第二章微生物的纯培养和显微技术
第二章微生物的纯培养和显微技术
第二章微生物的纯培养和显微技术第二章微生物的纯培养和显微技术第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术。
1、微生物培养的常用器具及其灭菌（1）试管、玻璃烧瓶、培养皿。
（2）高压蒸汽灭菌，杀灭所有的微生物，包括休眠体，同时可保持培养基的营养成分不被破坏。
（3）高温干热灭菌。
2、接种操作无菌条件下，用接种环在火焰附近进行操作，或在无菌操作箱或操作室内进行。
二、用固体培养基获得纯培养1、菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
2、涂布平板法3、稀释倒平板法4、平板划线法5、稀释摇管法对氧气更加敏感的厌氧型微生物。
先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂融化后冷却，将微生物进行梯度稀释，冷凝后，在琼脂表面倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基隔开。
三、用液体培养基获得纯培养对一些个体大的细菌、许多原生动物、藻类。
稀释法。
接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。
经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。
只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类。
四、单细胞（孢子）分离采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。
较大的微生物较容易，个体较小的较难。
对较大微生物，用毛细管提取个体，在低倍显微镜下操作；对较小微生物，采用显微操作仪。
五、选择培养根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制大多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，培养一段时间后，通过平板稀释等方法进行纯培养分离。
1、选择平板培养2、富集培养制定特定的环境，使仅适应于该条件的微生物生长。
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S光滑型菌落 光滑型菌落 R粗糙型菌落 粗糙型菌落
M粘液型菌落 粘液型菌落
菌落类型
粘稠、有光泽、 粘稠、有光泽、似水 珠样， 珠样，多见有厚荚膜 或丰富粘液层的细菌
培养平板： 培养平板：用于获得微生物纯培 养的常用的固体培养基形式， 养的常用的固体培养基形式，它是 冷却凝固后的固体培养基在无菌培 养皿中形成的培养基固体平面， 养皿中形成的培养基固体平面，常 称为平板。 称为；
厌氧微生物分离方法
①物理方法 抽气法——将培养物置真空干燥器中抽真空， 将培养物置真空干燥器中抽真空， A、抽气法 将培养物置真空干燥器中抽真空 再培养。 再培养。 充气法——把培养物放一密闭贮器中充入N2 把培养物放一密闭贮器中充入N B、充气法 把培养物放一密闭贮器中充入 排尽空气） （排尽空气） ②化学方法 化学吸氧法——利用化学反应耗氧达到形成厌 A、化学吸氧法 利用化学反应耗氧达到形成厌 氧环境的目的。 氧环境的目的。 用焦性没食子酸（1g） NaOH（10%） ⑴用焦性没食子酸（1g）与NaOH（10%）反应除氧 100ml空气中的O2） 空气中的O2 （100ml空气中的O2）
Plate） 2、平板划线分离法（Streak Plate） 平板划线分离法（
特点：快速、方便。 特点：快速、方便。 浓度较大的样品 分区划线（适用于浓度较大的样品） 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品） 浓度较小的样品 连续划线（适用于浓度较小的样品）
划线分离后平板上显示的 菌落照片（右图） 菌落照片（右图）
一、无菌技术
一、无菌技术 分离—— ——把自然界中以混杂状态生长在一起的 分离——把自然界中以混杂状态生长在一起的 各类微生物单个分开。 各类微生物单个分开。 筛选—— ——根据菌种的形态特征和生理特征的不 筛选——根据菌种的形态特征和生理特征的不 同结合生产实际的要求，灵活地、 同结合生产实际的要求，灵活地、有的放矢 地设计出各种优选方法以便快速而准确地挑 地设计出各种优选方法以便快速而准确地挑 选出所需要的菌种。 选出所需要的菌种。 无菌技术：在分离、 1、无菌技术：在分离、转接及培养纯微生物 时防止其被其它微生物污染， 时防止其被其它微生物污染，其自身也不污 染操作环境的技术。 染操作环境的技术。
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▲ 子实体
大
侧
型
耳
真
菌
（2）霉菌的形态
分枝或不分枝。管状。
在固体培养基上 营养菌丝：部分菌丝伸入培养基
内吸收养料。
气生菌丝：菌丝伸入空中生长 繁殖菌丝：由气生菌丝发育到一
定阶段分化而成。
（3）与人类的关系
人类实践活动中最早认识和利用的一类微生物。
■制曲、酿酱等发酵食品 ■发酵工业：生产酒精、柠檬酸、酶制剂 ■农业：饲料发酵、生产赤霉素、杀虫农药、除草剂 ■堆肥腐熟 ■引起农副产品、衣物、食品、器材发霉 ■引起动植物体病害：黄曲霉
单细胞
三种基本形态
球状菌 杆状菌 螺旋状菌
弧菌 螺菌
（1） 球状菌
球状或扁圆状
单球菌（尿微球菌） 双球菌（肺炎双球菌） 链球菌（乳酸链球菌） 四联球菌（四联细球菌） 八叠球菌（尿素八叠球菌）
葡萄球菌（金黄葡萄球菌）
▲单球菌
分裂后的细胞分散而单 独存在的球菌. 如尿素微球菌 (Micrococcus ureae
小单胞菌属
形态：只有基质菌丝，上生孢子梗，顶生一 个孢子。
特性：产庆大霉素 繁殖：孢子生殖
弗兰克氏菌属
赤
杨
形态特性：共生菌。与 非豆科木本植物根形成 根瘤。固氮。不易人工
形 成 根 瘤
根 与 弗 兰 克
培养。
氏 菌
繁殖：孢囊孢子生殖。
放线菌属于细菌，在防病治病、工农业生产中 有特殊重要性。
粮食、食物、用具、器材。耐较酸环境。
二 真核微生物的个体形态
1 霉菌（mold） 2 酵母菌（Yeast） 3 大型真菌 4 藻类（Algae） 5 原生动物（Prokaryote）
1 霉菌（mold）
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数值孔径最大值为1.4，这个数值在理论 上和技术上都达到了极限
数值孔径与其他技术参数有着密切 的关系，它几乎决定和影响着其他各项 技术参数。它与分辨率成正比，与放大 率成正比，与焦深成反比，NA值增大， 视场宽度与工作距离都会相应地变小
二． 分辨率 辨率又称“鉴别率”，“解想力”。是 衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。
最经典的复式显微镜:Zeiss实验 室显微镜这种显微镜与我们今天所使 用的一些普通显微镜一模一样.事实上, 我们现在所使用的一些普通型显微镜 的结构都是以它为模板的，由于这种 显微镜性能好,价格低廉(在中国都只卖 400多元,而好的显微镜的价格都在几千 到几万元),所以在一上市的时候就得到 了人的青睐,很快占领了各大实验室和 医院等地方.成为至今为止最畅销的复 式显微镜,为科学的发展作出了巨大贡 献.
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1、稀释倒平皿法
首先把微生物悬液通过一系列稀释， 取一定量的稀释液与熔化好的保持在 40~50°左右的营养琼脂培养基充分混 合，然后把这混合液倾注到无菌的培养 皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒 箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形 成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重 复上述步骤数次，便可得到纯培养物。
(1) 接种 灭菌
(2) 开启棉 塞
(3)管口灭菌
(4)挑起菌苔
(5) 接种
(6)塞好 棉塞
然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过 火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免 残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。 平板接种时，通常把平板的面倾斜，把 培养皿的盖打开一小部分进行接种。在 向培养皿内倒培养基或接种时，试管口 或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶 口应倾斜一下在火焰上通过。
放大率也是显微镜的重要参数，但也不 能盲目相信放大率越高越好，在选择时 应首先考虑物镜的数值孔径。
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选择因子：营养选择因子——淀粉 环境选择因子——65℃高温
练习题：
如何利用选择培养基筛选：
（1）抗链霉素（str）细菌？ （2）降解利用尿素的细菌？ （3）分解利用纤维素的细菌？
2、富集培养
当待分离样品中目的微生物数量少时，创造
目的微生物特定生长条件，使其数量增加，
再进行有效分离的技术称为富集培养，是分
同一稀 释度 培养
20支
生长者为纯培养物
例如：若同一稀释度的试管中有95%表现为不生 长,则生长的试管中： 含一个细胞的几率为：4.8%； 含二个细胞的几率为：0.12%； 含三个细胞的几率为：0.002%
0.048
0.048 + 0.0012 + 0.0002 = 0.975
在有细菌生长的试管中得到纯培养的几率为97.5%
混合培养物 二 元 培 养 物
纯培养物
一、无菌技术（aseptic technique)
纯种分离、转接、纯种培养过程中为保持纯 种的“纯洁”性而防止其它微生物污染的技 术。 要求：用于分离、培养微生物的器具事先不 含任何微生物； 在转接、培养微生物时防止 其它微生物的污染； 1、 所用物品的灭菌技术 A、玻璃或金属器皿灭菌 干热灭菌：热空气160－170 ℃2小时 B、培养基或溶液灭菌 高压蒸汽灭菌： 121 ℃ 、30分钟
离微生物菌种最强有力的技术手段之一
例：从土壤中分离能降解利用对羟基苯甲酸
的细菌（见图）
富集培养
选择培养 基分离
验证
练习题：
1、 如何从土壤中分离筛选高温（70℃） 解烃细菌？ 2、 如何从污染废水中分离筛选苯胺降解 细菌？
六、微生物的保藏技术
（在第八章微生物遗传中讲授）
第二章：微生物的纯培养与显微技术
第二章：微生物的纯培养与显微技术1、微生物学基础实验技术—分离、培养与显微技术对建立微生物学的意义；微生物由于个体微小，绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性，微生物物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。
由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和保证结果的可重复性，因此，把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。
相应地，微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。
2、如何理解过大、过小的（微）生物其生长速度都较慢？答疑的时候老师也没完全说明白3、常见光学显微镜、电子显微镜的种类以及它们的特点、应用范围？常见光学显微镜有普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜等。
●普通光学显微镜：利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，放大倍数最高只能达到1000~1500倍。
最小可分辨距离（，，分别表示光源波长、介质折射率、物镜镜口角的半数）。
观察经染色的细胞。
●暗视野显微镜：利用聚光器实现斜射照明，光线由样品反射或折射后进入物镜，因此视野是暗的而样品是亮的，样品与背景反差增大。
主要用于观察生活细菌的运动性，看不见内部细微结构。
●相差显微镜：细胞各部分的折射率及厚度差异→光程差→相位差→环状光阑和相差板→振幅差（明暗差）。
用于观察在普通光学显微镜下不易看到的活细胞和细胞内的细微结构。
N。
●荧光显微镜：紫外线照射下，发荧光的物体在黑暗背景下表现为光亮的有色物体。
可观察特异的细胞，应用于免疫学、环境微生物学、分子生物学。
常见电子显微镜有透射电子显微镜、扫描电子显微镜等。
●透射电子显微镜：以波长比可见光短得多的电磁波取代可见光来成像，可提高分辨能力。
电镜镜筒中为高真空，采用电磁圈来汇聚光线，用荧光屏来观察或用胶片记录影像。
N。
●扫描电子显微镜：电子束被磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，激发样品表面放出二次电子。
第二章微生物的纯培养与显微技术
生 物 安 全 柜
(二） 用固体培养基分离纯培养
1. 稀释倒平板法 2. 涂布平板法 3. 平板划线分离法 4. 稀释摇管法——厌氧微生物的分离
1. 稀释倒平板法
2. 涂布平板法
将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制 成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某 一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再 用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平 板表面，经培养后挑取单个菌落。
3. 载物台
• 镜臂下端安装的一个向前伸出的平面台叫 做载物台。 • 用于放置观察用的玻片标本，载物台中央 有一圆孔，叫通光孔。 • 通光孔左右两旁一般装有一对弹簧夹，为 固定玻片之用，有的装有移片器，可使玻 片前后左右移动。
镜筒与物镜转换器
• 4. 镜筒：安装在镜臂上端的圆筒叫做镜筒， 上端安装目镜，下端连接转换器。 • 5. 物镜转换器：镜筒下端的一个能转动的 圆盘叫做转换器。 • 其上可以安装几个接物镜，观察时便于调 换不同倍数的镜头。
参考网站
食品伙伴网 食品伙伴网
http://202.116.45.198/wswx/couse
1.目镜：
• 由二、三片透镜组成，安装在镜筒上端， 也叫接目镜。 • 在目镜上方刻有5×、10×、20×等为放大 倍数。 • 从外表上看，镜头越长放大倍数越低。
2.物镜：
• 由数组透镜组成，安装在转换器上，又称接物镜 • 每台显微镜上常备有几个不同倍数的物镜，物镜 上所刻8×、10×、20 ×、40×等就是放大倍 数，习惯上把10－20倍的叫做低倍物镜；40－ 60倍的叫做高倍物镜；90－100倍的叫做油镜。 • 从形态上看，接物镜越长，放大倍数越高。 • 显微镜的放大倍数，粗略计算方法为接目镜放大 倍数与接物镜放大倍数的乘积。 • 如观察时所用物镜为40×、目镜为10×，则物 体放大倍数为40×10＝400倍。
第二章微生物的纯培养和显微镜技术
第二章微生物的纯培养和显微镜技术2．纯培养和显微技术一、纯培养技术1、无菌技术包括两方面的内容：（1）用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；(2)在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身也不污染环境；2、分离纯化技术（1）固体培养基分离纯培养技术微生物个体微小，常以群体混合状态存在，将单个细胞从群体中分离出来，即纯培养。
菌落：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：众多菌落连成一片。
获得纯培养的方法有：倾注平板法：操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！涂布平板法：使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！平板划线法：厌氧微生物的分离：（2）液体培养基分离纯培养稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。
（3）选择培养分离：抑制大多数其它微生物的生长；使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。
使待分离的微生物生长“突出”；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。
3、单细胞分离技术用显微操作仪，在显微镜下进行。
难度与细胞或个体的大小成反比，局限于高度专业化的科学研究中。
4、选择培养分离选择平板：抑制大多数微生物不能生长，或具区别特征的直观结果。
富集培养：造成有利于某种菌生长的环境。
（1）利用选择平板进行直接分离高温培养分离嗜热菌，培养基中不含有N，分离固氮菌；培养基中含有抗生素分离抗生菌。
牛奶培养基分离产蛋白酶菌株。
（2）富集培养利用不同微生物之间的生长特性不同，制定特定的环境条件，使仅适合条件的微生物旺盛生长，从而使其在为生物群落中的比率大大增大，易于从群落中间将墓地君主分离出来。
5、二元培养物培养物中只含有二种微生物，而且有意识地保持二者之间的特定关系的培养物。
如病毒与宿主；蛭弧菌与和E.coli.6、微生物的保藏技术影响微生物菌种稳定性的因素：a. 变异；b. 污染；c. 死亡基本要求：在一定时间内使菌株不死，、不变、不乱基本方法生活态：培养基传代培养（斜面、平板、半固体），多见于冰箱4℃培养。
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•
•接种操 作
•
二、用固体培养基分离纯培养
菌落：单个微生物在 适宜的固体培养基表 面或内部生长、繁殖 到一定程度可以形成 肉眼可见的、有一定 形态结构的子细胞生 长群体。
菌苔：当固体培养基 表面众多菌落连成一 片时，便成为菌苔。
•
•
菌落
无菌水、梯度稀释、50℃左右的琼脂培养基、灭过菌 的培养皿。注意要稀释得当。
分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到 纯培养。
•
•稀释倒平板法
Pour plate
•
涂布平板法
无菌水、梯度稀释 涂布平板
•Spread plate
•
稀释倒平板法和涂布平板法
•
平板划线分离法
•
稀释摇管法
•
第二节 显微镜和显微技术
显微镜的种类及原理 显微观察样品的制备
•
一、显微镜的种类及原理
普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 扫描隧道显微镜
•
普通复式光学显微镜
普通生物显微镜由三部分构成： ➢ 照明系统：包括光源和聚光器。 ➢ 光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显 微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜 和物镜都由复杂的透镜组构成。 ➢ 机械装置：保证光学系统的准确配制，用 于固定材料和观察方便。
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件 ，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大 增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。
富集条件：物理、化学和生物等。以从土壤中分离能降解酚类化合物对 羟基苯甲酸的微生物的实验为例。
•
六、微生物的保藏技术
菌落或菌苔是对微生物进行分类和鉴定的重要依据。
•细菌菌落特征剖面图
•
菌落
•细菌菌落特征正面图
•
培养平板
培养平板（平板）：指熔化的固 体培养基倒入无菌平皿，冷却凝 固后，盛有固体培养基的平皿。
•
平板分离微生物纯培养技术
稀释倒平板法 涂布平板法 平板划线分离法 稀释摇管法
•
1、稀释倒平板法：
用于分离严格厌氧菌。先将一系列盛有无菌琼脂培养基 的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待 分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均 匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固 体石蜡的混合物，将培养基与空气隔开。
•
三、用液体培养基分离纯培养
用于细胞大的细菌、原生动物和藻类等的 纯化分离。
第二章微生物的纯培养 和显微技术
2020年7月9日星期四
第一节 微生物的分离和纯培养
无菌技术 用固体培养基分离纯培养 用液体培养基分离纯培养 单细胞（单孢子）分离 选择培养分离
•
一、无菌技术
无菌技术：在分离、转接及培 养纯培养(物)时防止其被其他 微生物污染的技术。
•
保持无菌的方法
。 橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温
保存。 4℃保。
•
2、冷冻保藏
代谢作用停止。 细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比
有细胞壁敏感。其原因是低温会使细胞内水分形成冰晶， 从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。 速冻及快速解冻可减少损伤；还可加一些保护剂，如0.5% 左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱 水作用而保护细胞； 大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各 种保护剂以提高培养物的存活率。
保藏期间微生物不死亡、不污染、不会因发生 而丢失重要的生物学性状。
许多国家都设有相应的菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会 美国典型菌种保藏中心 世界菌种保藏联合会等
•
菌种保藏
菌种保藏：就是根据菌种特性及保藏目的 的不同，给微生物菌株以特定的条件，使 其存活而得以延续。
对于生产中使用的菌种保藏培养基， 要求比较丰富的氮源，以防止菌种退 化变质。
•
冷冻真空干燥保藏
是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在 真空下通过水的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在 真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物 处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以 达到长期保藏的目的。
用水升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的 程度相对比较小，存活率及保藏效果均不错，是目前使用 最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。
稀释法：经高度稀释后，同一个稀释度的 试管中大多数（95%以上）表现不生长，很 可能得到的是纯培养。
•
四、单细胞（单孢子）分离
单细胞分离：采取显微分离法从混杂群体中直接 分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养 。
单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比 。个体较大的可在低倍显微镜下进行，个体较小 的则需采用显微操作仪。
•
五、选择培养分离
当某一种微生物所存在的数量与其他微 生物相比非常少时，单采用一般的平板 稀释方法几乎是不可能分离到该种微生 物的，故需采用选择培养分离法。
•
1、利用选择培养基进行直接分离
如要分离高温菌，可在高温条件进行 培养；要分离某种抗生素抗性菌株， 可在加有抗生素的平板上进行分离。
•
2、富集培养
•
3、干燥保藏法
沙土管保存和冷冻真空干燥保 藏是最常用的二项微生物干燥 保藏技术。
•
沙土管保存
一般将菌种接种至斜面，培养至长出大量的 孢子后，洗下孢子制备孢子悬浮液，加入无 菌沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干 ，最后用石蜡、橡胶塞等封闭管口，置冰箱 保存。此法主要适用于产孢子的微生物，如 芽孢杆菌、放线菌等，保藏时间相对较长。
•
菌种保藏方法
连续移接 改变条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）
使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到 半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得 到保藏，有的可保藏几十年或更长的时间。 在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物 恢复活力。
•
1、传代培养保藏
是微生物保存的基本方法。 琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等
•
分辨率
重要性能参数。 显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，
还与显微镜的分辨率（resolution）有关。 分辨率是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm
处）能分辨物体最小间隔的能力。 分辨率的大小决定于光的波长和镜口角以及