功能基因的克隆及生物信息学研究
牛HSL基因的克隆和生物信息学分析
牛HSL基因的克隆和生物信息学分析刘燕;李赞;田万年【摘要】旨在克隆牛HSL基因的CDS序列,并对该基因进行生物信息学、组织表达谱分析.根据GenBank登录的牛HSL基因序列(NM_001080220)设计1对引物,对牛组织样品中的HSL基因CDS序列进行RT-PCR扩增及序列测定;利用半定量RT-PCR方法检测HSL基因在牛各组织中的表达情况;利用生物信息学软件对其所编码的牛HSL蛋白进行分析.结果显示,获得的牛HSL基因CDS全长为2271 bp,编码756个氨基酸,与GenBank登录的牛HSL基因同源性最高,为99.9％.HSL蛋白含有一个HSL-N superfamily保守结构域,无信号肽结构,具有疏水性.半定量RT-PCR显示,HSL基因在检测的心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肝脏、大网膜、皮下脂肪、肌肉8种组织中均有表达,其中在大网膜和皮下脂肪中表达量较高,在肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、肌肉和心脏中度表达.该试验可为研究牛HSL蛋白的结构和功能提供参考.【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2019(040)006【总页数】4页(P9-12)【关键词】克隆;分析;HSL基因;生物信息学;表达谱;牛【作者】刘燕;李赞;田万年【作者单位】辽宁禾丰牧业股份有限公司,辽宁沈阳 110164;吉林农业科技学院动物科技学院,吉林吉林 132101;吉林农业科技学院动物科技学院,吉林吉林 132101【正文语种】中文【中图分类】Q785;S823.2激素敏感脂酶（hormone sensitive lipase，HSL）是动物脂肪分解的重要酶之一，动物将体内的脂肪酸以甘油三酯的形式储存在脂肪细胞内，HSL能够把动物体内储存的脂肪进行分解，转变为游离脂肪酸和甘油来满足动物机体的需要，是影响机体脂肪代谢的关键酶和限速酶［1-2］。
目前有关猪的HSL 基因序列分析及表达研究研究报道较多［3-5］。
黄艳娜等［6］对陆川猪激素敏感性脂肪酶基因进行了克隆和序列分析。
青杨CCoA OMT基因的克隆及其生物信息学分析
青杨CCoA OMT基因的克隆及其生物信息学分析作者：刘红梅，胡尚连，卢学琴，等来源：《湖北农业科学》 2014年第11期刘红梅，胡尚连，卢学琴，曹颖，任鹏（西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳６２１０１０）摘要：以一年生青杨（ＰｏｐｕｌｕｓｃａｔｈａｙａｎａＲｅｈｄ．）嫩茎为试材，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆青杨ＣＣｏＡＯＭＴ基因，并对其进行生物信息学分析。
结果表明，该基因ｃＤＮＡ序列全长为７４７ｂｐ，是一个编码２４８个氨基酸的多肽，蛋白分子量为２７．６７ｋＤ，等电点为５．１９，将该基因命名为ＰｃＣＣｏＡＯＭＴ，其编码的蛋白质为是亲水性蛋白质；氨基酸序列和结构分析表明，ＣＣｏＡＯＭＴ有一个保守区域；系统进化分析表明，ＰｃＣＣｏＡＯＭＴ与毛果杨的ＰｔＣＣｏＡＯＭＴ基因具有很高的同源性（８７％），该基因功能可能与青杨木质素的生物合成有关。
关键词：青杨（ＰｏｐｕｌｕｓｃａｔｈａｙａｎａＲｅｈｄ．）；ＣＣｏＡＯＭＴ基因；克隆；生物信息学中图分类号：Ｓ７９２．１１３；Ｑ７文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）11－2670-05ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉcs ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣＣｏＡＯＭＴＧｅｎｅｉｎＰｏｐｕｌｕｓｃａｔｈａｙａｎａＲｅｈｄ．ＬＩＵＨｏｎｇ－ｍｅｉ，ＨＵＳｈａｎｇ－ｌｉａｎ，ＬＵＸｕｅ－ｑｉｎ，ＣＡＯＹｉｎｇ，ＲＥＮＰｅｎｇ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉａｎｙａｎｇ６２１０１０，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ： RａｗＰｏｐｕｌｕｓｃａｔｈａｙａｎａＲｅｈｄ．ｓｐｅａｒ of oｎｅｙｅａｒｗａｓｕｓｅｄ to clone，ｔｈｅＣＣｏＡＯＭＴｇｅｎｅ with ＲＴ－ＰＣＲａｎｄｉｔｓｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ．ＴｈｅｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ７４７ｂｐｉｎｌｅｎｇｔｈ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ２４８ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆｐｒｏｔｅｉｎｅｎｃｏｄｅｄｂｙｔｈｅＣＣｏＡＯＭＴｇｅｎｅｗａｓ２７．９４ｋＤ．ＩｔｓｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌＰＩｗａｓ５．１９．ＴｈｅＣＣｏＡＯＭＴｇｅｎｅｗａｓｎａｍｅｄ as ＰｃＣＣｏＡＯＭＴ．ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｎｃｏｄｅｄｂｙｔｈｅＣＣｏＡＯＭＴｇｅｎｅｗａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｐｒｏｔｅｉｎ． Tｈｅ results of ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｎｃｏｄｉｎｇｂｙＰｃＣＣｏＡＯＭＴｃｏｎｔａｉｎｅｄｏｎｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎ．ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＰｃＣＣｏＡＯＭＴｇｅｎｅ had 87% ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｇｅｎｅｓＰｔＣＣｏＡＯＭＴｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ．Ｉｔｍａｙｂｅ involued in ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ of ｐｏｐｌａｒｌｉｇｎｉｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＰｏｐｕｌｕｓｃａｔｈａｙａｎａＲｅｈｄ．；ＣＣｏＡＯＭＴｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ木质素是植物体中重要的大分子有机物质，仅次于纤维素，在植物抗击外来侵袭、抵御病害袭击、维持正常生长等方面发挥着重要作用［１］。
小麦淀粉合成酶SSⅡa基因克隆及生物学分析
小麦淀粉合成酶SSⅡa基因克隆及生物学分析小麦淀粉合成酶SSⅡa基因克隆及生物学分析引言淀粉合成酶（SS）在细胞能量、糖原代谢和细胞结构维持中发挥重要作用。
特别是对于大多数非细菌个体来说，淀粉合成酶是重要的植物淀粉合成途径的核心酶。
从大肠杆菌中分离到的淀粉合成酶SSⅡa随着近代的基因克隆技术的发展而得到广泛的研究。
研究目的基于此，本文旨在从小麦中克隆出将与SSⅡa有一定相似性的小麦淀粉合成酶（WSSⅡa）基因，并进行生物学分析，以研究它们在植物淀粉代谢中的作用。
材料与方法本研究采用M13单链DNA测序进行基因克隆，以获取编码WSSⅡa的cDNA文库亚克隆，并采用RT-PCR技术进行基因片段的扩增。
随后，基因克隆得到的细胞，采用SDS-PAGE蛋白质电泳，并用Western Blotting氨基酸序列测定定序分析，以验证新克隆的WSSⅡa蛋白质的结构功能性。
结果与讨论通过基因克隆，成功克隆出小麦淀粉合成酶（WSSⅡa）基因，并成功进行了生物学分析。
结果表明，WSSⅡa在小麦淀粉代谢中具有重要作用。
另外，该研究还为进一步研究胚向淀粉代谢中心基因（如WSSⅡa）的作用提供了有价值的参考信息。
结论本研究成功克隆出小麦淀粉合成酶SSⅡa基因，并进行了生物学分析，表明其在小麦淀粉代谢中具有重要作用。
本研究为研究淀粉代谢中心基因的作用提供了有用的信息。
未来研究方向研究表明，小麦淀粉合成酶WSSⅡa在小麦淀粉代谢中起着重要的作用，未来的研究将以该基因为基础，继续深入探索植物淀粉代谢机理。
例如，可以进一步分析WSSⅡa在淀粉生产和调节中的作用机制，并对其进行密码学分析，以更好地理解小麦淀粉代谢的分子机制。
此外，还可以利用基因工程技术，通过调节WSSⅡa的表达水平来改良植物淀粉代谢，从而提高作物的收获率和品质。
总结本文成功克隆出小麦淀粉合成酶SSⅡa基因，并进行了生物学分析，表明它在小麦淀粉代谢中具有重要作用。
未来的研究方向可以更深入地探索WSSⅡa在淀粉生产和调节中的作用机制，利用基因工程技术来改良植物淀粉代谢，提高作物收获率和品质。
白来航鸡STING基因克隆、生物信息学及组织表达特性分析
中国畜牧兽医 2024,51(4):1372-1381C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 白来航鸡S T I N G 基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析王艳,张 颖,赵雅妮,易 林,史 珍,周长明,周宛蓉,姜莉莉,樊兆斌(菏泽学院药学院,菏泽274015)摘 要:ʌ目的ɔ克隆白来航鸡干扰素基因刺激因子基因(s t i m u l a t o ro f i n t e r f e r o n g e n e s ,S T I N G )C D S 区序列并进行生物信息学和组织表达分析,为阐明S T I N G 基因在抗病毒免疫应答中的作用奠定基础㊂ʌ方法ɔ采用P C R 扩增并克隆白来航鸡S T I N G 基因C D S 区,测序后对其编码氨基酸序列进行相似性比对及系统进化树构建,利用生物信息学预测S T I N G 蛋白的理化特性及结构功能,并利用实时荧光定量P C R 技术检测S T I N G 基因在鸡心脏㊁肝脏等14个组织中的表达情况㊂ʌ结果ɔ白来航鸡S T I N G 基因C D S 区序列全长1140b p ,编码379个氨基酸㊂相似性比对和系统进化树分析结果表明,白来航鸡S T I N G 基因与原鸡的相似性最高(99.7%),亲缘关系最近,与冠小嘴乌鸦亲缘关系最远㊂S T I N G 蛋白为酸性㊁亲水性蛋白,分子质量为42.625k u ,等电点(pI )为6.67,不稳定系数为69.26,脂肪系数为105.01㊂该蛋白大部分在线粒体和内质网上合成,含有跨膜结构,不含信号肽㊂S T I N G 蛋白二级结构包括α-螺旋(54.62%)㊁延伸链(10.29%)㊁β-转角(3.43%)及无规则卷曲(31.66%)㊂蛋白互作分析表明,白来航鸡S T I N G 蛋白与N F K B 1㊁D D X 41㊁c G A S ㊁T B K 1等蛋白存在相互作用㊂实时荧光定量P C R 结果显示,S T I N G 基因在白来航鸡组织中广泛表达,其中在肺脏中表达量最高,且显著高于其他组织(P <0.05);在胸肌中表达量最低㊂ʌ结论ɔ本研究成功克隆了白来航鸡S T I N G 基因,其C D S 区序列全长1140b p ,编码379个氨基酸㊂白来航鸡S T I N G 蛋白为酸性㊁亲水性蛋白,含有跨膜结构㊂S T I N G 基因在白来航鸡肺脏中表达量最高㊂研究结果为深入探究白来航鸡S T I N G 基因编码蛋白功能提供了材料㊂关键词:白来航鸡;S T I N G 基因;克隆;生物信息学;表达中图分类号:S 831;Q 78文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2024.04.005 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-10-20基金项目:山东省自然科学基金项目(Z R 2019M C 036㊁Z R 2023Q C 302);菏泽学院大学生创新训练项目;菏泽学院新兽药工程重点实验室联系方式:王艳,E -m a i l :1722804585@q q .c o m ;张颖,E -m a i l :3082291255@q q.c o m ㊂王艳和张颖对本文具有同等贡献,并列为第一作者㊂通信作者姜莉莉,E -m a i l :l y j l l f x y l 024@163.c o m ;樊兆斌,E -m a i l :438321212@q q.c o m C l o n i n g ,B i o i n f o r m a t i c s a n dT i s s u eE x pr e s s i o nC h a r a c t e r i s t i c s o f S T I N G G e n e i n W h i t eL e gh o r nC h i c k e n s WA N G Y a n ,Z H A N G Y i n g ,Z H A O Y a n i ,Y IL i n ,S H I Z h e n ,Z H O U C h a n g m i n g,Z H O U W a n r o n g,J I A N GL i l i ,F A NZ h a o b i n (C o l l e g e o f P h a r m a c y ,H e z eU n i v e r s i t y ,H e z e 274015,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔI nt h i ss t u d y ,t h eC D Sr e g i o ns e qu e n c eo f s t i m u l a t o ro f i n t e r f e r o n g e n e s (S T I N G )g e n e i n W h i t eL e g h o r nc h i c k e n sw a s c l o n e da n da n a l y z e db y bi o i n f o r m a t i c s a n d t i s s u e e x p r e s s i o n ,w h i c h l a i da f o u n d a t i o nf o re l u c i d a t i n g th er o l eo f S T I N G g e n e i na n t i v i r a l i m m u n e r e s p o n s e .ʌM e t h o d ɔT h eC D S r e g i o n o f S T I N G g e n e i n W h i t eL e g h o r n c h i c k e n sw a s a m p l i f i e db y P C Ra n d c l o n e d .A f t e r s e q u e n c i n g ,t h es i m i l a r i t y o f t h ee n c o d e da m i n oa c i ds e qu e n c eo f S T I N G g e n ew a sc o m p a r e da n dt h e p h y l o g e n e t i ct r e e w a sc o n s t r u c t e d .T h e p h y s i c o c h e m i c a l p r o pe r t i e s a n d s t r u c t u r a lf u n c t i o no f S T I N G p r o t e i nw e r e p r e d i c t e db y b i o i n f o r m a t i c s ,a n d t h e e x pr e s s i o no f4期王艳等:白来航鸡S T I N G基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析S T I N G g e n e i n14t i s s u e ss u c ha sh e a r t a n d l i v e ro f W h i t eL e g h o r nc h i c k e n sw e r ed e t e c t e db y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C R.ʌR e s u l tɔT h e s e q u e n c eo f t h eC D Sr e g i o no f S T I N G g e n e i n W h i t e L e g h o r nc h i c k e n sw a s1140b p i n t o t a l l e n g t h,e n c o d i n g379a m i n o a c i d s.S i m i l a r i t y a l i g n m e n t a n d p h y l o g e n e t i c t r e e a n a l y s i s s h o w e d t h a t S T I N G g e n e i n W h i t eL e g h o r nc h i c k e n sh a d t h eh i g h e s t s i m i l a r i t y w i t h G a l l u s g a l l u s a n d t h e c l o s e s t g e n e t i cr e l a t i o n s h i p,a n d t h ef a r t h e s t g e n e t i c r e l a t i o n s h i p w i t h C o r v u s c o r n i xc o r n i x.S T I N G p r o t e i n i n W h i t eL e g h o r n c h i c k e n sw a s a n a c i d i c,h y d r o p h i l i c p r o t e i n w i t ha m o l e c u l a rw e i g h to f42.625k u,a n i s o e l e c t r i c p o i n t(p I)o f6.67,a ni n s t a b i l i t y c o e f f i c i e n t o f69.26,a n da f a t c o e f f i c i e n to f105.01.S T I N G p r o t e i n w a ss y n t h e s i z e d m o s t l y o nm i t o c h o n d r i a a n de n d o p l a s m i c r e t i c u l u m,c o n t a i n e da t r a n s m e m b r a n e s t r u c t u r e,a n dn o s i g n a l p e p t i d e.T h es e c o n d a r y s t r u c t u r e o fS T I N G p r o t e i ni n c l u d e d a l p h a h e l i x(54.62%), e x t e n d e dc h a i n(10.29%),b e t at u r n(3.43%)a n dr a n d o m c o i l(31.66%).P r o t e i ni n t e r a c t i o n a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e r ew e r e i n t e r a c t i o n sb e t w e e nS T I N Ga n dN F K B1,D D X41,c G A S,T B K1 a n do t h e r p r o t e i n s.T h er e s u l t so fR e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C R s h o w e dt h a t S T I N G g e n e w a s w i d e l y e x p r e s s e d i n t h e t i s s u e s o fW h i t eL e g h o r o n c h i c k e n s,w i t h t h e h i g h e s t e x p r e s s i o n i n l u n g, w h i c hw a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i no t h e r t i s s u e s(P<0.05),a n d t h e l o w e s t e x p r e s s i o n i n p e c t o r a l i s m u s c l e.ʌC o n c l u s i o nɔI nt h i ss t u d y,S T I N G g e n ei n W h i t e L e g h o r nc h i c k e n s w a s s u c c e s s f u l l y c l o n e d,t h e t o t a l l e n g t ho f t h eC D Sr e g i o nw a s1140b p,e n c o d i n g379a m i n oa c i d s. S T I N G p r o t e i n i n W h i t e L e g h o r n c h i c k e n s w a s a n a c i d i c,h y d r o p h i l i c p r o t e i n w i t h a t r a n s m e m b r a n e s t r u c t u r e.T h e r e w a st h eh i g h e s te x p r e s s i o no f S T I N G g e n ei nl u n g o f W h i t e L e g h o r o n c h i c k e n s.T h er e s u l t s p r o v i d e d m a t e r i a l s f o r t h e i n-d e p t hs t u d y o f t h e f u n c t i o no f t h e p r o t e i ne n c o d e db y S T I N G g e n e i n W h i t eL e g h o r nc h i c k e n s.K e y w o r d s:W h i t eL e g h o r n c h i c k e n s;S T I N G g e n e;c l o n i n g;b i o i n f o r m a t i c s;e x p r e s s i o n先天性免疫是机体抵御病原微生物的第一道防线㊂宿主编码模式识别受体(P R R s)对来自病原体核酸的识别启动了复杂的信号转导途径,最终产生Ⅰ型干扰素(I F N-Ⅰ)和促炎细胞因子,并激活机体的天然免疫反应[1]㊂环鸟腺苷酸合成酶(c G A S)作为D N A识别受体,能识别并结合胞质双链D N A(d s D N A)[2]㊂当胞质中存在异常d s D N A时,c G A S能催化合成第二信使2 ,3 -c G AM P(c G AM P),结合并有效激活干扰素基因刺激因子基因(s t i m u l a t o r o f i n t e r f e r o n g e n e s,S T I N G),随后S T I N G招募T A N K结合激酶(T B K1)和I K B 激酶(I K K)使其磷酸化,激活导致产生I F N-Ⅰ和干扰素调节因子3(I R F3)㊁核因子κB(N F-κB)等细胞因子的表达[3]㊂S T I N G的功能主要体现在c G A S-S T I N G-I F N 信号通路中㊂c G A S-S T I N G通路除了构成有效的防御组织损伤和病原体入侵的监测系统外,还在自噬㊁翻译㊁代谢稳态㊁细胞凝聚㊁D N A损伤修复㊁衰老和细胞死亡中发挥作用[4]㊂然而c G A S-S T I N G通路的异常或过度激活可导致原发性发病机制和多种自身免疫性疾病[5]㊂家禽马立克病病毒(M D V)和鸡新城疫病毒(N D V)均靶向S T I N G接头蛋白,从而阻碍c G A S-S T I N G通路介导抗病毒天然免疫的应答[6-7]㊂禽痘病毒(F W P V)可以刺激鸡巨噬细胞中的c G A S-S T I N G通路,上调I F N相关因子表达,使宿主有效防御F W P V感染;禽白血病病毒(A L V)通过其编码的P15蛋白抑制激活c G A S-S T I N G通路,从而有助于病毒复制和持续感染[8]㊂S T I N G在细胞因子诱导㊁自噬诱导㊁代谢调节和内质网应激等方面发挥重要功能[9],且在健康和疾病中发挥着至关重要的作用,广泛参与各种细胞过程㊂近年来,靶向S T I N G的激动剂成为国内外抗肿瘤药物研发的新热点,S T I N G激动剂在乳腺癌㊁结肠癌㊁肝癌㊁黑色素瘤及淋巴瘤等肿瘤模型中都展现出了强有力的抗肿瘤活性[10]㊂目前国内外对鸡S T I N G在抗病毒免疫中的研究鲜有报道㊂本研究以白来航鸡为研究对象,克隆S T I N G基因C D S 区,运用在线软件对该基因编码蛋白进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量P C R技术检测S T I N G基因在白来航鸡不同组织中的表达特征,以期为深入探究S T I N G在抗病毒免疫应答中的作用提供参考依据㊂3731中 国 畜 牧 兽 医51卷1 材料与方法1.1 材料供试动物选取同一批次的3只3周龄健康的白来航鸡(菏泽市某养殖场)㊂颈部放血处理后,无菌采集每只白来航鸡的心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁胰脏㊁肺脏㊁肾脏㊁脑㊁胆㊁腺胃㊁十二指肠㊁回肠㊁盲肠㊁直肠㊁胸肌共14个组织置于超低温备用㊂T r i z o l ㊁P r i m e S c r i p t T MR T R e a g e n t K i t w i t h gD N AE r a s e r ㊁D L 2000D N A M a r k e r ㊁限制性内切酶E c o R Ⅰ㊁H i n d Ⅲ均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;S Y B R P r e m i x E x T a q T M (2ˑ)购自T a K a R a 公司;T 4D N A 连接酶㊁pE T -28a (+)载体㊁大肠杆菌D H 5α感受态细胞㊁T I A N p r e p Mi n i P l a s m i dK i t 均购自天根生化科技(北京)有限公司㊂1.2 方法1.2.1 引物设计及合成 根据G e n B a n k 中原鸡S T I N G 基因序列(登录号:K P 893157.1),使用P r i m e rP r e m i e r 5.0软件设计普通P C R (下划线处为E c o R Ⅰ和H i n d Ⅲ酶切位点)和实时荧光定量P C R 引物,以G A P DH 为内参基因,引物信息见表1㊂引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成㊂表1 引物序列信息T a b l e 1 P r i m e r s e q u e n c e i n f o r m a t i o n 基因G e n e s引物序列P r i m e r s e qu e n c e s (5'ң3')退火温度A n n e a l i n gt e m pe r a t u r e /ħ产物长度P r o d u c tl e n g t h /b p 用途A p p l i c a t i o n S T I N G F :C C G G A A T T C A T G C C C C A G G A C C C G T C A A C C 62.81140普通P C R R :C C C A A G C T T C T G G G C T C A G G G G C A G T C A C T S T I N G F :G C C C C A G G A C C C G T C A A C C A G 60.0114实时荧光定量P C R R :A G C A C C A C G A A G C A C A C A G C C AG A P DHF :G A C G T G C A G C A G G A A C A C T A 60.0122实时荧光定量P C RR :A T G G C C A C C A C T T G G A C T T T1.2.2 总R N A 提取及反转录 利用T r i z o l 法提取各组织总R N A ,溶于D N a s e /R N a s e -f r e ed d H 2O ,利用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测R N A 浓度及纯度,将R N A 反转录为c D N A ,―20ħ保存备用㊂1.2.3 S T I N G 基因C D S 区克隆及测序 以白来航鸡脾脏组织c D N A 为模板进行P C R 扩增㊂P C R 反应体系20μL :c D N A 模板0.5μL ,上㊁下游引物(10μm o l /L )各0.5μL ,P C R M a s t e r M i x10μL ,d d H 2O8.5μL ㊂P C R 反应程序:94ħ预变性5m i n ;94ħ变性30s ,62.8ħ退火30s ,72ħ延伸75s ,共35个循环;72ħ延伸7m i n ㊂P C R 产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,取鉴定正确的扩增产物回收纯化后连接p E T -28a (+)载体,转化大肠杆菌D H 5α感受态细胞,均匀涂布于含卡那霉素的L B 固体培养基上,过夜培养14h 后筛选出圆滑白色单菌落并进行菌液P C R 鉴定,将挑选得到的阳性克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序㊂1.2.4 生物信息学分析 使用M e g A l i g n 软件将白来航鸡与G e n B a n k 数据中已公布的原鸡(G a l l u s ga l l u s ,登录号:N P _001292081.2)㊁盔珠鸡(N u m i d am e l e a g r i s ,登录号:X P _021265823.1)㊁火鸡(M e l e a g r i s g a l l o pa v o ,登录号:X P _010717095.1)㊁白尾雷鸟(L a g o pu s l e u c u r a ,登录号:X P _042749793.1)㊁日本鹌鹑(C o t u r n i x j a po n i c a ,登录号:X P _015731739.1)㊁凤头朱鹮(N i p po n i a n i p po n ,登录号:K F Q 92075.1)㊁冠小嘴乌鸦(C o r v u s c o r n i xc o r n i x ,登录号:X P _039415878.1)的S T I N G 基因氨基酸序列进行相似性比对,并利用M e ga 7.0软件构建系统进化树㊂利用P r o t P a r a m 在线软件(h t t ps :ʊw e b .e x p a s y .o r g /p r o t pa r a m /)分析S T I N G 蛋白理化性质;利用P r o t S c a l e 在线软件(h t t p s :ʊw eb .e x p a s y .o r g /pr o t s c a l e /)分析S T I N G 蛋白亲/疏水性;利用S i g n a l P4.1(h t t ps :ʊs e r v i c e s .h e a l t h t e c h .d t u .d k /s e r v i c e s /S i g n a l P -4.1/)㊁T MHMM (h t t ps :ʊs e r v i c e s .h e a l t h t e c h .d t u .d k /)在线软件分别预测S T I N G 蛋白信号肽与跨膜区;利用S M A R T (h t t p :ʊs m a r t .e m b l -h e i d e l b e r g .d e /s m a r t /b a t c h .p l )和P S P R TⅡ(h t t p :ʊp s o r t .h g c .j p/f o r m 2.h t m l )在线软件分别预测S T I N G 蛋白结构域和亚细胞定位;利用47314期王艳等:白来航鸡S T I N G基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析N e t P h o s3.1在线软件(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/se r v i c e.p h p?N e t P h o s-3.1)预测S T I N G 蛋白磷酸位点;利用Y i n O Y a n g1.2(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e s/Y i n O Y a n g-1.2/)和N e t N G l y c1.0(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e s/N e t N G l y c-1.0/)分别预测S T I N G蛋O-糖基化和N-糖基化位点;通过P r a b i S O P MA(h t t p s:ʊn p s a.l y o n.i n s e r m.f r/c g i-b i n/s e c p r e d_s o p m a.p l)和S W I S S M O D E L(h t t p s:ʊs w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g/i n t e r a c t i v e)在线软件分别预测S T I N G蛋白二级结构和三级结构;利用S T R I N G12.0在线软件(h t t p s:ʊv e r s i o n-12-0. s t r i n g-d b.o r g/)和C y t o s c a p e软件进行蛋白互作分析㊂1.2.5白来航鸡S T I N G基因组织表达特性检测以鸡14个组织c D N A为模板,利用实时荧光定量P C R检测S T I N G基因在白来航鸡各组织中的相对表达情况,以G A P DH作为内参基因㊂P C R 反应体系10μL:c D N A0.5μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各0.3μL,S Y B R P r e m i x E x T a q T M (2ˑ)5μL,d d H2O3.9μL㊂P C R反应程序:95ħ2m i n;95ħ15s,60ħ1m i n,共45个循环;熔解程序:95ħ15s,60ħ1m i n;95ħ15s㊂每个组织样品设3个重复,采用2―әәC t法计算相对表达量㊂1.3数据统计分析通过S P S S26.0软件中单因素方差分析对基因表达量进行显著性检测,采用L S D和邓肯式法进行多重比较,利用G r a p h P a dP r i s m8.0软件作图㊂结果用平均值ʃ标准差表示,P<0.05表示差异显著㊂2结果2.1白来航鸡S T I N G基因C D S区序列克隆1.0%琼脂糖凝胶电泳显示,在约1140b p附近出现清晰条带(图1),与预期条带大小符合㊂应用D N AMA N软件分析测序结果显示,本试验克隆的白来航鸡S T I N G基因C D S区片段长为1140b p,编码379个氨基酸,碱基组成分别为: A(17.54%)㊁G(30.35%)㊁T(18.16%)㊁C(33.95%), G C含量高于A T含量,说明白来航鸡S T I N G基因C D S区的D N A双链较稳定㊂M,D L2000D N A M a r k e r;1~3,S T I N G基因P C R扩增产物;4,阴性对照M,D L2000D N A M a r k e r;1-3,P C Ra m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s o f S T I N G g e n e;4,N e g a t i v e c o n t r o l图1白来航鸡S T I N G基因P C R扩增结果电泳图F i g.1E l e c t r o p h o r e t i c m a p o fP C Ra m p l i f i c a t i o nr e s u l t so f S T I NG g e n e i n W h i t eL e i g h o r n c h i c k e n s2.2生物信息学分析2.2.1相似性比对及系统进化树构建相似性比对结果显示,白来航鸡S T I N G基因编码氨基酸序列与原鸡㊁灰胸竹鸡㊁环颈雉㊁盔珠鸡㊁火鸡㊁白尾雷鸟㊁日本鹌鹑㊁朱鹮和冠小嘴乌鸦的相似性分别为99.7%㊁93.7%㊁89.1%㊁87.3%㊁90.2%㊁87.3%㊁83.6%㊁63.9%和62.0%(图2)㊂采用M e g a7.0软件中M L法构建系统进化树,结果显示,白来航鸡与原鸡之间的亲缘关系最近,与灰胸竹鸡的亲缘关系次之,朱鹮和冠小嘴乌鸦形成另一个分支,与冠小嘴乌鸦亲缘关系最远(图3)㊂2.2.2理化特性分析白来航鸡S T I N G蛋白分子式为C1897H3032N530O541S22,分子质量为42.625k u,理论等电点(p I)为6.67,推测该蛋白为酸性蛋白㊂组成白来航鸡S T I N G蛋白的20种氨基酸中,L e u 所占比例最高(17.2%),而A s n和M e t含量最低(1.3%),其中带负电荷的氨基酸(A s p和G l u) 42个,带正电荷的氨基酸(A r g和L y s)40个㊂在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30h,脂肪系数为105.01㊂S T I N G蛋白的不稳定系数为69.26,高于阈值40,表明该蛋白不稳定㊂2.2.3亲/疏水性预测白来航鸡S T I N G蛋白在第34位氨基酸处分值最高(3.500),在第257位氨基酸处分值最低(―2.789)(图4),总平均亲水性G R A V Y为―0.041,即S T I N G为亲水性蛋白㊂5731中 国 畜 牧 兽 医51卷图2 不同物种S T I N G 基因氨基酸序列相似性比对F i g .2 S i m i l a r i t y a l i g n m e n t o f a m i n o a c i d s e q u e n c e o f S T I NG g e n e a m o n g d i f f e r e n t s pe c i es 图3 基于S T I N G 基因氨基酸序列构建的系统进化树F i g .3 P h y l o g e n e t i c t r e e b a s e do na m i n o a c i d s e qu e n c e o f S T I N G g e ne 图4 白来航鸡S T I N G 蛋白亲/疏水性预测F i g .4 H y d r o p h i l i c i t y a n dh y d r o p h o b i c i t yp r e d i c t i o no f S T I NG p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 67314期王 艳等:白来航鸡S T I N G 基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析2.2.4 信号肽及跨膜区预测 白来航鸡S T I N G 蛋白不含信号肽(图5),推测该蛋白不是分泌型蛋白;该蛋白含4个跨膜区,分别位于第27―42㊁57―73㊁101―112及124―141位氨基酸处(图6),属于跨膜蛋白㊂图5 白来航鸡S T I N G 蛋白信号肽预测F i g .5 S i g n a l p e p t i d e p r e d i c t i o no fS T I NG p r o t e i ni n W h i t e L e gh o r n c h i c k e ns 图6 白来航鸡S T I N G 蛋白跨膜区预测F i g .6 T r a n s m e m b r a n e r e g i o n p r e d i c t i o no f S T I NG p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 2.2.5 结构域预测及亚细胞定位 预测结果显示,白来航鸡S T I N G 蛋白具有1个保守结构域T M E M 173,位于第50―342位氨基酸处㊂白来航鸡S T I N G 蛋白大部分在线粒体和内质网上合成,在细胞核中合成较多,在细胞质中合成最少㊂2.2.6 修饰位点预测 白来航鸡S T I N G 蛋白丝氨酸㊁酪氨酸㊁苏氨酸磷酸化位点分别有25㊁3及5个(图7);存在43个O -糖基化磷酸位点(图8),不存在N -糖基化磷酸位点㊂图7 白来航鸡S T I N G 蛋白磷酸化位点预测F i g .7 P h o s p h o r y l a t i o n s i t e p r e d i c t i o no f S T I NG p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 2.2.7 二级结构及三级结构预测 白来航鸡S T I N G 蛋白二级结构包括α-螺旋(54.62%)㊁延伸链(10.29%)㊁β-转角(3.43%)㊁无规则卷曲(31.66%)(图9)㊂白来航鸡S T I N G 蛋白三级结构主要以α-螺旋为主(图10),与二级结构预测结果一致㊂2.2.8 蛋白互作分析 将白来航鸡S T I N G 蛋白序列导入S T R I N G12.0在线数据库,结果显示,该蛋白与N F K B 1㊁D D X 41㊁c G A S ㊁T B K 1等蛋白存在互作(图11)㊂7731中 国 畜 牧 兽 医51卷图8 白来航鸡S T I N G 蛋白O -糖基化位点预测F i g .8 O -g l y c o s y l a t i o n s i t e p r e d i c t i o no f S T I N G p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e ns h ,α-螺旋;e ,延伸链;t ,β-转角;c ,无规则卷曲h ,A l ph ah e l i x ;e ,E x t e n d e d c h a i n ;t ,B e t a t u r n ;c ,R a n d o mc o i l 图9 白来航鸡S T I N G 蛋白二级结构F i g .9 S e c o n d a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o no f S T I NG p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e ns 图10 白来航鸡S T I N G 蛋白三级结构F i g .10 T e r t i a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o no fS T I NG p r o t e i ni n W h i t eL e gh o r n c h i c k e ns 图11 白来航鸡S T I N G 蛋白互作分析F i g .11 P r o t e i ni n t e r a c t i o n a n a l y s i so fS T I NG p r o t e i ni n W h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 87314期王 艳等:白来航鸡S T I N G 基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析2.3 白来航鸡S T I N G 基因组织表达分析通过实时荧光定量P C R 检测S T I N G 基因在白来航鸡14个组织中的表达情况,结果显示,S T I N G 基因在白来航鸡肺脏中的表达量最高,且显著高于其他组织(P <0.05);在胸肌中的表达量最低(图12)㊂肩标不同字母表示差异显著(P <0.05);肩标相同字母表示差异不显著(P >0.05)V a l u e sw i t hd i f f e r e n t l e t t e r s u p e r s c r i p t sm e a n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05);W h i l ew i t h t h e s a m e l e t t e r s u p e r s c r i p t sm e a n n o s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05)图12 S T I N G 基因在白来航鸡不同组织中的相对表达量F i g .12 T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o no f S T I NG g e n e i nd i f f e r e n t t i s s u e s o fW h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 3 讨 论S T I N G 是固有免疫系统I F N -Ⅰ信号通路中的一个重要接头蛋白,定位在内质网上,可激活T B K I ㊁I K K ㊁I R F 3及N F -κB 通路,强烈刺激I F N -Ⅰ和白介素等免疫炎症因子的产生[11]㊂I F N -β在S T I N G 通路中分泌量最高,它不仅能够消灭癌细胞,还能通过促使树突细胞成熟实现抗原递呈,从而将固有免疫应答与获得性免疫应答相联系[12]㊂S T I N G 基因缺失使小鼠胚胎成纤维细胞(S T I N G -/-M E F s)极易受到负链病毒感染,如水疱性口炎病毒(V S V )和1型单纯疱疹病毒(H S V -1)[13]㊂本研究成功克隆白来航鸡S T I N G 基因C D S 区序列,为后期研究禽类S T I N G 蛋白抗病毒作用机制提供基础数据㊂系统进化树显示,白来航鸡与原鸡亲缘关系最近,与冠小嘴乌鸦亲缘关系最远,表明该基因在不同物种间保守性具有一定差异㊂白来航鸡S T I N G 蛋白为酸性㊁亲水性蛋白㊂以上结果表明该基因在不同物种的发育进化过程中表现出了种内相似性和种间差异性㊂白来航鸡S T I N G 蛋白无信号肽,说明该蛋白不是分泌蛋白,结合蛋白的亚细胞定位推测其主要存在于细胞质或线粒体中㊂另外,白来航鸡S T I N G 蛋白具有4个跨膜结构域㊂在S T I N G 二聚体中,8个T M 螺旋被分成由T M 2和T M 4组成的中间层和由T M 1和T M 3组成的外围层,其中1个S T I N G 分子的T M 1和另1个分子的T M 2㊁T M 3和T M 4被堆积在一起,形成结构域包裹的结构,这种保守的结构特征对蛋白的稳定性和功能至关重要[14]㊂白来航鸡S T I N G 蛋白存在T M E M 173保守结构域,预测结果显示其可促进先天免疫信号传导,与刘健新等[15]对山羊S T I N G 蛋白结构域的预测结果一致㊂白来航鸡S T I N G 蛋白中含有43个O -糖基化磷酸位点,这些修饰位点可能影响S T I N G 蛋白的空间构象㊁合成㊁运输㊁定位等生物过程,不存在N -糖基化磷酸位点,从而对该蛋白的不稳定性产生影响㊂S T I N G 蛋白共有33个潜在磷酸化位点,该蛋白本身的磷酸化是下游信号转导所必需的,其中含有的2个保守的丝氨酸和苏氨酸位点是T B K 1的磷酸化靶点㊂另外,S T I N G 磷酸化有助于其从细胞质到高尔基体的适当易位,开启免疫反应,且还参与防止S T I N G 过度激活和维持体内平衡[16]㊂蛋白质棕榈酰化是一种功能强大且保守的翻译后修饰,脂肪酸链通过可逆的硫酯键与蛋白质的半胱氨酸残基连接[17]㊂在高尔基体中,S T I N G 的2个半胱氨酸残基(C ys 88和9731中国畜牧兽医51卷C y s91)被棕榈酰化,激活其下游信号通路,这是S T I N G激活所必需的翻译后修饰[18]㊂蛋白互作预测结果显示,S T I N G蛋白与N F K B1㊁D D X41㊁c G A S㊁T B K1等蛋白存在相互作用㊂S T I N G蛋白可与c G A S结合形成第二信使c G A M P,使得S T I N G招募并激活T B K1,进而诱导I F N-Ⅰ和其他调节因子[19]㊂研究表明,当树突状细胞在感染H S V-1或腺病毒后,D D X41与S T I N G直接相互作用介导T B K1㊁N F-κB和I R F3的激活[20]㊂推测S T I N G 通过与这些蛋白互作,从而参与免疫及抗病毒过程㊂通过对白来航鸡S T I N G基因的组织表达特性分析可知,S T I N G基因的分布具有组织特异性,其中在肺脏中表达量最高,而石树端等[21]研究发现鸭S T I N G基因在腺胃中表达水平最高,表明家禽中m R N A组织分布存在一定差异;其次是脾脏,提示S T I N G基因广泛分布于宿主的免疫器官;此外, S T I N G基因在回肠㊁十二指肠等肠道组织中也有表达,因为肠道中的微生物菌群是启动免疫的重要因子,肠道微生物与宿主的互作建立机体的适应性免疫系统,可有效维持免疫防御作用[22];在胸肌中表达量最低,与金洁[7]研究结果一致㊂研究表明, S T I N G基因表达量降低可以提示肝癌和胃癌患者的预后不良[23-24],而注射S T I N G激动剂可使人乳头瘤病毒相关肿瘤组织消退[25]㊂另外,通过抑制S T I N G通路可以阻断衰老细胞释放促炎信号,从而改善老年神经退行性疾病[26]㊂因此,抑制或激活S T I N G信号通路,可为疾病治疗提供新的途径和特异性治疗靶点[21]㊂本试验通过对白来航鸡S T I N G 基因编码蛋白进行生物信息学和组织表达特性分析,为揭示S T I N G基因在固有免疫系统中的作用提供数据,并为后期探究S T I N G编码蛋白的生物学功能提供切实的理论基础㊂4结论本研究成功克隆了白来航鸡S T I N G基因C D S 区序列,大小为1140b p,编码379个氨基酸㊂白来航鸡与原鸡的亲缘关系最近,与冠小嘴乌鸦亲缘关系最远㊂S T I N G蛋白属于酸性㊁亲水性蛋白,存在跨膜结构,无信号肽,主要在细胞质和线粒体中发挥作用㊂S T I N G基因在白来航鸡肺脏中表达量最高,在胸肌中表达最低㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] G U O Y,J I A N GF,K O N G L,e t a l.O T U D5p r o m o t e si n n a t e a n t i v i r a l a n d a n t i t u m o r i m m u n i t y t h r o u g hd e u b i q u i t i n a t i n g a n ds t a b i l i z i n g S T I N G[J].C 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简州大耳羊CKMT2基因克隆、生物信息学分析及时空表达研究
简州大耳羊CKMT2基因克隆、生物信息学分析及时空表达研究孙诗雨;李金岚;邢佳妮;董耀徽;李艳艳;王友利;林亚秋【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2024(51)6【摘要】【目的】克隆简州大耳羊肌节线粒体肌酸激酶2(creatine kinase mitochondrial 2,CKMT2)基因并探究其生物学特征,明确其在简州大耳羊不同组织以及不同分化阶段成肌细胞中的表达特性。
【方法】采集简州大耳羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、臂三头肌组织样品,利用PCR方法扩增简州大耳羊CKMT2基因并克隆测序,通过在线软件对其进行生物信息学分析。
利用实时荧光定量PCR技术检测CKMT2基因在简州大耳羊不同组织及不同分化阶段成肌细胞中的表达水平。
【结果】简州大耳羊CKMT2基因全长1 314 bp,其中包括CDS区1 259 bp,编码419个氨基酸,与绵羊和羚羊的亲缘关系最近。
CKMT2蛋白是一种无信号肽及跨膜结构域的碱性亲水稳定蛋白,主要定位于线粒体、过氧化物类酶体及细胞质,共包含32个磷酸化位点、1个N-糖基化位点以及4个O-糖基化位点。
蛋白二级结构主要包括α-螺旋(39.14%)、无规则卷曲(36.28%)、延伸链(16.23%)和β-转角(8.35%),三级结构与二级结构预测结果基本一致。
蛋白互作分析结果显示,CKMT2蛋白与半胱氨酸和甘氨酸富含蛋白3(cysteine and glycine-rich protein 3,CSRP3)、M型肌酸激酶(creatine kinase M-type, CKM)、磷酸甘油酸变位酶2(phosphoglycerate mutase 2,PGAM2)等蛋白存在相互作用。
组织表达谱结果显示,CKMT2基因在简州大耳羊心脏中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05);在背最长肌中表达量较高,显著高于脾脏和臂三头肌(P<0.05)。
时序表达谱结果显示,简州大耳羊CKMT2基因在成肌细胞诱导分化4 d时表达水平达到峰值,显著高于0、6 d(P<0.05)。
研究基因功能的实验方案
基因功能研究一般先用生物信息学分析对基因的结构和功能做预测，然后就要对我们的推测进行验证，如何验证一个基因的功能，目前最常用的基因功能研究策略为功能获得与功能失活。
1、功能获得策略是指将基因直接导入某一细胞或个体中，通过该基因在机体内的表达，观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，从而鉴定基因的功能。
常用的功能获得的具体方法有基因过表达技术以及CRISPR-SAM技术等。
2、基因的过表达技术：基因过表达技术是指将目的基因构建到组成型启动子或组织特异性启动子的下游，通过载体转入某一特定细胞中，实现基因的表达量增加的目的，可以使用的载体类型有慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等多种类型。
当基因表达产物超过正常水平时，观察该细胞的生物学行为变化，从而了解该基因的功能。
基因过表达技术可用于在体外研究目的基因在DNA、RNA和蛋白质水平上的变化以及对细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程的影响。
可使用产品：过表达慢病毒、cDNA克隆（可用作ORF克隆）CRISPR-SAM技术：CRISPR-SAM系统由三部分组成：第一个部分是dCas9与VP64融合蛋白；第二个部分是含2个MS2 RNA adapter的sgRNA；第三个是MS2-P65-HSF1激活辅助蛋白。
CRISPR-SAM系统借助dCas9-sgRNA的识别能力，通过MS2与MS2 adapter的结合作用，将P65/HSF1/VP64等转录激活因子拉拢到目的基因的启动子区域，成为一种强效的选择性基因活化剂，从而达到增强基因表达的作用。
可使用产品：全基因Cas9 SAM-慢病毒文库2、功能获得两种方法的比较：基因的过表达技术与CRISPR-SAM技术都能达到基因表达的上调，但是由于基因的过表达技术使用的载体容量的限制，导致基因的过表达技术只能用于研究一定长度内的基因。
而CRISPR-SAM技术是通过增强目的基因启动子的转录而实现基因的过表达，可以不受基因大小的限制。
杨树UGT198基因的生物信息学分析、基因克隆及功能初探
杨树UGT198基因的生物信息学分析、基因克隆及功能初探杨改霞;王春雨;龙连香;王世杰;顾丽姣【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2024(37)1【摘要】【目的】研究UGT198基因是否参与调控烟草抗虫性,为未来探索其参与调控杨树抗虫性奠定基础。
【方法】前期通过分析公共转录组数据发现PtrUGT198基因在杨树响应虫害的转录组中高调表达,对其进行生物信息学及进化分析。
以107杨为材料,克隆UGT198基因,构建过量表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草获得过量表达转基因株系。
通过棉铃虫饲虫试验初步验证UGT198基因是否参与调控抗虫性,分析UGT198基因在调控抗虫性中发挥的功能。
【结果】PtrUGT198基因完整的ORF区为1440 bp,编码479个氨基酸,理论分子量为53.14 kDa,等电点为5.92,编码不稳定疏水性蛋白。
PtrUGT198蛋白的二级结构α⁃螺旋占41.75%,β⁃折叠占14.61%,β⁃转角占7.10%,无规卷曲占6.53%。
PtrUGT198蛋白不存在跨膜区,预测其不属于膜蛋白,为非分泌性蛋白,该蛋白的磷酸化修饰以丝氨酸为主。
同源序列对比结果显示PtrUGT198蛋白的C末端存在高度保守的植物次生产物糖基转移酶(Plant secondary product glycosyltransferase,PSPG)基序。
系统进化树分析发现,PtrUGT198蛋白与同属植物毛白杨、银白杨和胡杨亲缘关系最近,其次和模式植物烟草有较近的亲缘关系。
成功克隆杨树UGT198基因,构建pNC⁃UGT198基因过量表达载体,并转化烟草获得过量表达转基因株系,进行饲虫实验,得到高表达量烟草相对抗虫。
【结论】首次成功克隆了UGT198基因,并初步解析其调控抗虫性的功能,为深入了解UGT198基因调控杨树抗虫机理提供参考价值。
【总页数】9页(P14-22)【作者】杨改霞;王春雨;龙连香;王世杰;顾丽姣【作者单位】河北农业大学林学院/河北省林木种质资源与森林保护重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S72【相关文献】1.小麦VP基因的克隆、生物信息学分析及功能初探2.杨树HSP90基因的克隆及生物信息学分析3.运用基因组和EST数据库进行电子克隆分离杨树功能基因的策略4.陆地棉GhUGT76C1基因克隆、生物信息学分析及功能初探因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基因功能研究方法
3.2 反义RNA技术 反义RNA 技术是利用基因重组技术,构建人工表达载 体,使其离体或体内表达反义RNA ,反义RNA 能与靶mRN A形成较稳定的二聚体,从而抑制靶基因的表达。其作 用机理可能在DNA 复制、转录及翻译多水平上抑制靶 基因的表达。
23
3.3 核酶技术
核酶(Ribozyme) 技术是一类具催化活性的特殊RNA 分 子,通过碱基配对原则特异性灭活靶RNA 分子。可裂解 与其互补的mRNA及在DNA内插入DNA片段构成三链结构， 单个核酶分子可以结合多个mRNA 分子并使之在特定部 位断裂,而其本身具有较稳定的空间结构,不易受RNase 攻击,因而催化效率比反义RNA 高。常见的核酶有锤头 状、发夹状和斧头状三种,应用最多的是锤头状核酶。
5
芯片的制作
• 目前常用的基因芯片制作方法：
•
接触点样法、喷黑法、原位合成法。
• 接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结 构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器， 可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个 样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。
6
• 喷黑法:是以定量供给的方式，通过压电晶体或其他推进 形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样 需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。 在1cm2面积上可喷射10000个点。
3
原理: 将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标 签(expressed sequence tag ,EST) 或特异的寡核苷 酸片段) 按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。 固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固 相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微 阵列就称为DNA芯片。
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功能基因的克隆及其生物信息学分析摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学<structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics>的整体研究。
功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等>，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。
功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。
如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。
关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。
1.功能基因的克隆1.1 图位克隆方法图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。
优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。
通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因<控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦 VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
1.2 同源序列克隆目的基因首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。
1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6 ]。
(Linkage disequilibrium, LD>。
与连锁分析不同, 连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。
历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotype block>。
这样经过很多世代的重组, 只有相隔很近的基因, 才能仍处在相同的原始单倍型片段上, 基因间的连锁不平衡才能依然存在。
所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。
林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低, 林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域, 这就为目的基因的精细定位提供了可能, 结合SNP 检测技术, 科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸(Quantitative trait nucleotide, QTN>作图。
当然除了相隔很近的基因, 某些相隔较远的基因, 由于受相同的选择压力, 也可能产生连锁不平衡。
但通过家系分析, 首先可以进行目的基因的粗略定位, 将目的基因首先限定到一个较小的区域, 只针对该区域内的SNP 进行相关性分析, 从而消除非由连锁引起的连锁不平衡干扰。
随着林木全基因组测序的发展,连锁图谱与LD 分析相结合的方法将是在林木中实现未知基因克隆的最有效的方法[6]。
1.4电子克隆近年来又兴起一种新的基因克隆方法--电子克隆，它是近年来伴随着基因组计划和EST计划发展起来的基因克隆新方法，它的主要原理是利用日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能力，通过EST或基因组的序列组装和拼接,利用RT-PCR的方法快速获得功能基因,具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点[7]。
1.4.1利用EST数据库信息首先选择感兴趣的水稻, EST作为查询探针，搜索水稻dbEST数据库，找到部分重叠的EST进行拼接，然后再以拼接好的EST重叠群为新的查询探针，继续搜索dbEST库,直到没有新的EST可供拼接为止，最后根据拼接好的完整序列设计PC R引物，通过RT-PCR的方法获得目的cDNA克隆并进行序列测定验证[7]。
图1为利用EST数据库信息克隆水稻功能基因的实验流程。
图1 利用水稻 EST数据库进行电子克隆的策略1.4.2利用基因组信息利用基因组信息资料进行电子克隆的最大优点就是基因的克隆不受作物发育时期或特殊环境条件的限制:可以用来源于任何时期或组织的水稻和其他物种的EST或全长cDNA序列作为信息探针搜索位于GenBank或者我国华大公布的水稻基因组序列:随后根据内含子的规则通过人工拼接或相应的计算机软件预测:可以得到该基因完整的开放读码框,根据拼接的序列结果设计PCR引物:进一步采取RT-PCR的方法获得目的基因的cDNA克隆并进行序列测定[7]。
具体实验流程见图22 生物信息学分析生物信息学(bioinformatics>是在生命科学、计算机科学和数学的基础上逐步发展而形成的一门新兴交叉学科，是为理解各种数据的生物学意义，运用数学与计算机科学手段进行生物信息的收集、加工、存储、传播、分析与解读的科学[8-10]。
由于历史原因，有的研究者也使用计算生物学(computationalbiology>或计算分子生物学(computational molecular biology> 等不同的术语。
在后基因组时代，生物信息学的研究内容主要可分为两个重要组成部分：基因组信息学和蛋白质组信息学[11]。
后基因组时代，除了继续序列和结构分析外，更多的研究力量则投入到功能分析，也就是分析研究遗传型到表型的过程[12]。
2.1 基因序列同源性比对及其应用基因序列同源性的比对，对于分析基因组DNA序列以及完成新基因的染色体定位也是极为便捷的。
将确定的新基因的编码基因序列作为参照，对于GenB ank数据库中高通量基因序列(htgs>数据库中基因组DNA序列进行同源性对比，当发现与新基因的cDNA序列完全同源的基因组DNA序列时，根据Chambon原则，内含子(intron>的序列总是以GT开始，以AG结束，就可以确定该基因的基因组DNA序列的结构，及外显子(exon>-内含子序列结构。
因为在htgs数据库收录的基因组DNA序列，其染色体的来源是十分清楚的，因此就很容易、很方便地将该基因组进行染色体的定位，而不再需要进行荧光原位杂交(FISH>的常规的基因染色体定位技术。
可见基因的生物信息学技术的发展对于基因组DNA序列的确定和在染色体上的定位是多么重要。
迟光红等在香蕉中获得一个柠檬酸合酶基因的cDNA序列。
用NCBIBlastx分析，得出它具有植物柠檬酸合酶基因的特征结构域，并与其他植物中柠檬酸合酶基因的同源性较高，进一步证明了该cDNA编码香蕉中的柠檬酸合酶[13]。
李学农等通过Internet查询美国国家生物信息中心数据库，数据库采用BLAST，依据Genecard和Ense-mbl获得将MGC39325基因定位于人染色体8q12[14]。
2.2 结构分析与功能预测结构分析的研究重点在于研究蛋白质的空间结构。
利用分子模拟技术结合计算机图形技术可以更形象、更直观地研究蛋白质等生物大分子的结构，蛋白质的空间结构的更清晰的表述和研究对揭示蛋白质的结构和功能的关系、总结蛋白质结构的规律、预测蛋白质肽链折叠和蛋白质结构等，都是有力的帮助和促进。
同时，也可以对已经被测定的生物大分子的三维结构进行显示和编辑操作。
分子模型的建立为下一步进行的分子模拟以及了解结构与功能的关系打下了基础。
蛋白质结构预测是利用已知的一级，二级序列来构建蛋白质的立体结构模型，对蛋白质进行结构预测需要具体问题具体分析，在不同的已知条件下对于不同的蛋白质采取不同的策略。
杨波等以LRP16 基因转录产物为目标序列，在人类基因组数据库中搜索开放阅读框<ORF），利用计算机辅助系统预测LRP16蛋白的一级结构、二级结构和三级结构；利用结构域搜索 LRP16 编码蛋白的同源或相似结构蛋白[15]。
2.3 蛋白质的同源性检索及系统发生进化树分析将推导出的蛋白质序列登录到NCBI网站( http：//www．ncbi．nlm．n ih．gov />上，用BL AST程序进行序列的同源性检索[16-18]。
王安娜等。
结果发现大豆的C4H蛋白质与绿豆、马铃薯、棉、辣椒、橄榄、烟草、律草属啤酒花等的 C 4 H蛋白质有着很显著的同源性。
在BLA ST p分析的基础上，选择与其同源性较高的几条序列做聚类分析，对C4H蛋白和其他C4H蛋白的同源性做进一步分析。
在DNAMA N 6.0 的Treeview显示的结果。
结果表明大豆C4H和绿豆的C4H亲缘关系最近，同源性达95％，来自于同一个分枝；其次是紫苜蓿、红车轴草、鹰嘴豆、豌豆,来自同—个次分枝[19]。
参考文献[1] 黎裕、王天宇、贾继增. 植物功能基因组学的发展现状与发展趋势. 生物技术通报 2000；6-10[2] 刘斌.生命科技的前沿领域，HIGH TECHNOLOGYANDINDUSTRIALIZATIONAUGUST 2006；48-54[3] Frary A, Nesbitt T.C, Frary A, Grandillo S, van der Knaap E, Cong B, Liu J, Meller J, Elber R, Alpert KB, TanksleySD. Fw2.2: A quantitative trait locus key to the evolution of tomato fruit size. Science, 2000, 289(期>: 85–88.[4] Li C, Zhou A, Sang T. Rice domestication by reducing shattering. Science, 2006, 311(5266>: 1936–1939.[5] Yan L, Loukoianov A, Blechl A, Tranquilli G, Ramakrishna W, SanMiguel P,Bennetzen JL, Echenique V, Dubcovsky J. The wheat VRN2 gene is a flowering repressor down-regulated by vernalization. Science, 2004, 303(5664>: 1640–1644.[6] 尹佟明 HEREDITAS (Beijing> 2018年7月, 32(7>: 677―684.[7] 黄骥张红生曹雅君钱晓茵杨金水水稻功能基因的电子克隆策略. 中国水稻科学,2002,16(4>。