第二章微生物纯培养
微生物考试复习资料
微生物学复习第二章纯培养和显微技术第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术(在分离、转接及培养纯培养物时防止其被微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术)o 用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；o 在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身也不污染环境；1. 微生物培养的常用器具（试管玻璃烧瓶培养皿）及其灭菌（高压蒸汽灭菌可杀死微生物休眠体：芽孢高压干热灭菌）2. 接种操作：在无菌条件下，用接种针或接种环挑取微生物，把它有一个培养皿转接到另一个培养皿进行的操作。
是微生物最常用的基本操作。
二、用固体培养基分离纯培养菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：在还固体培养基表面众多菌落连成一片时便成为菌苔。
不同微生物在特定的固体培养基上生长形成菌落和菌苔都具有稳定的特征，可成为对该菌落进行分类鉴定的重要依据。
培养平板：被用于微生物纯培养的最常用固体培养基形式它是冷却凝固后的培养基在无菌培养皿中形成的固体培养平面，简称平板。
以下各方法具体内容参见复印资料第10页1. 稀释倒平板法：操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！2、涂布平板法：使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！3. 平板划线法4.稀释摇管法三、用液体培养基分离纯培养1、稀释法2、富集培养四、单细胞（孢子）分离单细胞分离法：采取显微分离法从混杂群体中直接分离单细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。
五、选择培养分离选择培养分离：1）、抑制大多数其它微生物的生长；2）、使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。
3）、使待分离的微生物生长"突出"；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。
1、利用选择平板进行直接分离:根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件（抗生素平板牛奶平板高温培养）2、富集培养：利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应该条件的微生物旺盛生长，从而使其在菌落中的数量大量增加，是人们更容易从自然界中分离到这种所需的特定的微生物。
微生物的纯培养
使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落！
最基本的方法：
稀释！
无菌技术
无菌技术（aseptic technique）： 在分离、转接及培养纯培养物时防止其被 其他微生物污染的技术。
1. 微生物培养的常用器具灭菌 2. 接种（inoculation）： 无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到 另一个培养容器中进行培养。
4.选择培养分离法
微生物群落中数量占少数的微生物得到分离纯化：
使待分离微生物生长特征“突出”； 抑制大多数其它微生物的生长； 使待分离微生物生长更快。
使待分离微生物生长特征“突出”
颜色反应：分离特定的菌株
牛奶平板：分离蛋白酶产生菌
抑制大多数其它微生物的生长
高温下培养：分离嗜热细菌 培养基中不含N：分离固氮菌 培养基加抗生素：分离抗性菌
微生物
真 菌 原生动物 显微藻类
细 菌 放线菌 蓝细菌 支原体 立克次氏体 衣原体
病 毒 亚病毒
真核生物
原核生物
非细胞生物
微生物的纯培养
显微操作仪：显微镜下用显微针、
钩、环等挑取单个细胞或孢子。
毛细管法；
小液滴法。
纯培养(pure culture):
从一个细胞经过培养繁殖而得到的后代。
使待分离微生物生长更快。
富集培养:利用不同微生物间生命活动特点的不
同，制定特定的环境条件，仅使待分离微生物旺盛 生长，在群落中的数量大大增加，从而更容易地从 自然界中分离到所需的特定微生物。
微生物的纯培养
什么是微生物？
微生物是所有形体微小（一般<0.1mm）、单细胞或结构
较为简单的多细胞生物、甚至没有细胞结构的低等生物的统
《微生物纯培养技术》课件
纯培养技术可用于病原微生物的分离、鉴 定和药物敏感性试验，为临床诊断和治疗 提供依据。
微生物纯培养技术
02
的基本原理
微生物的分离与纯化
微生物的分离
通过选择合适的培养基和培养条件， 将混合的微生物群体分离成单一的微 生物个体。
微生物的纯化
通过反复划线、稀释接种等方法，获 得纯培养的微生物，即同一菌种或纯 种微生物的培养。
微生物的培养基
培养基的组成
培养基是由水、碳源、氮源、无机盐 等组成，根据不同微生物的需求，培 养基的成分和比例会有所不同。
培养基的制备
根据配方和操作步骤，将各种成分混 合在一起，经过灭菌处理后，制成适 合微生物生长的培养基。
微生物的培养条件
温度
不同微生物对温度的需求不同，适宜的 温度可以促进微生物的生长和代谢。
生理生化特性分析
测定微生物的生理生化特性，如氧化酶试验 、糖发酵试验等。
应用前景探讨
探讨微生物纯培养技术在生产、科研等领域 的应用前景和潜在价值。
微生物纯培养技术04Fra bibliotek的应用实例
在医学领域的应用
抗生素生产
01
微生物纯培养技术用于分离和培养具有抗生素产生能力的菌株
，为医学领域提供大量抗生素。
疾病诊断
《微生物纯培养技术》 ppt课件
目 录
• 微生物纯培养技术概述 • 微生物纯培养技术的基本原理 • 微生物纯培养技术的实验操作 • 微生物纯培养技术的应用实例 • 微生物纯培养技术的挑战与展望
微生物纯培养技术
01
概述
微生物纯培养技术的定义
01
微生物纯培养技术是指通过一定 的物理、化学手段，将自然界中 混杂的微生物群体分离出来，获 得纯种微生物的技术。
第2章 微生物的纯培养和显微技术
荧光显微镜
荧光：荧光素吸收紫外线会转放出可 见光，这就是荧光 荧光显微技术：把标本用不同的荧光 素作标记，在荧光显微镜下，经 过紫外线照射，标本会在黑暗背 景下表现出有光亮的物体。使标 本更便于观察。
透射电子显微镜
用电子波代替光源，最短波长的可见光 λ=450nm；而电磁波的波长最短可以达到 λ=0.005nm。所以，电镜的分辨率远高于光 学显微镜。
通冰箱冷冻室保存。
干燥保藏——砂土管保存法和冷冻真空干燥
保藏法
纸片保藏法、薄脉保藏法、寄主保藏法等
第二节 显微镜和显微技术
决定显微观察效果的两个重要因素：
分辨率：指能辨别两点之间最小距离的 能力 反差：指样品区别于背景的程度
一、显微镜的种类及原理
普通光学显微镜
光学显微镜的分辨率(最小分辨距)：
D=0.5λ/n sinθ
式中λ为光源波长； n为玻片到物镜介质的
折射率； θ为物镜镜口角的半数，它取决于物镜 的直径和工作距离。 n sniθ叫作数值孔径。不 同介质的折射率：空气为n=1.0 ；水n=1.33；香 柏油n=1.55。因此，油镜的分辨率高。
暗视野显微镜
暗视野显微镜利用特殊聚光器实现 给样品斜射照明，由样品反射或折射的
非细胞型微生物：病毒、类病毒、朊病毒
一、细菌和古生菌
•细菌的形态和排列
形态：球状—球菌，杆状—杆菌，螺旋状——螺菌和 弧菌。 排列：单个、成对、链状、成簇 特殊形态的细菌 如柄细菌有柄、菌丝、附器等 球衣菌有衣鞘 支原体无细胞壁，只有细胞膜，故柔软形态多变 有些细菌不同生长阶段具有不同形态：如放线菌 形成营养菌丝、气生菌丝和孢子丝。 细菌的形态也受环境条件的影响，培养时间、培 养温度等均能引起形态的改变。
微生物的纯培养(两篇)2024
引言：微生物的纯培养是一种重要的实验技术，它能够分离和培养单一微生物种类，为微生物研究提供了许多有用的工具和方法。
在上一篇文章中，我们介绍了微生物纯培养的基本概念和技术。
本文将进一步探讨微生物的纯培养，介绍一些新的方法和技术，以及它们的应用。
概述：纯培养是通过分离微生物，将其单独培养在适宜的培养基上，从而得到纯的微生物培养物的过程。
纯培养的重要性不言而喻，它不仅可以帮助我们了解微生物的生命周期和特性，还可以用于研究微生物的生理机制、遗传与基因组学以及应用领域，如微生物药物和工业应用等。
正文内容：1.微生物分离技术1.1基于落点法的分离技术1.2基于过筛法的分离技术1.3基于稀释法的分离技术1.4基于加热法的分离技术1.5基于波动法的分离技术1.6基于流式细胞术的分离技术2.微生物生理特性的研究2.1生长速率和生长曲线的测定2.2代谢产物的分析和鉴定2.3酶的活性测定2.4免疫学方法在微生物研究中的应用2.5细胞透过性和运输的研究3.微生物遗传与基因组学研究3.1突变体筛选和鉴定3.2基因工程技术在微生物研究中的应用3.3基因组学方法在微生物研究中的应用3.4转座子和重组技术的应用3.5CRISPRCas系统在微生物研究中的应用4.微生物在医药和工业领域的应用4.1微生物药物的开发和生产4.2微生物酶的应用4.3微生物在食品工业中的应用4.4微生物在环境修复中的应用4.5微生物在能源生产中的应用5.微生物纯培养的优化和自动化5.1培养基组分的优化5.2培养条件的优化5.3自动化培养设备的应用5.4全自动高通量筛选技术的应用5.5培养过程监测和控制的方法总结：微生物的纯培养是微生物研究中至关重要的技术之一。
本文通过介绍微生物分离技术、微生物生理特性的研究、微生物遗传与基因组学研究、微生物在医药和工业领域的应用以及微生物纯培养的优化和自动化等方面，展示了微生物纯培养的多个方面。
这些方法和技术的发展，为微生物学的研究提供了更加便捷和高效的工具和方法，促进了微生物学在科学和应用领域的进一步发展。
沈萍微生物学第二章
放线菌形态
放线菌生活史
放线菌孢子丝
2、古细菌
3. 原核生物的细胞大：纳米（nm10－9m） 细胞大小的形象比较
大肠杆菌：0.5×2um 芝麻：3mm
常见细菌的大小
球菌：直径 0.5×2um 杆菌：宽×长 0.5～1×1～5um 螺形菌：宽×长 0.5～1×1～50um
六，微生物的保藏技术 1.保藏的目的 2.保藏的原理 3.保藏的方法 传代培养 4℃ 冷冻保藏 -196℃， - 70℃ ， -20~-30℃ 干燥保藏 沙土管，安瓿管 其他方法
第三节
显微镜下的微生物
一， 细菌
细菌的定义： 以二分裂为主要繁殖方式的单细胞原核 微 生物。 1.细菌的形态和排列 三种基本形态：
杆菌
杆菌的基本形态
短杆状、长杆状、棒杆状、梭状杆状、月亮状、竹节状 等；按杆菌细胞繁殖后的排列方式则有链状、栅状、 “八”字状等
杆菌细胞的排列方式
链杆、栅状、八字状、鞘衣包裹的丝状等
短杆菌
长杆菌
梭状芽孢杆菌
Scanning electron micrographs illustrating external features of the rodshaped bacterium E. coli.
球状
一个分裂面 二个分裂面 三个分裂面 无定向分裂面
单杆，链杆，栅状 ，八字 弧菌，螺旋菌
杆状， 螺旋状
单球菌
细胞分裂沿一个平面进行， 新个体分散而单独存在. 如尿素微球菌
显微镜下示意图
双球菌
细胞沿一个平面分裂， 新个体成对排列. 如肺炎双球菌
四联球菌
细胞分裂是沿两个相垂直的平 面进行，分裂后每四个细胞特 征性地连在一起，呈田字形. 如四联微球菌
微生物的纯培养与显微技术
第二章 微生物的纯培养与显微技术
已知最小的独立生活的生命体
最小的基因组
（一）
骑火球纳米古生菌
(Nanoarchaeum equitan)
基因组500kb，直径 400nm
P379
第二章 微生物的纯培养与显微技术
最大的细菌
（一）
费氏刺骨鱼菌
80*600μm
纳米比亚硫珍珠菌
Φ750μm
第二章 微生物的纯培养与显微技术
高密度培养
又称高密度发酵，一般要求大肠杆菌 培养液浓度达到50g/L干重，应用于大 规模制备重组蛋白。
外源基因表达产量与细胞浓度正相关 。
（二）
第二章 微生物的纯培养与显微技术
纯培养的局限—二元培养物、不可培 养与混合培养
二元培养物：培养物 中只含有两种微生物 ，并有意识地保持两 者之间的特定关系。
第二章 微生物的纯培养与显微技术
光学显微镜观察样品的制备和染色
直接观察活体：可以避免染色固定时对
微生物结构的破坏，主要用来观察微生物的大 致形态和运动情况
压滴法 悬滴法 压(埋)片法
染色
微生物细胞一般透明
（一）
第二章 微生物的纯培养与显微技术
压滴法(水封片法)示意图
（一）
悬滴法示意图
（一）
第二章 微生物的纯培养与显微技术
宏基因组(Metagenome)是特定小生境中全 部微小生物遗传物质的总和—通过基因工 程获得新的功能基因。
（二）
第二章 微生物的纯培养与显微技术
将未培养的微生物转变成可培养的微生物
添加微生物生长所必需的营养成分 用低浓度的培养基来进行分离培养 新颖的分离培养方法
参考文献： 焦瑞身，2004，新世纪微生物学者的一项重要任务— 未培养微生物的分离培养，生物工程学报，20：641645
第二章--微生物的纯培养和显微技术
第二节 显微镜和显微技术
一、显微镜的种类及其原理 二、显微观察样品的制备 三、显微镜下的微生物
几个基本概念：
一、显微镜的种类及原理
1.普通光学显微镜（复式显微镜）
机械装置: 镜座、支架、载物台、调焦螺旋等 光学系统: 物镜、目镜、聚光镜等
使用油镜时加镜油的目的: (1)增加照明亮度 (2)增加显微镜的分辨率
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线 照射后可激发荧光；另有一些物质本身虽 不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗 体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧 光显微镜就是对这类物质进行定性和定量 研究的工具之一
105
荧 光 显 微 镜 观 察
5、 透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM)
原理：用一束电子作为它的能源，电子的波长很短，能够 检测极细微的物体，如病毒和分子。
应用：通过细胞超薄切片，观察细胞内部的详细结构如细 胞膜、细胞核等。（可放大几万倍）
6、 扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM)
原理：类似于电视或电传真照片。即利用电子“探针”，在 样品表面进行“扫描”，激发样品表面放出二次电子，二次电子由 探测器收集，并转变为光信号。
光学显微镜
光学理论依据
德国理学家Ernst Abbe，在19世纪70年代建立的 在Abbe的公式中，两物体之间的最小可分辨距 离被称为最小距离（d）
最小距离=0.5/nsin= 0.5/NA
分辨率（R) ∝ 1/d
分辨率(最小可分辨距离)=0.5λ∕ n sinθ = λ∕2NA
波长与分辨率
高压蒸汽灭菌锅
2、接种操作
接种工具： 白金or镍铬合金接种针/环
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毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微 生物。
显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢 子以获得纯培养。
小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在
显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的
分离。
第二章微生物纯培养
五、选择培养
为了从混杂的微生物群体中分离出某种 微生物，可以根据该微生物的特点，包括营 养、生理、生长条件等，采用选择培养的方 法进行分离。
1、涂布平板法（Spread Plate method）
步骤： 制板 稀释 加菌液 涂布 特点：简单易行，但易造成机械损伤
培养 挑菌落
第二章微生物纯培养
2、稀释倒平板法
步骤： 稀释 加菌液 浇培养基 培养
挑菌落
第二章微生物纯培养
1.取样
25g或25ml 检样
稀释样品的取样和倾注平皿
1mL
1mL
第二章微生物纯培养
2、富集培养
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同， 制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物 旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，更 容易从混杂的群体中分离到特定的微生物。
富集条件可从多方面选择，如温度、pH、紫外 线、高压、光照、氧气、营养等等。
例如：分离产芽孢细菌，可以对样品进行高温处 理，然后再进行培养。
第二章微生物纯培养
第二章微生物纯培养
六、微生物的保藏技术
基本要求：
保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被 杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。
用于长期保藏的原始菌种称为
保藏菌种或原种（stoch culture）。
第二章微生物纯培养
菌种保藏的原理
首先，要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用它们 的休眠体进行保藏。
将待分离的样品进行连续稀释得到高度稀释的 效果, 如果经过稀释后的大多数试管中没有微生 物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可 能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.
这种方法适合于第二细章微生胞物纯较培养 大的微生物.
四、单细胞（单孢子）分离法
采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或 单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在
第二章微生物纯培养
第二章微生物纯培养
要点
接种环境消毒灭菌 酒精棉球消毒双手 开启的管口、瓶口靠近灯焰 拔出的棉塞勿触及任何地方 动作快，接种时间勿太长
必 备
第二章微生物纯培养
纠错
使用过的废液可以直接倒在水槽中 棉塞随意丢在桌上 将食物和饮料带入实验室内 做完实验未洗手就离开
第二章微生物纯培养
1ml无菌水
1：10稀释液 225mL无菌水
1mL
9mL稀释液 1：100
1mL
9mL稀释液 1：1000
1mL
每个稀释度
做两个平皿
1mL
1mL
1mL
1mL
倾注平皿
将 凉 至 46℃ 营 养 琼 脂 培 养 基 注 入 平 皿 约15ml，并转动平皿，混合第二均章匀微。生物纯培养
第二章微生物纯培养
微生物学
第二章 微生物的纯培养和显微技术
第二章微生物纯培养
基本概念
1、微生物的纯种分离：
将多种混杂的微生物，经某种技术或方法分离 或纯化的过程。
2、微生物的培养物（culture)：
在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物 群体。
纯培养物（pure culture)：在人为规定的条件下 培养、繁殖得到的只有一种微生物的培养物。
1、传代培养保藏方法
①斜面低温保藏法
方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。
1、利用选择培养基进行直接分 离
2、富集培养
第二章微生物纯培养
1、选择平板培养
根据微生物的特点，在培养基中加入一些抑制 剂，使不需要的菌不生长，需要的菌生长后有 一定特征，然后挑取单菌落。
分离抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平 板上分离。
分离蛋白酶产生菌，可在培养基中加入牛奶 或酪素，蛋白酶产生菌在平板上生长会形成透 明的蛋白质水解圈。
其次，创造一个使微生物代谢不活泼、生长受抑制的 环境条件（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）。
再次，添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏过程中 细胞受伤。
第二章微生物纯培养
菌种保藏的方法
一种良好的菌种保藏方法
保持原菌的优良性状长期稳定 方法的通用性 操作的简便性 设备的普及性
第二章微生物纯培养
第二章微生物纯培养
第二章微生物纯培养
3、菌落（colony):
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、 繁殖到一定程度形成的肉眼可见、有一定形态结构的子细胞 生长群体。当固体培养基表面众多菌落连成一片时便成为菌 苔。
4、培养平板（culture plate):
冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中所形成的培养 基固体平面，简称平板，是用于微生物纯培养的最常用的固 体培养基形式。
Байду номын сангаас
第二章微生物纯培养
3、平板划线法（Streak Plate）
步骤： 制板 接种环灭菌 挑菌落/ 菌液 划线 培养 挑菌落
特点：快速、方便。
第二章微生物纯培养
4、稀释摇管法（厌氧培养法） 用于厌氧菌的培养
灭菌石蜡 和固体石 蜡密封
第二章微生物纯培养
第二章微生物纯培养
三、用液体培养基获得纯培养
第二章微生物纯培养
第二章微生物纯培养
第二章微生物纯培养
• 2.灭菌方法
★高压蒸汽灭菌 干热灭菌 紫外线灭菌 过滤除菌 火焰烧灼
第二章微生物纯培养
第二章微生物纯培养
• 3.操作环境
第二章微生物纯培养
• 4.操作过程
必 备
第二章微生物纯培养
No Image
第二章微生物纯培养
无菌操作箱
第二章微生物纯培养
哪个正确？
第二章微生物纯培养
谁的操作比较规范？
第二章微生物纯培养
二、用固体培养基获得纯培养
适用于大多数细菌、酵母菌以及许多真菌和单 细胞藻类。 1、涂布平板法（Spread Plate method） 2、稀释倒平板法 3、平板划线法（Streak Plate） 4、稀释摇管法（厌氧培养法）
第二章微生物纯培养
第二章微生物纯培养
第一节 微生物的分离和纯培养
一、无菌技术的定义和意义
无菌技术（aseptic technique）
在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物 污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术 。 它是保证微生物学研究正常进行的关键。
第二章微生物纯培养
• 1.微生物培养的常用器具