第3章 农业微生物技术

微生物培养基
培养基是以人工方法按照微生物的需要， 用多种物质调制而成的适合不同微生物生 长繁殖或积累代谢产物需要的一种营养基 质。
天然培养基
培 养 基 半合成培养基 合成培养基 培 养 基 固体培养基
液体培养基 半固体培养基
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第二节 农业微生物分离技术
一、微生物分离概述 二、土壤中细菌的分离 （以分离芽孢杆菌为例） 三、植物上的真菌分离 （以叶片病原菌分离为例）
（五）土壤中细菌分离的注意事项
（1）采集来的样品应及时进行分离，不能立刻分 离的应放于4℃冰箱中保存，保存时间不得超过 24h。原因是微生物区系时刻发生着变化，越早 分离越能分出原生态系中的菌种，减少由于环境 变化引起的杂菌滋生。 （2）土样浸提液水浴温度不可高于75℃（非芽孢 菌不要水浴），时间不得少于10 min，原因是温 度过高会使一些耐热性较差的芽孢死亡，水浴时 间过少，非芽孢菌存活下来的较多，造成分离的 困难。
5.纯化
挑取培养平板上长出的乳白色菌落，接 种到试管斜面上，30℃下培养，24h后观察， 如发现菌落生长不均一，重复稀释法，直 至纯化至满意为止。
6.鉴定及性能测试
根据细菌鉴定方法 对细菌进行鉴定， 并对有意义的生产性状进行进一步地研究。
（四）土壤中细菌分离操作要点
（1）梯度稀释操作时，应注意每个稀释度的 样品一定要摇匀。 （2）移液管口部灭菌前，要放置棉花，用报 纸包扎好，灭菌备用。棉花可以起到过滤 保护的作用。 （3）从每个梯度取样时，应注意每个梯度更 换一支无菌移液管，防止交叉感染。 （4）涂布平板时，涂布器在培养皿中要正转 三圈，反转三圈，涂布均匀。
四、微生物生活史
——原核微生物生活史
细菌的生活史
四、微生物生活史 ——原核微生物生活史
放线菌（链霉菌）生活史
四、微生物生活史
——真核微生物生活史
酵母菌生活史
四、微生物生活史
——真核微生物生活史
根霉生活史
曲霉的生活史（繁殖）
丝状真菌各亚门比较表
五、微生物营养
• 营养物质：碳源、氮源、无机盐、生长因 子、能量和。 • 类型：根据所需的碳源和能源的不同，分 为光能自养型、光能异养型、化能自养型、 化能异养型四种营养类型
酵母菌的菌落特征
酵母菌的菌落形状与细菌的菌落相似，但 比细菌菌落大而厚，多数不透明，一般为圆 形，表面光滑、黏稠、湿润呈油脂状，多数 为乳白色，少数为粉红色或红色，用接种针 很容易从菌落中将菌挑起。培养时间较长的 菌落，表面呈皱纹状，较干燥，颜色往往变 暗。
霉菌的菌落特征
霉菌的菌落由无数分支状菌丝体组成， 呈绒毛状，棉絮状或蜘蛛网状，一般比细菌 菌落大几倍至几十倍。在固体培养基上，霉 菌菌落一般比较疏松，有些生长快的种类， 能迅速蔓延扩展；有些种类生长则有局限性。 菌落最初呈白色或浅色，这是菌丝的颜色。 随后从菌落的中央逐渐向外扩展，在菌丝上 长出各种颜色的孢子，有时菌丝也能分泌一 些色素，扩散到培养基内。所以不同霉菌在 培养基的正面和反面显示出不同颜色，这些 特征是鉴别霉菌的重要依据。
（二）优势菌的分离思路
细菌和单细胞微生物可以进行稀释，从 而使得每一个细胞繁殖形成单菌落，进行 分离；而丝状真菌可以进行孢子稀释，进 而繁殖形成单菌落，在菌落还没产生孢子 前，将平板上的单菌落挑出，进而得到纯 化。
思考一下：
优势菌还有其他分离方法了没有？
对于有些菌种的分离也可以采用选择分 离和鉴别分离的方法。 例如，大肠杆菌可以采用EMB培养基 （伊红美蓝培养基）进行分离；分离真菌 时可以在培养基中加入孟加拉红抑制细菌 生长，有助于分离的进行。
三、植物上的真菌的分离
（一）工具准备 （二）技术路线 （三）分离步骤（方案实施） （四）土壤中细菌分离操作要点 （五）土壤中细菌分离的注意事项
（一）工具准备
真菌分离所需的常规工具与细菌基本一 致，此外还需要解剖刀、0.1%的升汞溶液、 75%酒精等。 使用的工具 和细菌分离 工具有区别 吗？
（二）技术路线
一、微生物分离概述
（一）菌种分离的方法和种类 （二）优势菌的分离思路 （三）不占优势菌的分离思路
（一）菌种分离的方法和种类
• 分离的概念：将特定的微生物个体从群体中或从混 杂的微生物群体中分离出来的技术叫做分离。 • 纯化的概念：在特定环境中只让一种来自同一祖先 的微生物群体生存的技术叫做纯化。 • 分离的方法：细菌和单细胞微生物分离常常采用稀 释法和鉴别分离法，稀释法中的稀释涂布平板法、 平板划线法、稀释摇管法较为常用，而鉴别分离法 以鉴别培养基分离技术较为常见； • 丝状真菌和放线菌分离常常采用组织分离法、孢 子分离法、饵诱法等等。
微生物的命名法则
• 采用林奈双名法，此为国际命名法规，即每一微 生物的学名都依属与种而命名，即属名 + 种名 + （首次定名人）+ 现定名人 + 定名年份。 • 属名：拉丁文的名词或作名词的形容词，字首大 写，表示微生物的主要特点。 • 种名：为拉丁文形容词，为微生物次要特征，字 首小写。
Escherichia coli（大肠杆菌）
查资料、定方案 植物采样 植物样品 预处理 分离 纯化 鉴定 性能测 定
细菌分离的 技术路线是 什么？
（三）植物上的真菌分离步骤
1.查资料、定方案 2. 植物采样 采样样品时的天气最好选择阴天多 云的日子，选择采集典型的病部叶片， 叶斑病害应取病健交界处进行分离。样 品应尽快送往实验室分离。
放线菌的菌落特征
放线菌在固体培养基上一般为圆形、平 坦或有皱褶，边缘有辐射状菌丝，质地紧 密、坚实、不能无限扩张，形成孢子后， 表面呈粉末状。 由于菌丝和孢子都具有色素，故菌落表 面和背面的颜色往往不同。正面是孢子丝 和孢子层的颜色，不同种类具有不同而稳 定的色泽；背面是营养菌丝以及它们所分 泌色素的颜色。
3.植物样品预处理
采集的叶片，先 用洁净的清水洗去叶 片上的灰尘和杂物， 晾干备用。
4. 分离
取真菌性叶斑病的新鲜病叶，用剪刀剪 取病健交界处的组织(边长4～5mm)数块；将 病组织放入70%酒精中浸3～5s后，将病组织 在0.1%升汞(氯化汞)液中消毒1min，然后在 无菌水中连续漂洗3次，除去表面残留的消毒 剂；按无菌操作规程将病组织移入平板培养 基表面上，一般每皿放4～5块，并用玻璃铅 笔注明培养材料的编号和种类；将平板培养 基倒置后放入恒温箱内，在25℃下培养3～4 d后，将分离的目的菌在无菌条件下移入斜面 培养基上，淘汰杂菌。
三、微生物结构
（一）原核微生物的结构 细菌的细胞一般具有细胞壁、细胞膜、 细胞质及原核等基本结构。有些还具有鞭 毛、荚膜、芽孢等特殊结构 （二）真核微生物的结构 酵母菌细胞由细胞壁、细胞膜、原生质、 细胞核和其他内含物组成。 霉菌菌丝细胞的构造同酵母菌细胞相似， 菌丝隔膜的中央有极小的孔，细胞质或养 料可互相沟通，细胞核也可以通过。
第3章 农业微生物技术
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 农业微生物概述 农业微生物分离技术 农业微生物保藏技术 农业微生物培养技术 微生物应用实例
第一节 农业微生物概述
一、微生物分类 二、微生物形态与大小 三、微生物结构 四、微生物生活史 五、微生物营养代谢
一、微生物分类
（一）微生物定义 （二）微生物的分类
（二）技术路线
查资料、定方案 采样 样品预处理 分离 纯化 鉴定 性能测定
（三）土壤中细菌分离步骤
1.查资料、定方案 2.土壤样品采样
土壤样品采样
3.土壤样品预处理
将样品放到事先灭菌的研钵中研碎混匀， 取5g置于事先放入玻璃珠的无菌三角瓶中， 加入无菌水100mL，振荡摇匀5min，3层纱布 过滤，取滤液备用。
4.稀释分离
首先，将制备好的菌悬液，置于60℃水 浴15min，进行梯度稀释（10-1，10-2， 10-3……10-10），涂布于事先制备好的NA 平板（牛肉膏蛋白胨培养基）上，然后 30℃下培养，24h后观察 。
培养基平板制备
称量药品→融化药品→调pH（细菌7.0， 真菌6.5）→过滤→分装→加塞→包扎→灭 菌。
二、土壤中细菌的分离
（一）工具准备 （二）技术路线 （三）分离步骤（方案实施） （四）土壤中细菌分离操作要点 （五）土壤中细菌分离的注意事项
（一）工具准备
小锅、天平、电炉、pH纸、漏斗、纱布、 棉花、橡皮筋、试管、培养皿、灭菌锅、 报纸、1 mL移液管、琼脂、牛肉膏、蛋白 胨、NaCl、涂布棒等
（一）微生物定义
微生物是指大量的、极其多样的、不借 助显微镜看不见的微小生物类群的总称。 通常包括病毒、亚病毒（类病毒、拟病 毒、朊病毒）、具原核细胞结构的真细菌、 古生菌以及具真核细胞结构的真菌（酵母、 霉菌、蕈菌等）、原生动物和单细胞藻类。
（二）微生物的分类
原核生物
细胞生物
真细菌、古细菌
简 单 分 类
霉菌的形态
霉菌的形态
霉菌的形态
微生物的形态 ——担子菌
担子菌和霉菌一样，也形成绒毛状的菌 丝体，并能进一步形成大型子实体
（二）微生物的大小
• 细菌中单个球菌的直径多为０.５～１μm， 杆菌多为（０.５～１）μm ×５μm， 螺旋菌多为（０.５～２）μm ×（１～５０）μm。 • 放线菌的菌丝，宽度１μm 左右，无横隔。 • 酵母菌比细菌大得多，宽１～５μm ，长５～３０μm。 • 霉菌的菌丝，粗细不一，一般宽５～10μm ，少数小 至０.５μm，大到100μm。
细菌的细胞结构图
酵母菌的细胞结构图
霉菌的细胞结构图
原核微生物和真核微生物的差别
●一是原核微生物的核是拟核（细胞的核质外 没有核膜包围），而真核微生物的核是真正意 义上的核，所以称为真核（由核膜将细胞核与 细胞质分开） ●二是两者的繁殖方式不同，细菌常常通过二 分裂方式繁殖，真菌常通过孢子进行繁殖，需 要注意的是放线菌虽然属于原核微生物，但也 通过产孢丝产生孢子进行繁殖。