗连起来，并通过转化大肠杆菌获得重组质粒。
通过测序确认质粒重组成功，得到了PCV2真核表达载体。
1.3 转染与表达：将PCV2真核表达载体转染到奶山羊胎儿成纤维细胞中，利用Western blot和实时荧光定量PCR检测Cap蛋白或Cap mRNA 的表达状况。
结果显示，Cap蛋白和Cap mRNA的表达量在转染24小时后逐渐增加。
二、奶山羊胎儿成纤维细胞中表达PCV2的意义2.1 模拟真实感染通过在奶山羊胎儿成纤维细胞中表达PCV2，可以模拟自然感染的过程，更好地理解PCV2对细胞的感染和复制机制。
2.2 探究PCV2致病性机制通过观察PCV2在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达状况，可以揭示PCV2感染的潜在机制，例如病毒如何进入细胞、如何复制等，为进一步阐明其致病性机制提供线索。
2.3 疫苗研发的依据奶山羊胎儿成纤维细胞中表达PCV2不仅可以探究病毒感染机制，也为疫苗研发提供了依据。
突变型DNA聚合酶β真核表达载体的构建及其表达
突变型DNA聚合酶β真核表达载体的构建及其表达赵四敏;陈旭东;赵国强;董子明【摘要】Objective To construct mutant polβeukaryotic expression vector and to transfect it into EC9706 cell of polβ gene targeting. Methods To design a primer pair (primer 1/ primer 2) for amplifying polβ,the gene containing BamH I and Apa I was amplified by PCR, then was coloned into T-vector. Recombinant was identified by PCR and by DNA sequencing. After that,it was sub-cloned into pcDNA4-C plasmid. The eukaryotic expressing vector pcDNA4-C-polβ was obtained. It w as transfected into EC9706 cells of pol (3 gene targeting. The EC9706 cell lasting transfected with pcDNA4-C-pol β was obtained by G-418 screening. Results The eukaryotic expressing vector pcDNA4-C-polβ was obtained by PCR and sequencing, polβ protion was obtained from EC9706 cells which were screened by HislinkTM protion purification system,the result was identified by SDS-PAGE. Conclusion Mutant polβeukaryotic expression vector pcDNA4-C-polβ is successfully constructed and polβprotion is purified, which l ays a solid foundation for further studying polβfunction.%目的构建含食管癌突变型DNA聚合酶β基因(DNA polymerase β,polβ)的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,使其在polβ基因敲除的EC9706细胞中表达.方法根据食管癌突变型polβ基因序列,设计并合成一对特异性引物(引物1、引物2),通过PCR扩增获得含BamHⅠ和ApaⅠ的基因序列,将其克隆入T载体,PCR及测序鉴定无误后,将其插入真核表达载体pcDNA4-C,从而构建了含突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ.将重组质粒以脂质体包裹的方式转染入polβ基因敲除的EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.结果经过PCR筛选及 DNA测序鉴定,证实真核表达载体pcDNA4-C-polβ构建成功.筛选后的EC 9706细胞经HislinkTM蛋白纯化试剂盒纯化,仅在39 kD位置有一条带,证明蛋白表达及纯化成功.结论成功构建了食管癌突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,并纯化出polβ蛋白,为进一步研究polβ的功能奠定坚实的基础.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2012(041)017【总页数】3页(P1716-1718)【关键词】突变型DNA聚合酶β;pcDNA4-C真核表达载体;EC 9706细胞【作者】赵四敏;陈旭东;赵国强;董子明【作者单位】漯河医学高等专科学校,病理生理学教研室,河南漯河,462002;漯河医学高等专科学校,微生物学与免疫学教研室,河南漯河,462002;郑州大学基础医学院,微生物学与免疫学教研室,郑州,450001;郑州大学基础医学院,病理生理学教研室,郑州,450001【正文语种】中文DNA 聚合酶β（DNA polymeraseβ，polβ）是真核细胞DNA聚合酶家族的一员，为一看家基因，基因全长35kb，位于第8号染色体近着丝点处，有14个外显子及13个内含子，转录1.4kb mRNA，其启动子位于主要转录起始点的上游115bp内［1］。
重组人IL-12真核表达载体稳定转染EMT6细胞株及表达鉴定
【 ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊｃ ｖ Ｔ ｓ ｂ ｓ ａ ｄ ｄｎ ｆ Ｉ 一 ２ ｔ ｌｔ ｓ ｃ ｄ ｅ ｎ Ｍ ６ Ｉ 一１、 ｔｏｓ ｅｏ ｂ ａｔ ｕ ａ ｏ ｅ ｌ ｍ ｄ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂ ｔ ｅ ｏ ｔ ｌｈ ｎ ｅｔ １ ａ ｙ ｒ ｆ ｔ ｌ ｉ Ｅ Ｔ ／Ｌ ２ Ｍｅ ｄ Ｒ ｃ ｉ ｋｒ ｔ ａ ｉ ｅｉ ｅａ ｉ ｉ ｉ Ｌ ｙ ｓ ｂ ａ ｅ ｅ ｃ ｌ ｅ ｎ ｌ ｈ ｍ ｎ ｅ ｙ ｉｐ ｓ ｎ
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临床和实验 区学杂 志
２０ ０ ８年 ４月 弟７卷 弟４期
・ｌ ・ ９
重组人 Ｉ Ｌ一１ ２真 核 表 达 载体 稳 定 转 染 Ｅ ６细 胞 株 ＭＴ
及 表 达 鉴 定
李 丹 张文 卿 于红 吕锐 徐 腾 飞 ２６７ ） ６０ １
人 Ｉ ２基 因在 小鼠乳腺癌细胞 系中的稳定转 染为进 一步研 究 Ｌ一１
人Ｉ Ｌ一１ 肿 瘤 的 分 子 机 制 及 潜 在 的 应 用奠 定 了基 础 。 ２抗
基 因表达
Ｉ ｅ ｔ ｉａ ｏ ｆｔ ａ ｓ ｅ ｔ ｎ ａ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ｏ ｕ ａ ｅ ｋ ｒ ｏ ｉ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ｖ ｃ ｏｒ Ｉ 一 １ ｄ ｆ ｄ ｃ ｌ ｌ ｅ ＥＭ Ｔ６ ． Ｉ Ｄａ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔ ｎ ｏ ｒ ｎ ｆ ｃ ｉ ｎｄ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｆ ｈ ｍ ｎ ｕ ａ ｙ ｔｃ ｅ ｐ ｅ ｓ ｏ ｅ ｔ Ｌ ｆ ｉ ｏ ２ ｍｏ ｉｉ ｅｌ ｉ ｅ ｎ Ｌ ｎ，ＺＨＡ ＮＧ
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重组HBsAg真核表达载体的构建及其稳定转染H22细胞的筛选
Ｋ ｅ ｒ ｓ： ｙ ｗｏ ｄ ＨＢｓ Ａｇ； ｕ ｅ ｈ ｐ ｔ ａ ｃ ｒｃ ｌ；ｒ ｓｅ ｔｏ ｍｏ ｓ ｅ ａｉ ｃ ｎ ｅ ｅｌ ｔｍ￣ｆｅｉｎ ｃ
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基 金 项 目： 林 大 学 研 究 生创 新 基 Байду номын сангаас 资 助 项 目（０９０ １ 吉 ２０ １３ ） ＊通讯 作 者
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（ 稿 日期 ：００—０ —１ ） 收 ２１ ３ ６
文章 编 号 ： ０ ４ ８ （０ １０ —０ １ —０ １ ７— ２ ７２ １）１ ０４ ３ ０
Ｐ Ｒ［］吉林 大学学报 （ Ｃ Ｊ． 医学版 ）２０ ，０ ５ ： １． ，０４ ３ （）７３
［］ ６ 温进 坤 ， 郭 庆， 韩 梅 ， ． 组 人 Ｅ Ｏ 真 核 表 达 质 粒 在 大 鼠骨 等 重 Ｐ
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重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选作者：徐腾飞, 张文卿, 于红, 李丹【摘要】目的: 构建人表皮生长因子受体（HER2）胞外区（1 896 bp）基因的真核表达质粒（pcDNA6/v5his HER2）, 转染小鼠乳腺癌细胞（EMT6）, 获得其稳定表达细胞株(EMT6/ HER2)。
方法: 用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列; 经酶切、连接构建pcDNA6/v5his HER2; 转化大肠杆菌DH5α, 筛选阳性克隆, 对其进行酶切及测序鉴定; 以PEI法将pcDNA6/v5his HER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞, 经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选1～2周, 获得抗性克隆EMT6/HER2; 用RT PCR检测EMT6/HER2中HER2 mRNA, 免疫组化法检测其HER2蛋白的表达。
结果: PCR产物与预期片段大小一致; pcDNA6/v5his HER2经酶切、琼脂糖凝胶电泳后, 可见与PCR产物大小相同的片段; DNA测序结果显示, pcDNA6/v5his HER2 中HER2 基因序列无误, 读码框正确; 用RT PCR可在EMT6/HER2中检测到HER2 mRNA, 免疫组化法证实, EMT6/HER2中有HER2的阳性信号。
结论: 成功地构建了HER2胞外区真核表达载体, 获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株, 为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础。
【关键词】HER2; 真核表达; 转染［Abstract］AIM: To construct an eukaryotic vector encoding extracellular domain of human epidermal growth factor receptors (HER2), pcDNA6/v5his HER2, and to screen HER2 positive clones from mouse breast cancer cell line EMT6. METHODS: The extracellular domain of HER2 was amplified from pcDNA3.1HER2 by PCR. pcDNA6/v5 his HER2 was prepared by inserting the fragment into the plasmid pcDNA6/v5his. Then the recombinant vector was identified by restriction enzyme and sequencing. Next, pcDNA6/v5his HER2 was transfected into the EMT6 cell line and the positive clones (EMT6/HER2) were screened with blasticidin. Finally, the expression of HER2 in EMT6/HER2 was detected by RT PCR and immunohistochemistry. RESULTS: The fragment of HER2 was amplified and pcDNA6/v5his HER2 was prepared successfully. No errors were found both in the sequence and ORF of the acquired fragment. The expected fragment of HER2 (1896 bp) was amplified from EMT6/HER2 by RT PCR and positive signals of HER2 were detected in EMT6/HER2 by immunohistochemistry. CONCLUSION: An eukaryotic plasmid encoding HER2 (pcDNA6/v5 his HER2) has been constructed and a cell line expressing HER2 stably has been prepared successfully.［Keywords］HER2 ; eukaryotic expression; transfection人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptors, HER2)属于表皮细胞生长因子受体(EGFR)家族成员, 是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的单链跨膜糖蛋白, 相对分子质量(Mr)为185 000。
HER2作为跨膜蛋白, 由胞外结构域(ECD)、跨膜结构域和胞内结构域(ICD)三部分组成。
ECD主要是由两个配体结合区(RLD) 与两个富含半胱氨酸区构成［1］。
HER2 RLD可与EGFR受体家族的其他成员及配体形成复合物, 参与细胞增殖信号的转导［2］。
HER2 基因主要是在人体的胚胎发育时期表达, 它参与多种组织器官的生长发育, 而在成人正常组织中此基因常以单拷贝存在, 表达水平较低; 研究表明, HER2 基因异常扩增或过表达与多种肿瘤的发生、发展及预后有密切相关, 其中以乳腺癌最为密切, 已成为乳腺癌复发、患者生存期判断的一个独立指标［3］。
研究显示, HER2 ECD阳性乳腺癌患者对内分泌治疗及化疗的反应性降低、预后差、肿瘤呈进行性生长、总生存和无疾病生存期短及肿瘤复发率高［4］。
因此, 构建重组HER2表达载体并获得稳定转染乳腺癌细胞株可为深入研究HER2基因过表达与乳腺癌的关系及其基因治疗奠定基础。
由于全长HER2 基因有导致正常细胞转化的潜在风险, 而且, 其胞内区具有激酶活性的结构域与其他激酶有较高的同源性［5］。
因此, 本研究我们选取HER2 的ECD构建真核表达质粒（pcDNA6/v5 his HER2）; 将其转入HER2阴性的小鼠乳腺癌细胞(EMT6)中, 以获得稳定表达HER2 ECD的EMT6细胞株（EMT6/HER2）。
1 材料和方法1.1 材料带有HER2全长基因的重组质粒（pcDNA3.1HER2）由北京医药技术研究所林亚军博士惠赠; EMT6细胞购自第四军医大学实验动物研究中心。
PCR试剂购自上海生工公司; 质粒pcDNA6/v5 his、TRIzol 及杀稻瘟菌素(Blasticidin)购自Invitrogen公司; AMV反转录酶购自Promega公司; DL 2 000 DNA marker购自TaKaRa; T4 DNA 连接酶、Hind Ⅲ和Nhe Ⅰ内切酶购自Fermentas。
质粒小提试剂盒购自TIANGEN; RPMI1640完全培养基购自Gbico公司; 胎牛血清购自杭州四季青; 胰酶购自Amersco; 多聚乙烯酰胺(PEI)购自Sigma公司; HER2检测免疫组化广谱试剂盒购自迈新生物技术公司。
1.2 方法1.2.1 HER2 ECD基因的扩增以GenBank中NM_004448的ORIGIN为参考序列设计引物, 引物序列上游: 5′ctaaccatggagctggcggccttgt3′（起自第237 bp）, 下游: 5′ccatcaactgcacccacggg3′(第2 133 bp终止), 上下游引物5′端分别加入Hind Ⅲ和NheⅠ酶切位点。
拟扩增的HER2胞外区长度为1 896 bp, 加酶切位点后产物总长度为1 914 bp。
以pcDNA3.1 HER2为模板进行PCR扩增。
反应循环参数: 94℃5 min, 94℃1 min, 62℃1 min, 72℃1 min, 30个循环, 72℃延伸10 min。
1.2.2 pcDNA6/v5his HER2的构建回收并纯化PCR 产物; 用Nhe I和Hind Ⅲ分别对PCR产物、pcDNA6/v5his进行双酶切、纯化; T4 DNA连接酶16℃水浴过夜连接; 连接产物转化DH5α感受态细菌, 并于含50 mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基37℃培养过夜; 挑取阳性克隆, 扩大培养, 按质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒; 用PCR、双酶切对重组质粒进行鉴定无误后, 送TaKaRa公司测序。
1.2.3 pcDNA6/v5hisHER2转染EMT6细胞分别以pcDNA6/v5his HER2（实验组）及pcDNA6/v5 his（空质粒对照组）用PEI法转染EMT6细胞, 以未转染正常EMT6细胞作为空白组。
转染方法参照文献［6］进行。
1.2.4 EMT6细胞中HER2 mRNA的检测用TRIzol RNA提取试剂盒, 分别提取正常EMT6、对照组和实验组抗性细胞中的总RNA, 溶于DEPC水。
用HER2 ECD的上下游引物进行PCR扩增。
扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.5 HER2在EMT6中表达产物检测(1)细胞爬片制备: 用胰酶消化抗性克隆细胞, 将无菌洁净的盖玻片放入培养瓶中, 加入适量培养液, 待细胞达90%汇合时, 取出盖玻片; 用100 g/L甲醛固定30 min, 置-20℃保存。
(2)用免疫组化方法检测细胞中HER2基因的表达, 具体参照试剂盒说明书。
2 结果2.1 HER2胞外区基因的PCR扩增以pcDNA3.1HER2为模板, 用PCR扩增HER2 ECD基因, 琼脂糖凝胶电泳结果显示, PCR产物为长度为1 896 bp, 与预期PCR产物大小一致（图1）。
2.2 pcDNA6/v5his HER2 的鉴定pcDNA6/v5his HER2转化DH5α宿主菌后获得大量阳性克隆, 分别用菌液PCR、双酶切及测序对重组克隆进行鉴定。
(1)随机挑取8个菌落于ALB液体培养中扩增; 做菌液PCR初步鉴定, 获得预期的结果（图2）。
(2)将阳性菌落扩增后行质粒小提, 用Hind Ⅲ和NheⅠ进行双酶切, 电泳结果显示, 标本1切出与PCR产物大小一致的片段（3、5可能为不完全酶切, 图3）。
⑶标本1送TaKaRa公司测序, 结果显示pcDNA6/v5his HER2 中HER2 基因序列无误, 读码框正确。
2.3 质粒转染和克隆筛选转染细胞经Blasticidin (终浓度为10 mg/L)持续筛选10 d后可观察到单克隆形成, 再以含维持量的Blasticidin(终浓度为2 mg/L)培养液进行克隆扩增, 得到EMT6/HER2（实验组）和EMT6/pcDNA6/v5 his(对照组）两种细胞株。