重组质粒的原核表达

实验九 表达质粒的构建与诱导表达 第一节 原核表达概述

基因工程的研究一方面是获得基因的表达产物，另一方面是研究基因结构与功能的关系，最终都涉及目的基因的表达问题。表达载体（express vector）是指本身携带有宿主细胞基因表达所需的调控序列，能使克隆的基因在宿主细胞内进行转录与翻译的载体。也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增；表达载体不仅使外源基因扩增，还使其表达。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用。外源基因在宿主（受体）细胞内是否表达以及表达水平受到许多因素（调控元件）的制约： 1．正确的阅读框架 为了获得正确编码的外源蛋白，外源基因编码区在插入表达质粒中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致。阅读框架是由每三个核苷酸为一组连接起来的编码序列，外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架之中，从而表达融合蛋白，使外源蛋白与宿主蛋白相融合。 2．目的基因有效转录的启动子 启动子(promoter) 是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列， 它是基因表达不可缺少的重要调控序列。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成的，分别称为 一35区和 一10区。一35区的序列为TTGACA，一10区序列为TATAAT。此两序列之间的最佳间距为17 bp。可与RNA聚合酶结合，并指导该酶在正确的转录部位开始合成mRNA。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体必须用原核启动子带动真核基因在原核生物中转录。原核表达载体启动子的转录常常是可以控制的，即一般情况下不转录，而受诱导剂诱导时就能转录，带动外源基因的高效表达。 目前常用的启动子：如大肠杆菌的lac启动子是乳糖操纵子的启动子，受lacⅠ编码的阻遏蛋白调节控制；trp等启动子是色氨酸操纵子启动子，受trp R编码的阻遏蛋白调节控制；tac启动子，由lac启动子的一l0区和trp启动子的一35区融合而成，汇合了lac和trp两者优点，是一个很强的启动子，受lacⅠ编码的阻遏蛋白调节；lacUV 5启动子是经紫外线诱变改造后的lac启动子，该启动子失去CAP和cAMP的正调控，只要有乳糖或IPTG存在时就能够启动转录；噬菌体的λPL、R启动子是λ噬菌体左、右向启动子，是一个温度敏感的阻遏蛋白受温度调控的很强的启动子；T7噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多，并且十分专一，只被T7 RNA聚合酶所识别；SV40启动子、多角蛋白启动子以及花椰菜花叶病毒（CaMV）启动子。 3．转录终止子 构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因干扰表达载体的稳定性，一般要在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA转录终止子(terminator)。否则合成的 mRNA过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，而且容易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。原核基因的转录终止序列包括依赖Rho蛋白和不依赖Rho蛋白两种。不依赖Rho的终止信号序列都含发夹结构，末端为一连串T及YRTCTG。 4．mRNA有效翻译的SD序列 在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)也调节着mRNA的翻译，一个是起始密码 (AUG或GUG)，另一个是位于起始密码上游3～11个核苷酸处的由3～9个核苷酸组成的一段保守序列AGGAGGU，这段序列富含嘌呤核苷酸，称为SD序列。而核糖体和mRNA的结合是由SD序列以及与起始密码子AUG之间的距离决定的。因此，SD序列和它的起始密码子AUG之间的距离是影响外源基因在原核生物中表达量高低的重要因素。SD序列与AUG间隔9个碱基最为合适，其间距离过长或过短都会影响目的基因的表达，有时由于这种距离的影响，蛋白质合成水平会相差2 000倍以上。且SD序列与AUG之间的碱基最好是A或U，一3位最好是A。 5．转录、翻译后的适当修饰和加工 真核生物基因表达的产物往往需要进行适当的修饰加工，但由于大肠杆菌本身的蛋白质翻译后修饰加工系统相当不完善，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或糖基化修饰。并且不同宿主其修饰系统也不一样，所以选择宿主时应注意。 6．信号序列(signal sequence) 在原核细胞中，合成的蛋白能否分泌到细胞外与mRNA编码区上游的一段信号序列有关。这段编码序列翻译的15～30个氨基酸为蛋白质N端的信号肽，它能携带蛋白质跨膜并分泌到细胞外。脂双层和负电荷的质膜通过和信号肽的疏水相互作用以及电荷的吸引是信号肽能跨膜分泌的主要原因。当信号肽携带后面的蛋白质跨膜分泌后，信号肽即被质膜上的信号肽酶切除得到有功能的成熟蛋白质。 因此根据不同的需要，人们构建了不同的在原核细胞中高效表达的载体，这些载体通常具有以下几个特点：①有一个强的原核启动子及两侧的调控序列；②位于读码框上游的SD序列与起始密码子AUG之间有合适的距离；③在外源基因和启动子之间有正确的阅读框架；④外源基因下游应加入不依赖ρ因子的转录终止区。一般表达载体都具有多克隆位点，对表达载体和外源基因用相同的两种酶双酶切后，再用T4 DNA连接酶把外源片段连入表达载体中，通过酶切、PCR鉴定，如果插入的片段大小和方向与外源基因一致，则成功构建了重组子。

将克隆的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

原核表达载体通常为质粒，典型的原核表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标记的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列 (转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多种单一限制性内切酶位点序列； （5）宿主体内自主复制的序列

原核表达的一般程序： 1 获得目的基因 2 准备表达载体 3 将目的基因插入表达载体中（测序验证）——表达质粒的构建 4 表达质粒转化相应的宿主菌 5 外源基因的诱导表达（诱导靶蛋白的表达） 6 表达蛋白的分析

原核表达的基本操作步骤举例： 一、试剂准备 1、LB培养基。 2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中, 0.22 μm 滤膜抽滤，-20℃保存。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达质粒 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。 （三） 获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。 （四）诱导表达 1、 挑取含重组质粒的菌体单斑至2 ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。 2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300 ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600

≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3 h）。

3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4 mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。 4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30 S收获沉淀，用100μL 1%SDS重悬，混匀, 70℃10 min。 5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。 三 、注意事项 1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达； 如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。 2、在构建表达质粒时，要注意使外源基因与载体DNA的起始密码相吻合时，使其处于正确的阅读框架之中。 3、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。 四、评议 1．表达质粒的构建的实验操作基本上与扩增质粒的构建相同，只是构建表达质粒时为了高 效表达外源基因，一般目的基因应与载体的相关DNA片段相融合。融合蛋白在大肠杆菌中的表达的优点如下：融合蛋白N端由正常的大肠杆菌本身序列所控制。容易获得高效表达；融合蛋白往往不被大肠杆菌视为异己蛋白，更为稳定。 2．表达载体与目标基因在体外重组完成后，必须导人特定的受体细胞如：BL21(DE3)，使之无性繁殖，直接改变其遗传性状。 3．在外源基因克隆到表达载体时，应注意其序列的ORF的正确与否，它直接决定其编码 的氨基酸序列，并且直接影响蛋白质的功能。如果ORF内碱基对发生缺失突变或插入突变，即插入或缺失非3的倍数的碱基对，那么ORF就可能发生改变，而得到一个截然不同的蛋白质产物，这种变化就是移码突变。如果发生突变形成了终止密码子，就会产生提前终止的、不完整的蛋白质，即无意义突变。其可分三种情况：琥珀突变(amber)，原来的密码子突变为UAG；赭石突变(ochre)，原来的密码子突变为UAA；乳白石突变(opal)，原来的密码子突变为UGA。 4．为了使外源基因在原核细胞中高效表达应利用蛋白酶缺陷型的宿主，如用lon营养缺陷 型减少外源蛋白的降解。因为黄嘌呤核苷(1on)是大肠杆菌合成蛋白酶的主要底物。lon营养缺陷型宿主不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶。

第二节 外源基因的诱导表达 一、实验目的 了解诱导外源基因表达的基本原理，学习和掌握诱导外源基因表达的常用的方法，为SDS-PAGE分析做准备。 二、实验原理 外源基因在原核生物中高效表达除了有适合的载体外，还必须有适合的宿主菌以及一定的诱导因素。宿主菌的选择对外源基因的表达是至关重要的，因为外源基因(特别是真核基因)在细菌中的表达往往不够稳定，常常被细菌中的蛋白酶降解。因此有必要对细菌菌株进行改造，使其蛋白酶的合成受阻，从而使表达的蛋白得到保护。实验中常用的宿主菌是经过改造的JMl09、BL21等大肠杆菌菌株。