原核表达载体的构建

合集下载

β-synuclein蛋白原核表达载体的构建与表达

的蛋白的表达。结果
Ｒ —ＣＴＰＲ扩增出人８ｓｎｃｉ因，其亚克隆至ｐＥ－Ｐ１建成重组表达质粒，在．ｕｌｎ基ｙｅ将ＧＸ６．构并成功构建人３ｓｎｅｉ原核表达载体，在大肠杆菌中表达了人１－ｕｌｎ的ｙｅ并３－
中提取总ＲＡ，Ｒ —ＣＮ用ＴＰＲ方法获得人１ｓｎｃｉ因，隆至ｐＵ．３ｙｕｌｎ基－ｅ克ＣｍＴ载体中，ＣＰＲ筛选阳性克隆并测序。将酶
切后的目的片段克隆至原核表达载体ｐＥ－Ｐ１中，化大肠杆菌Ｂ２。ＩＴＧＸ６一转Ｌ１ＰＧ诱导后，ＳＳＰＧ电泳分析目经Ｄ－ＡＥ
Ｅｃｌ．ｏＢＬ１２．ＭｅｂｄＴｔｌＲａｓｌｔｄｆｏｕｎｆｔｌｂａｎｔｓｅｈｕ１ｅｇｈｈｍａ．ｙｕｌｉＤＮＡｔｏｓｏａＮＡｗｓｉｏａｅｒｍｈｍａｅａｒｉｉｕ．Ｔｅｆｌ１ｎｔｕｎＢｓｎｃｅｎｃｓ．
【中图分类号】７２Ｒ４
【文献标识码】Ａ
【文章编号】１０４４（０００－４５３０５８７２１）６０９－０
Ｄｉ１．９９ｊｉｓ．０５～４４．０００．１ｏ：０３６／．ｓｎ１０８７２１．６００
ＣｎｔｕｔｎｏｒｋｒｏｉＥｐｅｓｎＶｅｔｒｏｌｙｕｌｉｎｏｓｒｃｉｆｏａｙｔｘｒｓｉｃｏｆｌＳｎｃｎａｄｏＰｃｏｊ－ｅ

新型rPA(K)原核表达载体的构建及初步表达

１１１菌株及质粒．．
含有ｒＡ（基因的质粒载体ｐｒＫ）ＰＫ）ＥＡ（由笔者所在实验室李敏等人构建；表达载体ｐＴ一０（，主Ｅ３ａ＋）宿
菌大肠杆菌Ｂ２（Ｅ）Ｌ１Ｄ３均为笔者所在实验室保存．
１１２主要试剂．．
于以上原因，同时为了降低研究成本，方便ｒＡ（）ＰＫ的表达、测和纯化等后续工作，检笔者实验利用ＰＲ技术将Ｃ
ｒＡＫ）ＤＡ克隆至原核表达载体ｐＴ３ａ＋），了ｒＡＫ的新型原核表达载体．Ｐ（ｃＮＥ一０（中构建Ｐ（）
１材料与方法１１材．料
定（Ｌｓ试剂盒为上海太阳生物制品公司产品．ＥＩＡ）
１２主要方法．
１２１ｒＡ（ｃＮＡ片段的获得．．ＰＫ）Ｄ１２１１引物设计．．．
根据ｒＡ（的ｃＮＰＫ）ＤＡ序列【３Ｊ０及引物设计原则设计了一对引物，于亚克隆，引物序列中加入Ｂｌ，为便在ｇ Ⅱ
是以融合蛋白的形式进行表达的，即在表达产物之前存在非目的片段，得临床使用时将会引起机体的过敏反使应；而且如果对Байду номын сангаас其进行纯化，则必须使用价格昂贵的Ｌｓｅｈｍｓ或ＨｓＢｎ层析柱，而提高了研究成本．ｙ－ｐａｅｓｉ・ｉｄ从鉴
限制性内切酶Ｘｏ，ｔ，ｈＮｏＩＩ
Ｉ，ｐ，ｇ，Ｌ５０ｒｅ，ｏ —ａｇｒｔｎＭａｋｒＨＫｎＩＢｌＩＤ１００ＭａｋｒＬｗＲｎｅＰｅｒｅ为宝泰克公Ｉｏｉ

大肠杆菌的原核表达实验过程结果

大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。

2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。

可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。

3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。

4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。

5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。

6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。

在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。

小鼠TIM-3原核表达载体的建立及多克隆抗体的制备与鉴定

ｔｂｄｉｏｙ
ＭＡＤ — ｎＨＯＹｕｕｅＱｇ，Ａｏ－ａ，Ｈ
ａ３００．ｈｎｎ４０３Ｃｉａ
Ｍｉ，ＵＣｕ —ｉＧＯＹｈ，ＨＮＹｅ￡ｅｇｆ，ＡＧＤｎ－ｉｇ．ｉｓｎｎＸｈｎＬ，ＵａＣＥｕ，Ｍｎ－ＹＮｏｇＬｎＤｖｉｉａｉｏ
．
５０ｂｐｅｔｃｌｕａ１ｘｒｅｌｒＤＮＡｑｅｃｓｏｔｉｅｒｍｅｓｌｅｅｌｆＢＡａｅｓｕｎｅｗａｂａｎｄｆｏｔｐｅｎｃｌｏＬＢ／ｃｍｉｅｂｈｓｃｙＲＴ－ＣＲ，ｎｈｅｐｏａｙｔｘｒｓｉｎｅｔｒＰａｄｔｒｋｒｏｉｅｐｅｓｏｖｃｏｃ
（中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫研究室，汉４０３）华武３００
中国图书分类号Ｒ９．３３２３文献标识码Ａ文章编号１０－８Ｘ（０１０．１８０００４４２１）２０５－５
［摘
要］目的：克隆小鼠ＴＭ３Ｉ．基因，构建原核表达载体，制备相应的多克隆抗体并初步鉴定。方法：以小鼠脾细胞总
・１８５ Fra bibliotek中国免疫学杂志２１年第２０１７卷
ｄｉ１．９９ｊｉｎ１０—８Ｘ．０１０．１ｏ：０３６／．ｓ．００４４２１．０４ｓ２
小鼠ＴＭ．核表达载体的建立及多克隆抗体的制备与鉴定 ① Ｉ３原
马德强郝友华② 刘敏徐春利郭艳陈悦③ 陆孟吉④ 杨东亮

丙型肝炎病毒F蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

重庆医科大学学报２００９年第３４卷第４期（ｏｒａｏｏｇｉｇＭｅｉｌｎｖｒｉ０９Ｖｏ．．ＪｕｎｌｆＣｈｎｑｎｄｃｉｓｔ２０．１４Ｎｏ４）ａＵｅｙ３
一
３５一８
基础研究
文号：５３６０） —３ — 章编０３６（０００５０２ —２２９４８４
表达，出现了与预期分子量相符的蛋白条带，蛋白通过Ｗｅｔｎｂｏ检测具有６ｉｔｇ白的免疫学活性。结论：功构建该ｓｒｌｔｅＨｓａ蛋Ｘ成
了丙型肝炎病毒Ｆ蛋白的原核表达载体ｐＴ２（）ＨＶＥ３ａ＋一ＣＦ并表达和纯化出重组融合蛋白，为进一步研究Ｆ蛋白的生物学功能
ＣｏｇｉｈｎｑｎｇＭｅｉａＵｉｅｉ）ｄｃｎｖｒｔｌｓｙ
【ｂｔｃ】ｂｅｔｅＴｎｔｃａｐｏａｙｔｘｒｓｉｌｓｉｏｔｎｎＣｎ，ｎｕｉｅｅｏｉｎｓｎｒｔｎｉＡｓａｔＯｊｃｉ：ｏｃｓｕｔｒｋｒｏｃｐｅｓｎｐａｍｄｃｎａｉｇＶＦｇｅａｄｐｒｙｈｃｍｂｎｔｕｉｏｉｎｒｖｏｒｉｅｏｉＨｅｆｔｒａｆｏｐｅ
丙型肝炎病毒Ｆ蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化
高亚丽，娇，刘刘湘，汤华，陈沂，雪飞，蔡唐霓
（重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆医科大学病毒性肝炎研究所，庆重４０１）００６
【摘
要】目的：构建丙型肝炎病毒（ｐｔｉＣｖｕ，ＣＦ蛋白的原核表达载体，ＨｅａｔｉｓＨＶ）ｉｓｒ表达ｐＴ２（）ＨＣＦ融合蛋白。方法：Ｅ３ａ＋一Ｖ根

原核表达载体pET28a-EGFP的构建与表达

ｕｓｄｔｍｐｉｙａｄｏｔｉｅｈｅｏａｌｆｎｂａｎｄｔｅＥＧＦＰｇｎｅｆａｍｅｔｂｅｒｇｎｙＰＣＲ，ａｄｔｅｓｇｄａｐｉｒｔｎｒｄｅＥｃＲＩａｄｎｈｎｄｅｉｎｅｒｍｅｏｉｔｏｕｃｏｎＨｉｄＩＩｓｔｓｔｔｏｈｅｄ．Ａｆｅｒａｅｔｏｌｅｔｉｔｏｎｚｍｅ，ｔｅｉｒｄｃｄｅｚｍａｉｉｅＥＧＦＰｇｎｅｎＩｉｏｉｓｂｔｎｓｅｔｒｔｅｔｄｗｉｄｕｂｅｒｓｒｃｉｎｅｙｈｈｎｔｏｕｅｎｙｔｃｓｔｅｆａｍｅｔａＥＴａｐａｍｉｒｇｎ，ｎｄｐ２８ｌｓｄ，ａｒｃｍｂｉａｘｒｓｉｎｐａｍｉＥＴ２８・ｅｏｎｎｔｅｐｅｓｏｌｓｄｐａＥＧＦｗａｂａｎｅｓｎｉａｅＴｈＰｓｏｔｉｄｕｉｇＴ４ｌｇｓ．ｅｐＥＴ２－８ａＥＧＦＰｓｔａｓｏｍｅｎｏｃｍｐｔｎｃｅｌｆＥ．ｃｌ２１ｗｉｅｔｓｃｔｏｗａｒｎｆｒｄｉｔｏｅｅｅｃｌｓｏｏｉＢＬｔｈａｈｏｋｍｅｈｄ．Ｔｈｎｕｃｒｏｓｐｏｈｅｉｄｅｆｉｏｒ－
利用热击法把得到的重组质粒ｐＴ８ —ＧＰ转化至ＥｃｌＢ２（ｓｈｒｈａｃｌＢ２）受态细胞中，大肠Ｅ２ａＥＦ．ｏＬ１ＥｃｅｃｉｏＬ１感ｉｉｉ当
埃希茵Ｌ（ｕｉ・ｅｔｉ培养液在６０ｎ下的光密度值Ｄ６＝０４时，过添加异丙基硫代ＢＤ半乳糖苷ＢＬｒＢｒｎ）ａａ０ｍＤ０．０通 —一（ＰＧ作为诱导剂诱导ＥＦＩＴ）ＧＰ表达。结果表明：重组质粒酶切鉴定及测序结果正确。在自然光下，化子在转

重组表达质粒的构建——原核表达载体选择

重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具，其结构如下图。

重组蛋白表达，我们首先要将基因插入到表达载体上，插入的位置为多克隆位点。

质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。

尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。

这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。

蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签，使用不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。

常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。

福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。

1）促表达/促溶标签2）信标标签3）纯化标签我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功，更要考虑蛋白怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。

4）酶切位点以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释，科研工作者可根据具体实验设计方案，组合设计以上标签和酶切位点的使用。

特别值得注意的是，选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。

一般商业化载体，在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。

标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。

在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。

pGEX-4T-3- pMD19-T-S11原核表达载体的构建、表达与纯化及多克隆抗体的制备

pGEX-4T-3- pMD19-T-S11原核表达载体的构建、表达与纯化及多克隆抗体的制备水生呼肠孤病毒是水域生态环境中广泛存在的一类病毒，其中草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)是在1991年被国际病毒分类委员会(ICTV)分到水生呼肠孤病毒属，是由中国分离鉴定的第一株鱼类病毒[1]。

GCRV是具有双层衣壳、无囊膜、立体对称的20面体球形颗粒，主要由蛋白质和核酸组成，还含有少量以糖蛋白的形式存在的糖类，不含脂类[2]。

草鱼自古以来就是中国池塘养殖的当家品种，而GCRV被认为是水生病毒中对草鱼毒力最强、致病死亡率最高的病毒之一，该病毒引起的出血病不仅直接危害鱼体，而且会激发细菌性“三病”的发生，使草鱼的成活率降低到40~50[3]，甚至只有10%左右[4]，给中国的草鱼养殖业造成了很大的危害和困扰。

草鱼病毒性出血病，主要侵染于草鱼心脏、肝脏、肾脏、肌肉、脾、鳃、肠道等组织，且化学药物很难达到治疗效果，为了给草鱼养殖增产和减小不必要的经济损失，找到有效防治GCRV 的方法显得尤为重要。

GCRV基因组含有11条双链RNA(dsRNA)，其分段基因组RNA的3' 端不含poly(A)尾巴, 在5’和3’末端各含有特异的重复保守序列，为5’-GUUAUU和3’-UCAUC。

11个片段根据凝胶电泳迁移率可分为3组，即大片段(L1,L2,L3)、中等片断(M4,M5,M6)、较小片段(S7,S8,S9,S10,S11)。

GCRV共编码5 种非结构蛋白, 分别是NS16、NS26、NS31、NS38、NS80[5]。

病毒的非结构蛋白在病毒的复制过程中发挥重要作用。

其中NS26是由S11编码的，含有244个氨基酸残基，分子量为26.4KD, 是水生呼肠孤病毒特有的蛋白质, 没有同源蛋白，含ATP-依赖性的RNA解螺旋酶功能性位点[6]。

国际上对GCRV编码蛋白的功能(尤其是非结构蛋白的功能)方面的研究还不够系统和全面；但根据呼肠孤病毒家族中同源蛋白功能相似的原则，除非结构蛋白NS26外，GCRV各蛋白在病毒复制周期中的地位和作用已经初步明确[7]。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

二实验步骤
1、将鉴定为阳性的重组质粒pGEMT-NP、pGEMT-P、 pGEMT-M、pGEMT-F和pGEMT-HN与原核表达载体pET32a分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。以 pGEMT-NP为例，双酶切体系（30μL体系）如下：
ddH2O 10×buffer H pGEMT-NP EcoRI Sal I 21 µL 3 µL 4 µL 1 µL 1 µL ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 µL 3 µL 3 µL 1 µL 1 µL
第四组
ddH2O 10×buffer H pGEMT-F EcoRI Sal I 21 µL 3 µL 4 µL 1 µL 1 µL ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 µL 3 µL 3 µL 1 µL 1 µL
第五组
ddH2O 10×buffer H pGEMT-HN Sal I Xhol I 21 µL 3 µL 4 µL 1 µL 1 µL ddH2O 10×buffer H pGEMT-HN Sal I Xhol I 22 µL 3 µL 3 µL 1 µL 1 µL
新城疫病毒NP、P、M、F、HN 原核表达载体的构建
一实验所需材料
原核表达载体pET-32a（+）；
Ecoli DH5α菌株；
限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ、Hind Ⅲ、XhoⅠ； LB液体培养基（未加Amp+和加Amp+）； LB固体培养基（含Amp+）； 0.1mol/L CaCl2溶液；凝胶回收试剂盒。
2、双酶切反应条件：37 ℃ 3 h。进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后在紫外灯下切取目的条带，用凝胶回收试剂盒回收目的片段和原核表达载体片段。 3、目的基因片段与原核表达载体pET-32a的连接，连接体系为10μL：
ddH2O 10×T4 Buffer 目的基因片段载体片段 T4 DNA Ligase 2 µL 1 µL 5 µL 1 µL 1 µL 4℃连接过夜
NP基因两端带有的酶切位点为EcoRI和SalI，通用buffer为10×buffer H P基因两端带有的酶切位点为EcoRI和HindⅢ，通用buffer为10×buffer M M基因两端带有的酶切位点为EcoRI和SalI，通用buffer为10×buffer H F基因两端带有的酶切位点为EcoRI和SalI，通用buffer为10×buffer H HN基因两端带有的酶切位点为SalI和XhoI，通用buffer为10×buffer H
ddH2O 10×buffer O pET-32a-NP EcoRI Sal I 15.5 µL 2 µL 1.5 µL 0.5 µL 0.5 µL 37℃酶切3h
8、酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，将阳性质粒送去测序，序列分析正确的重组原核表达载体因两端酶切位点及双酶切通用Buffer
4、制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰上放置4h以上备用。 5、连接产物转化DH5α感受态细胞，将转化的细菌涂于Amp+ LB平板，37℃倒置培养过夜待菌落长出。 6、从Amp+ LB平板上随机挑取生长的单菌落，于3mL LB液体培养基（含Amp+）中培养12-16h。
7、碱裂解法提取质粒，然后用相应的限制性内切酶进行双酶切鉴定。以待鉴定的pET-32a-NP为例，双酶切体系为20μL：
EcoR Ⅰ
Sal Ⅰ
Xhol Ⅰ
Hind Ⅲ
第一组
目的基因酶切体系
ddH2O 10×buffer H pGEMT-NP EcoRI Sal I 21 µL 3 µL 4 µL 1 µL 1 µL
原核表达载体酶切体系
ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 µL 3 µL 3 µL 1 µL 1 µL
谢谢！谢谢！
Thanks!
二实验步骤
1、将鉴定为阳性的重组质粒pGEMT-NP、pGEMT-P、 pGEMT-M、pGEMT-F和pGEMT-HN与原核表达载体pET32a分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。以 pGEMT-NP为例，双酶切体系（30μL体系）如下：
ddH2O 10×buffer H pGEMT-NP EcoRI Sal I 21 µL 3 µL 4 µL 1 µL 1 µL ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 µL 3 µL 3 µL 1 µL 1 µL
第二组
ddH2O 10×buffer M pGEMT-P EcoRI HindⅢ 21 µL 3 µL 4 µL 1 µL 1 µL 22 µL 3 µL 3 µL 1 µL 1 µL
ddH2O 10×buffer M pET-32a EcoRI HindⅢ
第三组
ddH2O 10×buffer H pGEMT-M EcoRI Sal I 21 µL 3 µL 4 µL 1 µL 1 µL ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 µL 3 µL 3 µL 1 µL 1 µL