DREB基因的原核表达载体的构建及检测
大白菜DREB类转录因子cDNA的克隆及植物表达载体的构建
个 CBF4, 而 CBF4 是 与 CBF/ DREB1 很相 似的同 源 物。以后相继在甘蓝型油菜[ 6] 、小麦[ 7] 、水稻[ 8] 、大 豆[ 9] 、烟草[ 10] 、甜瓜[ 11] 、棉花[ 12] 、甘薯[ 13] 、芥菜[ 14] 等 作物中克隆了几十个 CBF/ DREB 转录因子基因, 这 些编码 CBF/ DREB 转录因子的基因分别受低温、干 旱或盐的诱导。
2 结果与分析
2. 1 大白菜 DREB 基因的克隆及序列分析 以大白菜 cDNA 为模板, 用所设计 的特异引物
扩增出约 660 bp 的条带( 图 1) , 将 PCR 产物回收并 进行连接 转化。随机挑取 5 个白色菌 落进行 PCR 扩增, 大部分均扩增出一条 660 bp 左右的条带( 图 2) 。阳性克隆的测序 结果表明, 该片 段长 663 bp。 利用 NCBI 站点的 ORF finder 进行分析发现, 该片段 包含一个完整的编码序列( 10~ 651) , 编码 214 个氨 基 酸, 命 名 为 BcDREB1 ( GenBank 登 录 号 为: EU924266) 。
BLAST 分 析 结果 表明, 该 序列 与甘 蓝 型油 菜 DREB2 2 基因氨基酸序列的同源性分别为 99% ; 与 芥菜 DREB1B 基因和烟草 DREB1 基因的同源性分
1期
李 妍等: 大白菜 DREB 类转录因子 cDNA 的克隆及植物表达载体的构建
1 材料和方法
1. 1 试验材料 1. 1. 1 材料 本试 验所用 材料为 大白菜 自交系 85 1, 由河北农业大学白菜育种组提供。基因克隆 所用大肠杆菌( E . coli ) 菌株为 DH5 , 由本实验室保 存。改 造 过 的 质 粒 载 体 pCAMBIA2301 ( 插 入 CaMV35S 和 nos) 由南京农业大学惠赠。 1. 1. 2 主 要试剂 Taq DNA 聚合酶、限制性内切 酶、T4 DNA Ligase、AMV 反 转 录 试 剂盒、pMD19 T vector 等均购自 TaKaRa 公司。Trizol RNA 提取液、U NIQ 10 柱式质粒抽 提试剂盒等购 自上海生工生物 工程公司。 1. 2 试验方法 1. 2. 1 材料处理 将大白菜的种子进行表面消毒 后, 播种于穴盘中, 待长出 2~ 3 片真叶时, 用 20% 的 PEG 6000 处理 12 h 后取下叶片, - 70 保存备用。 1. 2. 2 引物的设计与合成 参照已发表的甘蓝型 油菜 DREB 转录因子基因序列设计引物, 上下游引 物分别有 BamH I 和 Xba I 酶切位点( 下划线部分) , 并添加了 3 个保护碱基。上游引物 DR F 序列为: 5! GTAGGATCCATGACCTCATTTTCTACCTTC 3!, 下 游 引 物 DR R 序 列 为: 5! GCTTCTAGATTAATAACTC CAAAGGGACAC 3!, 引物由上 海生工生物 工程公司 合成。 1. 2. 3 目的基因 的扩增 与克隆 以反转 录产物 cDNA 为模板, DR F 和 DR R 为 引物, 进行 PCR 扩
基因表达载体构建的具体操作流程
基因表达载体构建的具体操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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原核表达载体构建步骤
原核表达载体构建步骤构建原核表达载体就像是在微观世界里盖房子，而且是给那些超级小的生物分子住的。
咱得先找好“建筑材料”，也就是目的基因啦。
这目的基因就像是一颗特别的种子，我们要把它种到原核生物这个小花园里。
找目的基因有时候就像大海捞针，在基因的海洋里翻来翻去，直到找到那一颗闪闪发光的“金种子”。
然后呢，要有合适的“地盘”，这就是原核表达载体。
这个载体就像是一块神奇的土地，不过它可不是随随便便的土块，而是经过精心设计的，上面有各种功能区域，就像土地上划分好了不同的功能区一样，有启动子区，这就像是房子的大门开关，决定着基因能不能开始工作，还有终止子区，那是工作结束的信号，就像下班的铃声。
接下来要把目的基因和载体连接起来，这过程就像是用超级胶水把种子粘到土地上。
这个胶水就是连接酶啦，它特别神奇，能准确地把基因和载体紧紧地连在一起，就像把两根细细的线完美地缝起来一样。
在这之前，还得对载体和目的基因进行处理，就像给土地松松土，给种子去去壳。
我们要用限制酶在载体和目的基因上切出合适的口子，这限制酶就像一把超级小但无比锋利的剪刀，精确地剪出想要的形状。
构建好之后，还得检查一下有没有问题呀。
这就像是房子盖好了要验收一样。
要看看基因有没有正确地连接，就像检查房子的结构有没有稳固。
有时候如果出了差错，那就像盖歪了房子，一切就得重新来啦。
把构建好的原核表达载体送进原核细胞这个小家园，就像把种好种子的花盆放到温室里。
原核细胞会像勤劳的小园丁一样照顾这个载体，让目的基因开始表达，生产出我们想要的蛋白质。
这蛋白质就像是花朵或者果实，是我们精心构建载体的最终收获。
整个过程充满了各种惊喜和挑战，有时候一个小失误就像在蛋糕里放错了盐，整个味道就全变了。
但当一切顺利的时候，就像是在微观世界里创造了一个小奇迹，那些小小的分子按照我们的意愿开始工作，感觉自己就像一个微观世界的大魔法师呢。
原核表达载体构建虽然复杂又繁琐，但就像一场充满乐趣的微观冒险，每一步都充满了未知和期待。
基因表达载体的构建操作流程
基因表达载体的构建操作流程一、了解基因表达载体。
基因表达载体就像是一个小货车，它要把我们感兴趣的基因（就好比是货物）运到细胞这个大工厂里，然后让基因在里面表达出我们想要的东西。
这个载体得有一些特定的部件。
比如说启动子，这就像是货车的发动机，启动整个表达过程。
还有终止子呢，就像是刹车，告诉基因什么时候停止表达。
另外，标记基因也很重要，它就像是货车上的独特标志，方便我们在细胞里找到这个载体是不是成功进去工作了。
二、获取目的基因。
那我们怎么得到想要的目的基因呢？这里有好多办法。
有一种是从基因文库里面找，基因文库就像是一个超级大的基因超市，里面各种各样的基因都有。
我们可以像在超市里找东西一样，用一些特殊的方法把我们要的基因挑出来。
还有一种方法是通过反转录法，如果我们知道这个基因表达出来的RNA长啥样，就能通过反转录把它变成DNA，也就是我们要的目的基因啦。
另外，化学合成法也能用，不过这个比较适合那些比较小的基因片段哦。
三、构建基因表达载体。
当我们有了目的基因，就要开始构建载体啦。
这就像是给我们的货物装到货车上的过程。
我们要把目的基因和载体用同一种限制性核酸内切酶来处理，这种酶就像是一把特殊的剪刀，它能在特定的位置把基因和载体都剪开，而且剪出来的口子是可以互相配对的。
然后呢，再用DNA连接酶把目的基因和载体连接起来，这个酶就像是胶水，把它们粘得牢牢的。
这样，我们的基因表达载体就初步构建好啦。
四、导入受体细胞。
构建好的载体得送到受体细胞里去才能发挥作用。
根据受体细胞的不同，导入的方法也不一样呢。
如果是细菌这样的细胞，我们可以用转化的方法，就像是偷偷地把东西送进去一样。
要是植物细胞的话，农杆菌转化法就比较常用啦，农杆菌就像是一个小邮差，把我们的载体送到植物细胞里面。
动物细胞的话，显微注射法是一种选择，就像是用一个超级小的注射器把载体注射到细胞里。
五、检测与鉴定。
载体送进去了，我们得看看它有没有成功呀。
首先就是检测目的基因是不是真的到了受体细胞里面。
《2024年苜蓿DREB类转录因子基因的研究》范文
《苜蓿DREB类转录因子基因的研究》篇一一、引言近年来，植物生物学领域中，转录因子在基因表达调控中的作用越来越受到重视。
DREB（脱氧核糖核酸结合蛋白）类转录因子是植物响应逆境胁迫的重要调控因子之一。
苜蓿作为一种重要的豆科植物，其在环境适应性及抗逆性方面具有独特的生物学特性。
因此，研究苜蓿DREB类转录因子基因对于了解其逆境响应机制及改良作物抗逆性具有重要意义。
本文将围绕苜蓿DREB 类转录因子基因的克隆、表达模式及功能等方面展开研究。
二、苜蓿DREB类转录因子基因的克隆在研究过程中，我们首先从苜蓿基因组中克隆了DREB类转录因子基因。
通过生物信息学分析，我们确定了该基因的开放阅读框、编码区及启动子等关键区域。
通过PCR扩增及DNA测序等手段，成功获得了该基因的全长序列。
同时，我们还对序列进行了比对分析，发现该基因与其他植物DREB类转录因子基因具有较高的相似性，表明其在植物逆境响应中具有保守的生物学功能。
三、苜蓿DREB类转录因子基因的表达模式为了研究苜蓿DREB类转录因子基因的表达模式，我们采用了实时荧光定量PCR技术对不同逆境条件下的基因表达水平进行了分析。
实验结果表明，在干旱、低温等逆境条件下，该基因的表达水平显著上升，表明其参与了苜蓿对逆境的响应过程。
此外，我们还发现该基因在不同组织中的表达水平也存在差异，这可能与苜蓿在不同生长阶段的适应性有关。
四、苜蓿DREB类转录因子基因的功能分析为了进一步研究苜蓿DREB类转录因子基因的功能，我们采用了基因编辑技术构建了该基因的过表达及敲除转基因植物。
通过对转基因植物的表型分析，我们发现过表达该基因的植物在干旱、低温等逆境条件下的生存能力及生长速度均有所提高，而敲除该基因的植物则表现出对逆境的敏感性增加。
这表明苜蓿DREB类转录因子基因在植物逆境响应中发挥了重要的调控作用。
五、结论本研究成功克隆了苜蓿DREB类转录因子基因，并对其表达模式及功能进行了分析。
一个新的编码大豆DREB转录因子基因的克隆及鉴定
一个新的编码大豆DREB转录因子基因的克隆及鉴定王巧燕;陈明;邱志刚;程宪国;徐兆师;李连城;马有志【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2005(018)005【摘要】DREB转录因子是一类可以调控多个与干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因表达的转录因子家族.从大豆耐盐品种铁丰8号中克隆了一个新的DREB基因GmDREB5.该基因编码309个氨基酸,具有典型的AP2/ EREBP保守结构域,属于AP2/ EREBP类转录因子中的DREB亚族.同源性比较分析表明,GmDREB5基因与Genbank登录的DREB基因同源性不高,属于新基因.酵母转录激活实验证明,该基因可以与DRE顺式作用元件特异结合,并具有转录激活活性;同时采用CaMV35S 启动子驱动,构建了植物表达载体pBI35S-GmDREB5,并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105中,再利用叶盘转化法将重组质粒导入烟草品种W38中,获得转基因烟草植株30株.【总页数】4页(P625-628)【作者】王巧燕;陈明;邱志刚;程宪国;徐兆师;李连城;马有志【作者单位】中国农业科学院作物科学研究所,农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程,农业部作物遗传育种重点开放实验室,北京,100081;新疆农业大学农学院,新疆,乌鲁木齐,830052;中国农业科学院作物科学研究所,农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程,农业部作物遗传育种重点开放实验室,北京,100081;中国农业科学院作物科学研究所,农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程,农业部作物遗传育种重点开放实验室,北京,100081;中国农业科学院资源与农业区划研究所,北京,100081;中国农业科学院作物科学研究所,农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程,农业部作物遗传育种重点开放实验室,北京,100081;中国农业科学院作物科学研究所,农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程,农业部作物遗传育种重点开放实验室,北京,100081;中国农业科学院作物科学研究所,农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程,农业部作物遗传育种重点开放实验室,北京,100081【正文语种】中文【中图分类】S336【相关文献】1.棉花中一个新的类DREB转录因子(GhDREB2B)的克隆、序列特征及表达分析[J], 李付振;邱新棉;刘传亮2.紫大麦草中DREB类转录因子基因Hvi917DREB2的克隆、原核表达及序列分析[J], 肖雄;王睿辉;刘桂茹;温树敏;谷俊涛3.转录因子DREB1A基因的克隆与Gateway克隆技术构建植物表达载体 [J], 佟友丽;赵飞;冯君伟;李玉花4.花生中DREB类转录因子PNDREB1的克隆及鉴定 [J], 张梅;刘炜;毕玉平;王自章5.高羊茅中一个DREB类转录因子基因的分离及鉴定分析 [J], 阳文龙;刘敬梅;刘强;公衍道;赵南明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
《苜蓿DREB类转录因子基因的研究》范文
《苜蓿DREB类转录因子基因的研究》篇一一、引言植物在面对各种环境压力时，如干旱、高温、寒冷等，都会产生相应的适应性反应。
这些反应涉及到多种复杂的生物学过程，其中转录因子扮演着至关重要的角色。
DREB（Dehydration-responsive Element Binding）类转录因子作为一类重要的植物转录因子，对植物应对环境压力具有重要的调节作用。
本研究主要探讨苜蓿（Medicago）DREB类转录因子基因的特性及功能。
二、研究目的本研究的目的是分析苜蓿DREB类转录因子基因的序列特征、表达模式及其在植物抗逆境过程中的作用，以期为进一步改良作物抗逆性提供理论依据。
三、研究方法1. 基因克隆与序列分析：利用PCR技术克隆苜蓿DREB类转录因子基因，进行序列分析，包括开放阅读框（ORF）的预测、编码区（CDS）的确定等。
2. 表达模式分析：通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术，分析苜蓿DREB类转录因子基因在不同环境压力下的表达模式。
3. 转基因实验：构建转基因植物，通过过表达或敲除DREB 类转录因子基因，研究其在植物抗逆境过程中的作用。
四、实验结果1. 基因克隆与序列分析结果：成功克隆了苜蓿DREB类转录因子基因，并对其进行了序列分析。
结果表明，该基因具有典型的DREB类转录因子特征，包括DNA结合域和AP2/EREBP结构域。
2. 表达模式分析结果：RT-qPCR结果表明，苜蓿DREB类转录因子基因在干旱、高温、低温等环境压力下表现出明显的表达变化，表明其可能参与植物对环境压力的响应。
3. 转基因实验结果：通过过表达或敲除DREB类转录因子基因，发现该基因在植物抗逆境过程中具有重要作用。
过表达该基因的转基因植物表现出更强的抗逆性，而敲除该基因的转基因植物则对环境压力更加敏感。
五、讨论本研究表明，苜蓿DREB类转录因子基因在植物应对环境压力的过程中发挥着重要作用。
该基因的表达受环境压力的调控，通过调控下游基因的表达来应对环境压力。
《2024年扁蓿豆DREB转录因子家族同源基因MrDREB1的克隆和功能鉴定》范文
《扁蓿豆DREB转录因子家族同源基因MrDREB1的克隆和功能鉴定》篇一一、引言扁蓿豆是一种重要的植物资源，其在生态环境和农业生产中具有广泛的应用价值。
DREB（Dehydration Response Element Binding）转录因子家族是植物响应非生物胁迫的重要调控因子。
为了进一步研究扁蓿豆的抗逆机制，本文对扁蓿豆DREB转录因子家族的同源基因MrDREB1进行了克隆和功能鉴定。
二、材料与方法2.1 材料实验材料为扁蓿豆，取其幼嫩叶片作为RNA提取的样品。
实验试剂包括各种酶、引物、载体、抗生素等。
2.2 方法2.2.1 RNA提取与cDNA合成采用Trizol法提取扁蓿豆叶片RNA，并通过反转录酶合成cDNA。
2.2.2 MrDREB1基因克隆根据已知的DREB转录因子家族的保守序列设计引物，通过PCR技术扩增出MrDREB1基因。
2.2.3 序列分析与表达模式研究对克隆得到的MrDREB1基因进行序列分析，并研究其在不同逆境条件下的表达模式。
三、实验结果3.1 MrDREB1基因的克隆结果通过PCR技术成功扩增出MrDREB1基因，经过测序验证，序列正确无误。
3.2 序列分析MrDREB1基因具有典型的DREB转录因子家族的保守结构域，与其他植物DREB转录因子具有较高的相似性。
3.3 表达模式研究在逆境条件下，如干旱、低温等，MrDREB1基因的表达量明显上升，表明其可能参与扁蓿豆的抗逆反应。
四、功能鉴定4.1 亚细胞定位通过亚细胞定位实验，发现MrDREB1蛋白主要定位于细胞核中，表明其作为转录因子的功能。
4.2 转基因植物构建与鉴定将MrDREB1基因转入模式植物中，通过抗性筛选和PCR鉴定，成功构建了转基因植物。
4.3 转基因植物抗逆性分析与野生型植物相比，转基因植物的抗逆性明显提高，表明MrDREB1基因具有提高植物抗逆性的功能。
五、讨论本文成功克隆了扁蓿豆DREB转录因子家族的同源基因MrDREB1，并对其进行了序列分析和功能鉴定。
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DREB基因原核表达载体的构建及检测李典鹏1霍凯丽1李政1陈丽萍1刘超2*（1.新疆农业大学草业与环境科学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2．新疆农业大学农学院，新疆乌鲁木齐 830052）摘要：以从苜蓿基因组获取的DREB基因为目的基因，经过大肠杆菌液体培养基和固体筛选培养基的制备、大肠杆菌工程菌平板培养、PCR扩增目的基因片段、PCR产物回收与纯化、回收产物与PSURE-T载体连接、大肠杆菌液体培养、大肠杆菌感受态细胞制备及转化、筛选重组转化菌落以及通过TPTG的诱导等一系列实验，使DREB基因在原核生物体内表达，最后通过酶切及电泳检测分析，确定了由DREB基因编码翻译蛋白的正常表达，达到了DREB基因在原核体内表达的目的。
关键词：DREB；原核表达；大肠杆菌；PCR0 引言高等植物中脱水应答元件结合蛋白（Dehydration－responsive element binding protein，DREB）属于转录因子家族AP2/EREB亚族。
在应答脱水、高盐和冷胁迫中具有重要的作用［1，2］。
DREB参与了植物胁迫中有ABA 依赖和非ABA 依赖响应的2 种响应途径，研究发现DRE2 结合蛋白DBF1 和DBF2 可以与干旱响应基因的顺式作用元件特异性结合，并在ABA 依赖的小麦水分胁迫反应途径中调节与抗旱相关的rab17 基因的表达[3]提高转基因植物对干旱、高盐和冷胁迫的耐受性［4,5］。
通过在模式植物中过表达DREB 基因，已经揭示了许多植物的DREB基因在逆境胁迫应答中的作用［6］。
大肠杆菌DH5α是目前原核细胞表达系统中应用最普遍的基因工程菌之一 [7]。
大肠杆菌表达系统的发展历史可追溯到20 年前。
科学家分别将酿酒酵母DNA 片段、粗糙链孢霉DNA 片段和哺乳动物cDNA 片段导入大肠杆菌，引起其表型的改变，证明了外源基因在大肠杆菌中可以使现有功能的活性表达[8]。
与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强等特点[9-10]，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具[11-12]。
本实验通过对大肠杆菌DH5α构建DREB基因的表达载体的构建，为后续试验以及相关研究打下坚实基础。
其次，通过对含有DREB基因的大肠杆进行工程培养，也为生物科学专业学生的实验学习提供较为稳定的菌种。
1材料与方法1.1材料供试原核表达载体为大肠杆菌菌株DH5α，由新疆农业大学农学院生物技术引论与实践课程组提供。
1.2 方法1.2.1DREB 基因编码区的克隆50μL体系中含目的基因1μL，Buffer 25μL，dNTPs 2μL，正反引物1μL以及Taq 酶0.5μL［天根生物技术有限公司］，补ddH2O 至50μL。
PCR 程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。
PCR产物以1．5％琼脂糖凝胶电泳检测，利用紫外凝胶成像仪观察结果。
采用琼脂糖凝胶回收试剂盒［天根生物技术有限公司］回收目的片段，将回收产物与PSURE-T载体连接后转化E.coli DH5α感受态细胞，与X－gal 和IPTG涂于含有氨苄青霉素的LB 固体培养基上，过夜培养后挑取白色克隆，经含有氨苄青霉素的液体培养基振荡培养12h，菌液PCR 检测是否有插入片段。
1.2.2 DREB基因原核表达载体的构建及鉴定以含有DREB 基因编码区质粒为模板，使用引物，用高保真酶扩增两端带有EcoRI 和HindⅢ酶切位点的大肠杆菌DREB 基因编码区序列。
PCR 扩增体系和扩增程序同上。
获得的DREB 基因PCR 产物，凝胶回收后，用EcoRI和HindⅢ酶切PCR 回收产物和表达载体质粒。
25μL体系中包含：质粒DNA 7μL，EcoRI 1μL，HindⅢ1μL，Buffer 2.5μL和ddH2O 13.5μL。
回收双酶切产物，用T4 DNA 连接酶将DREB片段连接到载体中。
连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。
最后通过菌液PCR和酶切分析鉴定构建的DREB 基因植物表达载体，最后通过SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。
1.2.3 大肠杆菌液固体培养基的制备LB液体培养基的配制（50ml体系），胰蛋白胨0.5g；NaCl0.5g；酵母提取物0.25g，双蒸馏水约40mL（溶解）；（调pH值7.0）定容到 50ml后置于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min。
LB固体培养基的配制（50ml体系），胰蛋白胨0.5g；NaCl0.5g；酵母提取物0.25g，双蒸馏水约40mL（溶解）；（调pH值7.0）定容到 50ml，往制备好的50ml培养基倒入100mL 的三角瓶中，再往三角瓶中加入琼脂粉0.75 g ，封口，准备灭菌。
灭菌仪器为高压蒸汽灭菌锅，本次培养制备灭菌条件为121℃，20min。
2 结果与分析2.1 DREB基因的PCR扩增效果分析根据GenBank中的苜蓿DREB基因序列，设计一对带有酶切位点的引物，用PCR方法扩增DREB基因的编码区，扩增大小约为670bp（图1）。
将扩增片段与基因片段大小进行比较，结果表明两个基因大小完全一致，说明获得的DREB基因编码区是正确的，没有发生碱基变化，可以用来构建原核表载体。
但在8组平行试验中，任有一组未出现扩增效果。
出现此类结果的原因可能是该组同学在添加试剂的时候误将试剂加错，点样计量太少或者漂样也可能是导致此类结果的原因。
M．Marker DL1500；1.DREB基因扩增产物图1 DREB基因的PCR扩增结果2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化2.2.1 感受态制备原理在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌的细胞膨胀成球形。
转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基----钙磷酸复合物，此复合物粘附与细菌的表面，42℃短时间的热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。
将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得新的表型（如Amp抗性）得到表达。
然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，在37℃培养过夜，这样就得到了转化的菌落[13]。
2.2.2感受态制备步骤从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于1ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。
将培养液转入1.5ml离心管中，4℃下5000rpm离心5min，弃上清并轻轻振动菌体；加入0.1MCaCl2溶液1ml使细胞轻悬；冰浴30min后在4℃下5000rpm离心5min；弃上清珍松菌体，加入50μL 0.1M的预冷CaCl2溶液重悬便得到了感受态细胞悬液。
2.2.3转化用移液器移取50ul感受态细胞和2μL质粒，轻轻混匀，勿吹打；同时做阴性对照即受体菌对照，50μL感受态细胞中加入2μL无菌水；冰浴30min，随后将其放入42℃恒温水浴锅中静置90s，再次冰浴2min，加入800ul 事先37℃预热的LB培养基，最后在120rpm 下恒温培养45min即转化成功。
2.3 DREB基因表达载体的构建用前向带有EcoRI和反向带有HindⅢ酶切位点的小麦DREB基因引物，以T－DREB质粒为模板，经PCR 扩增获得两端带有EcoRI 和HindⅢ酶切位点的DREB 基因编码区片段，扩增产物大小约670 bp，与预期大小相符，且无非特异扩增带。
用EcoRI和HindⅢ酶切，连接到用相同酶切回收后的表达载体上，转化E.coli DH5α，获得DREB 表达载体（图2）。
对含有重组子的大肠杆菌进行培养，然后进行菌液PCR鉴定，能够扩增出一条长约670 bp 的目的基因条带（图3）。
将阳性克隆片段大小与序列已知大小对比，结果正确，说名大肠杆菌DH5α DREB基因表达载体构建成功。
由图3可知，CK为本次试验的空白对照，但是在500bp至700bp之间也出现了较为明显的条带。
通过分析，其原因可能是由于引物受到模板DNA的污染导致条带出现。
除此之外，点样时也有可能出现漂样，样品沉降到CK的点样孔，故有条带但并不是很明显。
图2 DREB 基因原核表达载体结构示意图M．Marker DL1500；1-1至8-2.含有pSURE－DREB重组质粒的大肠杆菌DH5α菌液PCR产物图3 pSURE－DREB重组质粒PCR鉴定1.重组质粒DNA；M.Maker DL1500图4 重组质粒DNA电泳检测2.4 DREB原核表达及蛋白检测按1:100接过夜培养的菌液于50mL LB液体培养基中，220rpm，37℃恒温培养约3h，培养至OD=0.6-0.8，用不同浓度的IPTG进行诱导使其表达。
诱导结果表明，随着IPTG浓度的增加，其诱导DREB基因表达的效果越好，当IPTG的浓度为0.5mM时诱导效果最佳，浓度大于0.5mM时，诱导结果不随浓度的变化而变化。
由图（图4）可知通过SDS-PAGE电泳检测，所获得的蛋白大小在45kda左右，通过与老师验证，此蛋白大小确实为DREB基因指导翻译的蛋白大小，故DREB基因在原核大肠杆菌DH5α中表达成功。
图4 SDS-PAGE蛋白检测3讨论3.1 PCR扩增目的基因的影响因素在PCR扩增目的基因的试验中，出现了片段条带强弱分明的效果。
段新华[14]等研究表明，随着引物浓度的增加，扩增产物主带减弱，甚至可能出现非特异产物和弥散背景增强的的现象。
这是因为过高的引物浓度会增加错配的机会，试验中适当的降低引物浓度是适合的选择。
除引物的影响之外，不同的退火温度也会影响扩增效果，同样是段新华等研究结果表明，随着退火温度的降低，非特异性相对增加，也会出现背景弥散；退火温度升高，特异性相对增加。
Taq酶是Mg2+依赖型酶，反应体系中Mg2+的浓度也会影响扩增结果，随着Mg2+浓度增加，其催化作用增强，扩增产物的增多，背景也会明显增强[15]。
3.2 制备感受态细胞的影响因素感受态细胞制备是基因工程实验中尤为重要的一个部分，其结果直接影响蓝白斑筛选转化菌落。
李明才[16]等研究结果表明，CaCl2溶液浓度和感受态细胞的存放时间对转化效率有显著影响；而转化冰浴时间和转化后的振荡培养时间对转化效率无明显影响，100mmol/LCaCl2溶液制备感受态细胞，冰浴5min转化质粒，经42℃热休克作用90s后直接涂平板选择转化子，可获得快速、高效的转化效果。
本实验的蓝白斑筛选重组转化菌落实验不是很成功，其原因很有可能就是在制备感受细胞时出现差错，导致最终的筛选失败。