GsDREB1基因的电子克隆及体内结合特异性分析[1]
小麦Ta—UBX1基因的电子克隆和生物信息学分析
Ａ Ａ ＣＡ ＴＡＣ ＧＡ Ｃ Ｃ （ ＣＣ ＡＴ ＴＩｒ Ｔ Ｔ Ｔ ＧＧ ＴＡ ＣＡ Ｇ ＡＡ Ｃ ＧＡ Ｃ Ａ Ａ Ｃ Ｇ ＡＧ ＡＧ Ｃ
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酶Ｅ ４的原 型 — — 酵 母 中 的 蛋 白 Ｕ Ｄ 的 碳 末 端 鉴 定 出 来 Ｆ２
物信息学相关软件对其 进行生物信 息学综合分 析 ， 为进一步 研究在小麦发育过程 中的调节作用提供理论基础 。
１ 材 料 与 方 法 １ １ 小麦 Ｕ — ｏ ． ｂｘ蛋 白基 因的 电子 克 隆
Ｈ Ｃ Ｅ 、 Ｉ Ｇ—ｆ ｇｒＥ 、 —ｂｘＥ 。 Ｕ —ｂｘ域 是 决 定 Ｅ Ｔ ３ＲＮ ｉ ｅ ３ Ｕ ｎ ｏ ３ ｏ
关于植物 Ｕ—ｂｘ蛋 白基 因序列 的报道 较多 ， ｏ 但有 关小 麦 Ｕ— ｏ ｂｘ蛋白基 因克 隆的研究 目前 尚未见 报道。本 研究在 前期工作基础上 ， １个在小麦生理 型不 育花药 中上调表 以
分 析
雄性不育与油菜遗传育种研 究。Ｅ— ａ ：ｊ ０ ９ ６ ．ｏ 。 ｍ ｉ ｗ ｓ ９ ＠１３ ｃｒ ｌ ０ ｎ 通信作者 ： 李成伟 ， 博士 ， 教授。Ｅ— ａ ：ｃｅ ｇ ｅ ｋ ｕ ｅｕ ｃ 。 ｍ ｉ ｌｈｎｗ ｉ ｎ ．ｄ ．ｎ ｌｉ ＠ｚ
以小麦序列 Ｔ Ｆ ６ Ｄ ２ ９作为种子序列 ， 利用软件 ＢＯ ｄｔ Ｉ Ｅ ｉ电
的 。 目前 已鉴定 出的真核生 物 的 Ｕ—ｂｘ蛋 白中， ｏ 酵母 体
内发 现 ２种 ， 物 中有 ６种 ， 动 而拟 南 芥 中有 ３ 该 类 蛋 白 Ｊ ７种 。
中国人β神经生长因子前体基因的克隆及其序列分析
中国人β神经生长因子前体基因的克隆及其序列分析
童贻刚
【期刊名称】《中国应用生理学杂志》
【年(卷),期】1997(000)004
【摘要】从正常人外周血白细胞中提取基因组ＤＮＡ，用ＰＣＲ扩增神经生长因子（ＮＧＦ）β亚基前体有全长编码区序列，将其克隆到了Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ上，取两个独立的克隆采用自动测序集镇以链ＤＮＡ双向测序，结果表明，两个凶隆的序列完全相同，该序列国外报道的ＮＧＦ序列有一个碱基的差别，从而导致ＮＧＦ前导肽中一个氨基酸的改变，而成熟的ＮＧＦ序列没有改变。
【总页数】1页(P316)
【作者】童贻刚
【作者单位】军事医学科学院微生物流行病研究所;军事医学科学院微生物流行病研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q593.2
【相关文献】
1.中国人β神经生长因子基因的分子克隆,序列分析及其在哺乳… [J], 王爱坤;刘哲伟
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4.中国人神经生长因子基因(β-NGF)的扩增、克隆及序列分析 [J], 李御宇;黄秉仁;蔡良琬
5.口蹄疫病毒衣壳蛋自前体P1基因和蛋白酶3C基因的克隆及序列分析 [J], 韦婷;郑敏;刘棋;李雪梅;李铁征;张洪勇;郭志儒;夏志平;金宁一
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抗黄曲霉毒素B1单链抗体基因克隆及其结构分析
抗黄曲霉毒素B1单链抗体基因克隆及其结构分析作者：马兰刘爱平王佳王小红来源：《南方农业学报》2017年第11期摘要：[目的]克隆构建黄曲霉毒素B1（AFB1）单链抗体（scFv）基因，并对其编码蛋白序列和结构进行分析预测，为scFv分子修饰改造及在免疫学检测中的应用提供参考依据。
[方法]以抗AFBl单克隆抗体杂交瘤细胞株为原料，通过PCR扩增重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），以（Gly4Ser），为柔性接头（Linker）拼接构建抗AFBlscFv基因，并采用在线生物信息学分析软件对其氨基酸序列、理化性质及蛋白结构进行分析预测。
[结果]抗AFBlscFv 基因全长744bp，编码248个氨基酸，分子量为26312.05Da，理论等电点（pI）5.70，其二级结构中含有35个α-螺旋（占14.11%）、28个β-折叠（占11.29%）、85个延伸链（占34.28%）和100个随机卷曲（占40.32%），在三级结构中连接肽卷曲将VH和VL区域牵拉而相互靠近，形成典型的抗体结构——沟槽结构，是scFv的抗原结合区域。
[结论]构建的抗AFBlscFv其VH含有117个氨基酸、VL含有116个氨基酸，具备典型抗体结构——沟槽结构，能与抗原特异性结合。
关键词：黄曲霉毒素B1（AFB1）；单链抗体（scFv）；重链可变区（vH）；轻链可变区（VL）；沟槽结构中图分类号：S859.87 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）11-2064-070引言[研究意义]黄曲霉毒素（Anatoxins，AFTs）是由黄曲霉（Aspergillusflavus）、寄生曲霉（A.parasiti-CUS）等真菌产生的有毒次级代谢产物，至今共发现20多种黄曲霉毒素及其衍生物（Delmulleeta1.，2005；李鑫等，2012a），其中以黄曲霉毒素B1（AFBl）的毒性最强，已被世界卫生组织癌症研究机构列为I类致癌物质（庄振宏等，2011）。
不同型Gs_基因缺失体在大肠杆菌中的克隆与表达
不同型G sα基因缺失体在大肠杆菌中的克隆与表达楼金星 黄君健1 司艺玲2 李杰之1 赵亚力2 叶棋浓1 黄翠芬1(北京军区总医院血液科 北京 100700)摘要 在人类的一些肿瘤中已发现存在G sα基因突变。
本研究室在白血病细胞系的研究中发现了G sα基因的3个缺失突变体以及野生型的G sα(分别命名为G sαL21,500bp;G sαL22,300bp;G sαL23, 200bp和G sα24,1200bp),并已在一些急性白血病患者中检测到。
为进一步研究这些缺失体的结构、功能和生物学意义,作者将克隆了G sαL21,G sαL22和G sα24基因的质粒分别转化到大肠杆菌DH5α中,提取DNA,采用特异引物进行PCR扩增,获得相应的目的基因,分别将其克隆到p ET22b(+)表达载体上,再转化大肠杆菌进行表达。
经培养,取菌体行SDS2PAGE电泳分析。
研究结果:3个基因都有相应分子量的蛋白表达,且均以包涵体形式存在。
这表明构建的这3个基因确具完整的基因结构,及相应的蛋白表达。
本研究为进一步研究它们的功能及其与白血病发生的关系打下了基础。
关键词 Gsα基因 基因缺失体 基因克隆 基因表达 大肠杆菌 G sα是研究最多、与临床关系最密切的一种G蛋白,其主要功能是将受体接受的信号转导给腺苷酸环化酶(AC),使AC激活,同时也可直接作用于离子通道而发挥作用。
G sα基因发生突变或转录产物发生异常剪接会导致疾病发生[1]。
在肿瘤中已经发现存在G sα基因突变[2-5]。
在本研究中分别以来自Jurkat 细胞株的人白血病文库cDNA和人白血病细胞株HL260的mRNA反转录后的cDNA第一链为模板, PCR扩增出G sα基因完整编码区(命名为G sαL21, 500bp),又在随后的白血病细胞中扩增出除500b p 以外的其他条带,长度分别为300,200和1200 bp[6,7]。
序列分析表明,1200bp即是野生型的G sα(命名为G sα24),而另外3种G sα均为不改变阅读框架的不同缺失体,其中500bp的缺失了野生型G sα的第23-249个氨基酸和第254-260个氨基酸间的两个区域;300bp的缺失了第34-337个氨基酸间的区域;200bp的缺失了第6-329个氨基酸间的区域。
大豆组织特异启动子的克隆与功能分析
大豆组织特异启动子的克隆与功能分析曹译文;宋阳;渠可心;王丕武【摘要】采用同源序列法克隆得到了大豆根部特异性启动子、种皮特异性启动子、种子特异性启动子,核苷酸序列大小分别为2 500bp、1 832bp、1 268bp,分别具有CANNTG-motifs、GATA-box、ACGT等启动子表达元件,并分别构建了这3个组织特异性启动子的植物报告表达载体.通过农杆菌介导法将3个表达载体转入烟草NC89,通过组织化学染色和GUS基因的相对表达量分析验证3个启动子的功能.通过转化获得了根部特异性启动子转基因烟草植株11株,种皮特异性启动子转基因烟草植株4株,种子特异性启动子转基因烟草植株8株,转35S启动子启动GUS基因的阳性烟草植株7株.GUS化学组织染色结果表明,克隆得到的根、种皮、种子特异性启动子都表现为组织特异性表达,表达水平明显高于叶片、茎部、花等部位.进一步的荧光定量PCR结果显示,根部特异性启动子GUS的相对表达量在根部最高,而在茎、叶、种子、种皮、花中表达量较低;种皮部特异性启动子GUS的相对表达量在种皮最高,而在根、茎、叶、种子、花中表达量较低;种子特异性启动子GUS的相对表达量在种子最高,而在根、茎、叶、种皮、花中表达量较低,但是与35S启动子相比,这3个特异性启动子的GUS相对表达量在相应的组织均低于35S启动子.%In this study,the soybean root specific promoter,seed specific promoter and seed coat specific promoter were cloned by homologous sequence method respectively.Their sizes were 2 500bp,1 832bp and 1268bp.They had different expression elements including CANNTG-motifs,GATA-box,ACGT.Three plant expression vectors of these tissue specific promoters were constructed and transferred into Nicotiana tabacum NC89 by Agrobacterium-mediated method to prove GUS activityof different promoters.Soybean root,seed coat and seed specific promoter nucleotide sequence were isolated by PCR method.Then 11 root specific promoter transgenic plants,4 seed coat specific promoter transgenic plants,8 seed specific promoter transgenic plants,and 7 35S-promotertransgenic plants had been obtained.GUS activity assays indicated that GUS gene expression level in root,seed and seed coat were higher than leaf,shoot and flower.Further quantitative real time PCR results showed that the expression levels of GUS gene of root specific promoter in root were higher than those in stem,leaf,seed,seed coat and flower;the expression levels of GUS gene of seed coat specific promoter in seed coat were higher than those in root,stem,leaf,seed and flower;the expression levels of GUS gene of seed specific promoter in seed were higher than those in root,stem,leaf,seed coat and flower.But the expression levels of GUS of these three tissue specific promoters were lower than those of 35S promoter in each tissues.【期刊名称】《中国油料作物学报》【年(卷),期】2017(039)006【总页数】7页(P771-777)【关键词】启动子;组织特异性;基因表达;相对表达量分析【作者】曹译文;宋阳;渠可心;王丕武【作者单位】吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118【正文语种】中文【中图分类】S565.103启动子是调控目的基因的重要顺式作用元件。
野生大豆GsGSK1基因的克隆及遗传转化
野生大豆GsGSK1基因的克隆及遗传转化张春宝;谭化;赵丽梅;彭浩;吕龙石【摘要】Using homologous cloning and RT-PCR technology,a glycogen synthase kinase family gene,GsGSKl was isolated from wild soybean. It is 1 233 bp in length with one ORF of 410 amino acids. Compared the nucleotide sequence with GmGSK,these two genes havell SNPs,in which 10 SNPs are synonymous mutations, and 1 SNP is non-synonymous mutation, with a homology of 99. 1%. Then constructed the recombinant plant expression vector pCAMBIA3300-GsGSK1 and transformed it into arabidopsis by agrobacterium mediated method. T1 transgenic plant had been acquired, which will be supplied the basic materials for further identification of gene function in GsGSK1.%以野生大豆为材料,采用同源克隆方法和RT-PCR技术获得一个野生大豆糖原合成酶激酶类基因的全长cDNA(命名为GsGSK1).该基因的ORF为1233 bp,推断其编码410氨基酸的多肽.将此基因和与大豆糖原合成酶激酶基因的核苷酸序列比较发现二者有11个核苷酸SNP位点差异,其中,10个为同义突变,1个为非同义突变,同源性达到99.1％.通过构建重组植物表达载体pCAMBIA3300-GsGSK1,将该基因通过农杆菌介导法转入拟南芥,获得了T1抗性苗,为进一步鉴定GsGSK1的基因功能提供了试验基础.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2012(027)005【总页数】6页(P22-27)【关键词】糖原合成酶激酶;野生大豆;转基因拟南芥;抗逆性【作者】张春宝;谭化;赵丽梅;彭浩;吕龙石【作者单位】吉林省农业科学院大豆研究所,吉林长春 130033;吉林省农业科学院大豆研究所,吉林长春 130033;吉林省农业科学院大豆研究所,吉林长春 130033;延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉133002【正文语种】中文【中图分类】Q785糖原合成酶激酶(GSK-3)是一种丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，广泛存在于真核生物中[1]。
利用电子克隆技术获得基因
利用电子克隆技术获得基因【实验目的】1．理解电子克隆的原理和应用。
2．掌握利用生物信息数据库进行电子克隆的操作过程。
【实验原理】基于表达序列标签（expressed sequence tags，ESTs）的电子克隆（in silico cloning）策略，是近年来发展起来的一门快速克隆基因的新技术，其技术核心是利用计算机技术，依托现有的网络生物信息数据资源EST数据库、核苷酸数据库、蛋白质数据库、基因组数据库等，采用生物信息学方法（包括同源性搜索、聚类分析、序列拼接等）组装延伸ESTs序列，以期获得部分乃至全长cDNA序列的一种方法。
进一步利用RT-PCR的方法进行克隆分析、验证。
随着EST数据库的进一步完善，电子克隆策略已成为克隆新基因的重要方法，并成功地应用于人类基因组的研究。
利用EST资料的电子克隆是克隆功能基因的新途径，与传统的基因克隆方法相比，具有快捷、成本低、针对性强等特点，但也受到dbEST的EST数量和质量的限制，因此在EST资料非常丰富的模式物种（如人、鼠等）中应用较多。
在实际应用中，以模式物种某一已知基因序列为起点，结合目标物种EST 数据库，采用现代生物信息学及实验验证相结合的技术方法，尤其是通过同源性比较完全有可能快速筛选到一些具有重要功能的基因。
电子克隆的方法与策略（图5-1）：1. 选择感兴趣的EST作为查询探针，查询dbEST数据库，找到部分重叠的EST同源序列（以长度≥100 bp，同源性50 %以上，85 %以下为标准）。
2. 对找到的同源序列进行拼接，得到EST重叠群（EST conting）。
3. 以拼接好的EST conting为新的查询探针，继续搜索dbEST数据库，直到没有新的EST可供拼接为止，获得全长的基因编码序列。
4. 获得的EST序列数据与GenBank数据库进行相似性检验。
如果没有精确匹配基因，可将EST序列数据按六种阅读框翻译成蛋白质序列再进行相似性检验。
火炬松DREB1基因的电子克隆与生物信息学分析
重复序列等 ， 结果发 现， 该序列与其他物种 中克隆得到 的 Ｄ Ｅ Ｉ具有较高 的 同源性 ， ＲＢ 初步 断定 所 电子克 隆得到 的 ｃ Ｎ Ｄ Ａ序 列
为火炬松 Ｄ Ｅ １基 因（ ｔ Ｄ Ｅ １ 。在 此基 础上， ＲＢ Ｐｅ Ｒ Ｂ ） ａ 利用 网上 的公共数据库和相 关软件 （ ｎｈｐｏ 等 ） ＰｅＤ Ｅ １编码 的理 Ａ ｔ ｒｔ 对 ｔａ Ｒ Ｂ ｅ 化性质和一级结构进行分析 ， 并模 拟 了其二级结构和三级结构。结果表明 ， 该蛋 白为疏水性 非球形可溶蛋 白， 含有 ２ ５个氨基 ９ 酸 ， 子量为 ３ ． ｋ 等 电点为 ８ ２ ； 二级结构 以螺 旋和卷 曲为主 ， 分 ２４ Ｄ， ．２ 其 三级 结构具 有 Ｄ Ｅ Ｒ Ｂ蛋 白家族 中典 型 的结合 Ｄ Ａ 的 Ｎ
３ ｌｎ ｔ ｉｓ ｏ ｏ ｎ ａｅ ｏｓｒａｉ ，Ｍｉｉｒ ｔｒ ｅ ｕｃｓ Ｂ ｎ １ ０３ Ｃ ｉａ ．Ｐａ ｔ ｅａ ｆｒＳｉａ ｄＷ ｔ Ｃ ｎｅｖｔ ｎ Ｍａ ｒ ｌ ｌ ｒ ｏ ｎｓ ｏ Ｗａｅ Ｒｓ ｒｅ， ｅ ｇ ００ ８，ｈｎ ） ｔ ｆ ｙ ｏ
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GsDREB 1基因的电子克隆及体内结合特异性分析摘要：应用电子克隆技术预测到了一个5＇端缺失的contig5，并根据栽培大豆与野生大豆相关基因相似性很高的特点，将GmDREB 1基因的5＇端序列填补到contig5片段的5＇端上，此序列命名为contig5Gm 。
ORF 预测结果表明，contig5Gm 只有一个开放阅读框。
经RT-PCR 验证，分别得到了与contig5和contig5Gm 大小一致的片段。
经克隆、测序发现，contig5Gm 与GmDREB 1基因序列相似性为99％，将其命名为GsDREB1。
利用酵母单杂交系统对GsDREB1进行了体内结合特异性分析，结果表明，GsDREB1能够与DRE 顺式作用元件发生特异性结合。
关键词：DREB ；电子克隆；野生大豆；结合特异性；转录因子中图分类号：Q786；Q785文献标识码：A收稿日期：2008-03-03基金项目：国家重大基础研究专项（973）前期项目（2003CCA03500）作者简介：李莹（1980-），女，吉林人，硕士研究生，研究方向为植物基因工程与分子生物学。
*通讯作者E-mail:lijie_neau@转录因子又称反式作用因子，能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用，通过它们之间以及其他相关蛋白之间的相互作用激活或抑制转录［１］。
ＤＲＥＢ蛋白含有ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ保守结构域，是一种极其重要的转录因子，广泛存在于被子植物中。
多数ＤＲＥＢ类转录因子，如拟南芥ＤＲＥＢ１／２含有一个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结构域［２－４］，通过与ＤＲＥ顺式作用元件相互作用调控相关基因表达［５］。
目前在拟南芥中发现６种DREB １基因和８种DREB ２基因。
ＤＲＥＢ１Ａ、ＤＲＥＢ１Ｂ和ＤＲＥＢ１Ｃ诱导冷胁迫相关基因的表达，ＣＢＦ４／ＤＲＥＢ１Ｄ与ＤＲＥＢ１Ａ有很高的同源性，含有完整的ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结构域，但是ＣＢＦ４／ＤＲＥＢ１Ｄ却只受冷胁迫以外的其他渗透胁迫诱导［６－７］，ＤＤＦ１／ＤＲＥＢ１Ｆ和ＤＤＦ２／ＤＲＥＢ１Ｅ受高盐胁迫诱导［７－８］。
ＤＲＥＢ２Ａ和ＤＲＥＢ２Ｂ同时受干旱胁迫和高盐胁迫诱导［４］。
ＤＲＥＢ２Ｃ、ＤＲＥＢ２Ｄ和ＤＲＥＢ２Ｆ在叶子中被高盐胁迫诱导，ＤＲＥＢ２Ｅ只受ＡＢＡ诱导，在根中有少量表达。
Ｓａｋｕｍａ等发现ＤＲＥＢ２Ｇ和ＤＲＥＢ２Ｈ在干旱和冷胁迫诱导下并不表达［７］。
最近，Ｓａｋｕｍａ等发现，ＤＲＥＢ２Ａ的Ｃ末端区域是转录激活区，它的中间区域是负调控结构域［９］。
以上研究表明，ＤＲＥＢ类转录因子基因有着相当复杂的调控机制，克隆新的DREB 基因对于阐明ＤＲＥＢ类转录因子的调控机制和植物抗渗透胁迫基因工程都有着重要的意义。
随着人类基因组测序和生物信息学技术的迅猛发展，表达序列标签（ＥＳＴ）成为人类寻找未知功能基因和克隆不同时空差异表达基因的重要途径。
基于ＥＳＴ的电子克隆（in silico ｃｌｏｎｉｎｇ）策略已成为克隆新基因的主要方法。
电子克隆的技术原理是利用日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能力，通过ＥＳＴ或基因组的序列组装和拼接，利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法快速地获得新基因［１０］。
由于受到序列数据丰富度的限制，在植物领域基因克隆仍以常规的实验方法为主，但随着ＥＳＴ数据库的不断完善，利用生物信息学的方法进行某些植物基因的电子克隆已经成为可能［１１］。
本试验拟应用电子克隆技术，在耐盐野生大豆中克隆ＤＲＥＢ类转录因子基因，为ＤＲＥＢ类转录因子的调控机理研究和应用研究奠定基础。
１材料与方法1.1材料1.1.1植物材料耐盐野生大豆５０１０９，由吉林省农科院提供。
李莹，才华，李勇，李杰*，刘西燕，田佳（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）第３9卷第11期东北农业大学学报39(11):56~61２００8年11月Journal of Northeast Agricultural UniversityNov.2008文章编号１００５－９３６９（２００8）11－0056－061.1.2载体和试剂克隆载体ｐＭＤ１８Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ（购自ＴａＫａＲａ）；大肠杆菌菌（E.coli）菌株ＤＨ５α；Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳＳⅢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；其它试剂均为国产分析纯。
ｐＨＩＳ２和ｐＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ２均购自ＢＤ公司；３－ＡＴ购自Ｓｉｇｍａ；ｐＨＩＳ２－ＤＲＥ和ｐＨＩＳ２－ｍＤＲＥ质粒由本实验室保存。
1.2方法1.2.1GsDREB1基因的电子克隆通过查阅文献，寻找在栽培大豆中已经克隆到的ＤＲＥＢ类转录因子基因。
以所找到的ＤＲＥＢ类转录因子基因序列为种子，以Glycine soja为限制词，在ＮＣＢＩ上的ＥＳＴ＿ｏｔｈｅｒｓ数据库中进行数据搜索，获得相关的ＥＳＴ序列。
应用ＣｏｎｔｉｇＥｘｐｒｅｓｓ拼接软件对所获得的ＥＳＴ进行序列拼接，把拼接得到ｃｏｎｔｉｇｓ分别进行Ｂｌａｓｔｎ比对，根据比对结果，选出可能是ＤＲＥＢ类转录因子基因的ｃｏｎｔｉｇｓ，对其进行全长和ＯＲＦ预测。
1.2.2RT-PCR验证取经２５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＣｌ处理２ｈ后的１月龄野生大豆幼苗叶片，用Ｔｒｉｚｏｌ试剂一步法提取植物总ＲＮＡ。
以总ＲＮＡ为模板，经反转录得到ｃＤＮＡ（具体操作参见产品说明书）。
根据ｃｏｎｔｉｇ５序列设计１对引物来验证拼接结果的正确性（见图１），同时在延伸序列ｃｏｎｔｉｇ５Ｇｍ两端设计验证引物，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增目的片段，而后进行基因克隆、测序。
引物序列如下：C5Gssense：5＇AACGAGGAAGGTGGTGGAG3＇C5Gsanti1：5＇ACTCCGAGGCATCATCATCT3＇C5Gmsense1：5＇AATCCGTTATATGCCACCTGA3＇C5Gmsense2：5＇AACCATGGAAGACAGGGATC3＇1.2.3GsDREB1体内结合特异性分析首先通过ＰＣＲ扩增ＤＲＥＢ转录因子基因的结构域并引入同源重组位点。
根据GsDREB１基因结构域序列，设计引入同源重组位点序列的引物，注意不能使结构域序列在翻译时产生移码，一次ＰＣＲ引物序列如下（下划线部分为第一次ＰＣＲ引入同源重组位点序列）：图1引物设计Fig.1Primer designＣＺＧｓＤＲＥＢ１ｓｅｎｓｅ：５＇ＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＡＴＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡＡＣ３＇ＣＺＧｓＤＲＥＢ１ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ：５＇ＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＡＡＧ３＇将一次ＰＣＲ产物稀释１００倍后为模板，进行二次ＰＣＲ扩增目的片段，二次ＰＣＲ引物序列如下（下划线部分为第二次ＰＣＲ引入同源重组位点序列）：ＳＭＡＲＴⅢ：５＇ＴＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＡＴＧＧＣＣＣ３＇ＣＤＳⅢ：５＇ＧＴＡＴＣＧＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ３＇将ｐＨＩＳ２－ｍＤＲＥ和ｐＨＩＳ２－ＤＲＥ载体分别与ｐＧ－ＡＤＴ７－Ｒｅｃ２载体和ＧｓＤＲＥＢ１结构域组合（见表１），共同转入酵母感受态细胞中。
ｐＨＩＳ２－ｍＤＲＥ为含有突变ＤＲＥ元件的载体，ｐＨＩＳ２－ＤＲＥ为含有ＤＲＥ元件的载体，ＤＲＥ元件序列为ＴＡＣＣＧＡＣＡＴ，ｍＤＲＥ元件序列为ＴＡＴＴＴＴＣＡＴ。
将转化混合液分别涂布在含有不同浓度３－ＡＴ的ＳＤ／－Ｈｉｓ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ固体培养基中，３０℃培养１周，并观察菌落在固体培养基上的生长情况。
载体ｐＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ２用ｓｍａｌＩ线性化，质粒ｐＨＩＳ２－ＤＲＥ和ｐＨＩＳ２－ｍＤＲＥ的提取均为分子生物学常规操作，酵母感受态细胞的制备和转化方参见ＢＤＭａｔｃｈｍａｋｅｒＴＭＬｉｂｒａｒｙＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ＆ＳｃｒｅｅｎｉｎｇＫｉｔＵｓｅｒＭａｎｕａｌ。
２结果与分析2.1GsDREB1基因的电子克隆通过查阅文献，获得了５个栽培大豆ＤＲＥＢ类转录因子基因。
在ＮＣＢＩ上搜索这５条转录因子基因序列，基因序列号分别为：GmDREBa（ＡＹ５４２８８６）、GmDREBc（ＡＹ２４４７６０）、GmDREBb（ＡＹ２９６６５１）、GmDREB2（ＤＱ０５４３６３）、GmDREB1（ＡＦ５１４９０８）。
分别以这５条ＤＲＥＢ类转录因子基因序列为种子，以Glycine soja为限制词，在ＮＣＢＩ上的ＥＳＴ＿ｏｔｈｅｒｓ李莹等：GsDREB１基因的电子克隆及体内结合特异性分析第11期·57·图2contig5拼接结果Fig.2Splicing result of contig5数据库中进行搜索，得到了１１条可用的ＥＳＴ，ＥＳＴ序列号分别为ＢＧ０４５８７６、ＢＭ５２０１９１、ＢＧ１５５７０３、ＢＧ０４６６１８、ＤＱ２８８４５２、ＢＧ０４５１１１、ＢＧ０４６８３６、ＢＭ５１９７５１、ＢＧ０４１８２１、ＣＡ７８３６７１、ＣＡ７８６０４１。
使用ＣｏｎｔｉｇＥｘｐｒｅｓｓ拼接软件对这１１条ＥＳＴ进行拼接，得到了５个ｃｏｎｔｉｇｓ。
把拼接得到的５个ｃｏｎｔｉｇｓ分别进行Ｂｌａｓｔｎ比对，发现ｃｏｎｔｉｇ５（见图２）含有ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结构域序列，经ＯＲＦ预测，ｃｏｎ－ｔｉｇ５缺少５＇端片段。
将ｃｏｎｔｉｇ５与GmDREB １进行序列两两比对，结果显示，在ＣＤＳ范围内，ｃｏｎ－ｔｉｇ５比GmDREB １在５＇端缺少部分片段，与ＯＲＦ预测结果相符。
根据栽培大豆与野生大豆相关基因相似性很高的特点，将GmDREB １基因的５＇序列填补到ｃｏｎｔｉｇ５片段的５＇端上，此序列命名为ｃｏｎ－ｔｉｇ５Ｇｍ。
ＯＲＦ预测结果表明，ｃｏｎｔｉｇ５Ｇｍ只有一个开放阅读框。
所以，ｃｏｎｔｉｇ５Ｇｍ可能是一条全长的DREB 基因。
2.2RT-PCR 验证试验以Ｃ５Ｇｓｓｅｎｓｅ与Ｃ５Ｇｓａｎｔｉ１为引物，以野生大豆叶片ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，验证ｃｏｎｔｉｇ５拼接的正确性，得到了预期大小的片段（５４７ｂｐ，见图３），说明拼接结果极有可能是正确的。
分别以Ｃ５Ｇｍｓｅｎｓｅ１与Ｃ５Ｇｓａｎｔｉ１、Ｃ５Ｇｍｓｅｎｓｅ２与Ｃ５Ｇｓａｎｔｉ１为引物，以野生大豆叶片ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，获得了与预期片段大小相符的片段（７０１ｂｐ，见图４），回收片段，连接Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ，ＰＣＲ鉴定选择阳性克隆（见图５），送交测序。
测序结果表明，ｃｏｎｔｉｇ５Ｇｍ与GmDREB １基因只相差２个碱基（见图６），但是在蛋白质序列上完全一致，所以确定我们所获得的基因为ＤＲＥＢ类转录因子基因。
表1GsDREB1的体内结合特异性分析Table 1Analysis of DRE cis -element binding specificity with GsDREB1in yeastA B 线性化4μL线性化4μL2μL2μL 7μL7μL 项目Item pGADT7-Rec2pHIS2-DRE pHIS2-mDRE GsDREB1结构域C 未线性化4μL2μLD 未线性化4μL2μL BM519751BG0468361002003004005002000bp M121000bp 750bp 500bp 250bp 100bpM-DNA 分子质量标准DL2000；1-负对照；2－contig5片段M-DNA Marker DL2000;1－Negative control;2-contig5fragment图3contig5的PCR 验证Fig.3PCR verification of contig52000bp M121000bp 750bp 500bp 250bp 100bpM-DNA分子质量标准DL2000；1-负对照；2－contig5Gm 片段M-DNA Marker DL2000;1－Negative control;2-contig5Gm fragment图4contig5Gm 的PCR 验证Fig.4PCR verification of contig5Gm547bp701bp·58·东北农业大学学报第３9卷2.3GsDREB1体内结合特异性分析应用酵母单杂交系统对ＧｓＤＲＥＢ１进行了体内结合特异性分析，结果如图７所示。