原核&真核表达载体构建
生物分类大全-原核生物
由原核细胞构成的生物。 细胞中无膜围的核和其他 细胞器。包括古核生物和 细菌。染色体分散在细胞 质中，不具有完全的细胞 器官并主要通过二分分裂 繁殖。如细菌、蓝藻、支 原体和衣原体。与古核生 物、真核生物并列构成现 今生物三大进化谱系。
原核生物界
产水菌门 热袍菌门 热脱硫杆菌门 异常球菌-栖热菌门 产金菌门 绿弯菌门 热微菌门 硝化螺旋菌门 脱铁杆菌门 蓝藻门 绿菌门 变形菌门 厚壁菌门 放线菌门 浮霉菌门 衣原体门 螺旋体门 纤维杆菌门 酸杆菌门 拟杆菌门 黄杆菌门 鞘脂杆菌门 梭杆菌门 疣微菌门 网团菌门 芽单胞菌门
5、支原体
它广泛分布于自然界，有80余种。与人类 有关的支原体有肺炎支原体（Mpneumonie，Mp）、人型支原体 （M.humenis，MH）、解脲支原体 （Ureaplasma urealyticum, UU 分解尿素 支原体）和生殖器支原体（M.genitalium， MG）等。
6、衣原体
4、立克次氏体
立克次氏体（Rickettsia）为革兰氏阴性菌， 是一类专性寄生于真核细胞内的G-原核生 物。是介于细菌与病毒之间，而接近于细 菌的一类原核生物。一般呈球状或杆状,是 专性细胞内寄生物，主要寄生于节肢动物， 有的会通过蚤、虱、蜱、螨传入人体、如 斑疹伤寒、战壕热。
4、立克次氏体
衣原体为革兰氏阴性病原体，在自然界中 传播很广泛。它没有合成高能化合物ATP、 GTP的能力，必须由宿主细胞提供，因而 成为能量寄生物，多呈球状、堆状，有细 胞壁，以一般寄生在动物细胞内。从前它 们被划归病毒，后来发现自成一类。它是 一种比病毒大、比细菌小的原核微生物， 呈球形，直径只有O.3-0.5微米，它无运动 能力，衣原体广泛寄生于人类，哺乳动物 及鸟类，仅少数有致病性 。
原核细胞和真核细胞的区别
原核细胞和真核细胞的区别
1、细胞核：原核细胞无核膜包被的细胞核，没有染色体；真核生物具有核膜包被的细胞核，含有至少一个染色体。
2、细胞器：原核细胞的细胞器只有核糖体；真核细胞除了核糖体之外还有线粒体、叶绿体、高尔基体和溶酶体等细胞器。
3、增值方式：原核细胞是通过二分裂；真核细胞的增殖方式包括有丝分裂、无丝分裂、减数分裂。
本质区别：有无以核膜为界的细胞核
大小：原核较小真核较大
细胞核：原核没有由核膜包被的细胞核，有一个环状的DNA分子，分布区域称为拟核
真核有成形的、真正的细胞核，有核膜和核仁
细胞质：原核有分散的核糖体，无其他细胞器真核细胞有核糖体和其他细胞器
细胞壁：细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶
DNA存在形式：原核细胞质粒：小型环状DNA拟核：大型环状DNA染色质、
真核细胞DNA分子（线粒体、叶绿体内）
代表生物：原核生物有衣原体（最小的细胞生物）、支原体（沙眼）、细菌（球、杆、弧、螺旋的菌类、）乳酸菌、固氮菌、蓝藻（也叫蓝细菌）、颤藻、念珠藻、发菜、放线菌等
真核生物有真菌（酵母菌、食用菌、霉菌、黄曲霉菌）、动物、植物、原生生物（草履虫、变形虫）。
植物病理学 植物病原原核生物
一、症状识别
1、菌原体病害：
病株矮化或矮缩，枝叶丛生，叶小而 黄化。因此丛生、矮缩、小叶与黄化 相结合是诊断菌原体病害症状时必须 掌握的关键。
2、细菌病害： 病植物表现的症状类型主要有坏死、 萎蔫、腐烂和畸形等类，褪色或变色 的较少；有的还有菌脓(ooze)溢出。
(二)侵染源
1．种子和无性繁殖器官： 如水稻白叶枯病、 柑桔溃疡病、马铃薯环腐病和甘薯瘟等。
2．土壤：如软腐欧氏菌。 3．病株残余体： 4．杂草和其它作物：如桑萎缩病菌原体就可
以侵染葎草并引起病害。 5．昆虫介体：如柑桔木虱是柑桔黄龙病的传
播介体，而菱纹叶蝉则是桑萎缩病菌原体的 主要媒介昆虫。
第三节 植物病原原核生物主要类群
1、目前该菌还不能人工培养，属名尚待核准。 2、细胞由细胞膜包裹，无细胞壁； 3、圆球状至丝状，形态可变； 4、对四环素类抗生素敏感，对青霉素类抗生素 不敏感；对低渗盐溶液敏感，对洋地黄皂苷有抗性。 5、菌体主要存在于植物韧皮部筛管中，由叶蝉 类昆虫传播，可致植物黄化、矮缩、丛枝等症状。
植原体属和病例
该属模式种为成团泛菌(P. agglomerans)，引起
水稻内颖褐变病。
斯氏泛菌P. stewartii，可引起玉米斯氏萎蔫病。
(4)假单胞菌属(Pseudomonas)
属于变形菌门。 短杆状，有运动性，极生鞭毛 1 至多根。 严格好气性。
模式种：丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)
可引起葫芦科植物叶枯与果腐病。
(6)劳尔氏菌属(Ralstonia)
变形菌门。 短杆状，极生或周生鞭毛运动，或无鞭毛不运动。 该属中较重要的病原为茄劳尔氏菌(R. solanacearum)，
原核细胞与真核细胞的比较
原核细胞与真核细胞的比较细胞是除病毒以外的生物体结构和功能的基本单位。
在种类繁多的细胞世界中，根据其进化地位、结构的复杂程度等方面的差异，可以将细胞分为原核细胞和真核细胞两大类。
原核细胞没有典型的细胞核，由原核细胞构成的生物是原核生物；真核细胞有细胞核，由真核细胞构成的生物是真核生物，但二者的区别还不仅如此，现就高中阶段所学知识，将二者之间的区别归纳如下。
1 细胞壁上的差异原核细胞细胞壁的成分主要是肽聚糖和胞壁酸，还有脂多糖、脂蛋白等成分。
细胞壁除对细胞有保护作用外，还对物质交换起部分调节作用，其成分还与抗原性、致病性等方面有关。
真核细胞中动物细胞没有细胞壁，植物细胞的细胞壁成分主要是纤维素和果胶，起支持和保护作用。
2 细胞核与染色体水平原核生物的特征是体积较小，直径由0.2～10µm，进化地位较原始，现存资料可以证明真核细胞是由原核细胞进化而来。
代表性的原核生物有：细菌、蓝藻、支原体、衣原体、立克次氏体等。
原核细胞与真核细胞最本质的区别就是看有没有成型的细胞核，原核细胞没有核膜将它的遗传物质与细胞质分隔开，没有核膜、没有核仁、没有固定形态、结构也较简单，其遗传信息量小，遗传信息的载体是裸露的双链环状DNA分子，没有与组蛋白结合，不构成染色体(有的原核生物在其主基因组外还有更小的能进出细胞的质粒DNA)。
真核细胞具有双层膜结构的核膜将细胞内部分成细胞核与细胞质两部分，核膜上有核孔，核内有核仁，其绝大多数遗传物质就分布在细胞核内，双层核膜的出现为遗传物质结构的演化提供了良好的微环境，使高度复杂的遗传装置相对独立起来，也使基因的表达具有严格的区域性。
真核细胞遗传信息的载体DNA与原核细胞的DNA相比，其结构与数量都有变化。
数量由几千发展到几万甚至十万以上；结构为线状，线状的DNA分子能与多种组蛋白结合，形成直径10nm的核小体结构，然后再以核小体为结构单位高度螺旋盘绕形成复杂的染色体或染色质。
原核与真核基因表达比较
目录
• 引言 • 原核生物基因表达特点 • 真核生物基因表达特点 • 原核与真核基因表达差异比较 • 原核与真核基因表达互作关系 • 研究展望与意义
01
引言
目的和背景
揭示原核与真核基因表达的差异
通过比较原核生物和真核生物在基因表达调控机制、转录和翻译过程等方面的 异同，深入理解生物进化的本质和复杂性。
宿主环境
真核生物作为宿主，其内部环境可能 对原核生物的基因表达产生影响，如 pH值、温度、营养条件等。
免疫应答
真核生物的免疫系统可以识别并应答 原核生物的感染，从而影响原核生物 的基因表达。生物与真核生物之间可以建 立共生关系，彼此之间的基因表 达会相互影响，以达到共同生存 的目的。
转录延伸
在原核生物中，RNA聚合 酶在DNA模板上持续合成 RNA链，直到遇到终止信 号。
转录终止
原核生物的转录终止通常 涉及rho因子等蛋白质， 帮助RNA聚合酶从DNA模 板上脱离。
翻译过程
01
翻译起始
延伸过程
02
03
翻译终止
原核生物的翻译起始需要特定的 起始因子和核糖体小亚基的结合。
在原核生物中，延伸因子帮助氨 酰-tRNA进入核糖体的A位，并 促进肽键的形成。
表观遗传调控
真核生物具有复杂的表观遗传调控机制，如DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等，这些调控机制可以影响基因 的表达和细胞的命运。而原核生物则缺乏类似的表观遗传调控机制。
信号传导与基因表达调控
真核生物的信号传导途径与基因表达调控密切相关，可以通过信号分子和受体的相互作用来调节基因的 表达。而原核生物的信号传导途径相对简单，通常不涉及复杂的信号分子和受体的相互作用。
原核生物与真核生物的区别
中无细胞壁
细胞膜
含异戊二烯醚，甾醇，含脂肪酸脂，甾醇稀少，含脂肪酸脂，甾醇普
有分支的直链
无分支直链
遍，无分支直链
含 DNA 的细胞器
－
－
线粒体和叶绿体
内质网和高尔基体
－
－
＋
胞饮和阿米巴运动
－
－
＋
核糖体大小
70S
70S
80S( 细胞器中 70S)
核糖体亚基
30S ， 50S
30S ， 50S
40S ， 60S
原核生物与真核生物的区别
原核生物与真核生物的区别 原核生物包括古菌和细菌，与真核生物的区别综合列于表 1-1 。主要差异有 （ 1 ）、原核生物的遗传物质主要是以双螺旋 DNA 构成的一条染色体 (chromosome) ，仅形成一个核区， 没有核膜包围，无核仁，称为原核 (nucleoid) 或拟核，无组蛋白与之相结合。真核生物的遗传物质以双螺旋 DNA 构成一条或一条以上的多条染色体群，形成一个真核 (nucleolus) ，有一核膜包围，膜上有孔，有核仁，明显 有别于周围的细胞质，并有组蛋白与之相结合。而且各种细胞器如线粒体、叶绿体携带有自己的 DNA ，可自 主复制。 （ 2 ）、原核生物细胞的细胞质由细胞膜 (cell membrane) 包围，并有细胞膜大量褶皱内陷入细胞质中形成 中间体或称为间体 (mesosome) 。不含其他分化明显的细胞器 (organelles) 。真核生物细胞同样由细胞膜包 围，但不内陷，内含多种细胞器，如主要进行呼吸能量代谢的线粒体（ mitochondria ）和光合作用的叶绿体 (chloroplast) 等。各种细胞器有各自的膜包围，细胞器膜与细胞膜之间无直接关系。 （ 3 ）、原核生物和真核生物细胞的蛋白质合成都是在核蛋白体上进行，但大小不同，原核生物的核蛋白体为 70S ，而真核生物的核蛋白体为 80S ，其细胞器的核蛋白体也为 70S 。而且它们各自的亚单位构成也不一 样，原核生物的核蛋白体是由 50S 和 30S 的两个亚单位构成，真核生物的核蛋白体是由 60S 和 40S 两个 亚单位构成，各亚单位的构成上也有区别。
原核表达系统
05
原核表达系统的研究进展
研究现状
基因克隆技术
随着基因克隆技术的发展，越来 越多的基因被成功克隆并用于原 核表达系统中，为生物制品的制 备提供了更多选择。
表达载体构建
原核表达系统中的表达载体是关 键因素，目前已经构建了多种高 效表达载体，能够实现外源基因 的高水平表达。
宿主菌选择
宿主菌的选择对原核表达系统的 表达效果至关重要，经过不断筛 选和改良，已成功应用于生产实 践的宿主菌种类不断增加。
通过原核表达系统可以大量制 备蛋白质，用于研究蛋白质之 间的相互作用和复合物组装。
蛋白质工程改造
利用原核表达系统可以对蛋白 质进行体外进化、定向改造等 ，提高蛋白质的特性和功能。
在生物科学研究中的应用
蛋白质组学研究
生物信息学研究
原核表达系统可用于蛋白质组学研究， 大量制备蛋白质并进行分析，揭示蛋 白质的结构和功能。
原核表达系统
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原核表达系统的基本原理 • 原核表达系统的应用 • 原核表达系统的优缺点 • 原核表达系统的研究进展 • 结论
01
引言
主题简介
原核表达系统是一种利用原核生物（如细菌）作为宿主细胞进行 目的基因表达的技术。
它具有操作简便、成本低廉、表达量高等优点，广泛应用于基因 工程、蛋白质工程等领域。
翻译过程中，宿主菌的 核糖体识别mRNA上 的起始密码子，开始翻 译目的基因，合成蛋白 质。
通过调控启动子和终止 子等元件，可以控制目 的基因的表达水平和方 向。
03
原核表达系统的应用
在生物制药领域的应用
80%
生产重组蛋白药物
原核表达系统可用于生产重组蛋 白药物，如胰岛素、生长激素等 ，用于治疗各种疾病。
原核的名词解释-概述说明以及解释
原核的名词解释-概述说明以及解释1.引言1.1 概述原核是生物界的一个重要分类单位，在生物学中具有重要的地位。
它是指那些不具有真核细胞核的生物，其遗传物质以原核无核糖体的形式存在。
原核生物包括细菌和古细菌两大类，它们在生物学研究和应用中都具有重要的意义。
本文将对原核的定义、特征和分类进行详细解释，并探讨其在生物界中的重要性和展望。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以描述文章的整体结构和布局，以及每个部分的主要内容和重点。
在这个具体的例子中，可以简要介绍引言、正文和结论各部分的内容，并强调它们在整篇文章中的重要性和作用。
1. 引言部分介绍了文章的背景和意义，包括原核的概述、文章结构和目的。
2. 正文部分分为原核的定义、特征和分类三个部分，对原核进行了系统的解释和分析。
3. 结论部分总结了原核的重要性，展望了未来的研究方向，并给出了文章的结论。
通过这样的文章结构，读者可以清晰地了解到整篇文章的内容和逻辑关系，有助于他们更好地理解和吸收文章的知识。
1.3 目的:本文的目的是为了深入解释和分析原核这一生物学术语的含义和重要性。
通过对原核的定义、特征和分类进行详细的探讨，希望能够让读者对原核有一个更清晰的认识。
同时，通过总结原核的重要性和展望未来的研究方向，也能够引起读者对原核的关注和兴趣。
最终的目标是让读者对原核有一个全面而深入的了解，从而为生物学领域的进一步研究和探索提供有益的参考。
2.正文2.1 原核的定义原核是生物学中的一个术语，用来描述一类原始生物的细胞结构。
原核细胞是指没有真核细胞核的细胞，其遗传物质以DNA的形式直接存在于细胞浆中。
原核细胞通常较小且形态简单，缺乏细胞器和细胞器膜。
在原核细胞中，基因的转录和翻译过程都在细胞质中进行，而不像真核细胞那样在细胞核和细胞器内进行。
原核细胞主要包括细菌和古细菌两大类。
细菌是一类最为广泛存在和研究的微生物，它们通常以单细胞形式存在，形态多样，能够适应各种环境。
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原核、真核表达载体构建
真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。
比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。
带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达；带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。
两者都具有的为穿梭载体。
㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。
原核表达载体调控原件
1.启动子
启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。
没有启动子，基因就不能转录。
由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。
原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。
在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。
来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。
在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。
转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。
-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。
原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。
2. SD序列
1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。
它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。
另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。
3．终止子
在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。
转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。
对RNA聚合酶起
强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C富含区域又具有回文对称结构。
这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构，并且有与A/T富含区对应的一串U。
转录终止的机制较为复杂，并且结论尚不统一。
但在构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的rrB核糖体RNA的转录终止子。
原核表达载体构建
1.获得目的基因
（1）通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
（2）通过RT-PCR方法：提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
2.构建重组表达载体
（1）载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
（2）PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
3. 获得含重组表达质粒的表达菌种
（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
㈡真核细胞常见表达载体
1.pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
3. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin 表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。