临床生物样品分析方法
生物样本分析
1、生物样本种类，特点，及前处理方法1）血液。
分为血浆/血清或全血。
测定血浆或血清中的药物浓度能较好的反映体内药物浓度变化。
若专门测定平均分布于血细胞内外的药物浓度，则用全血。
血浆采集应加入抗凝剂。
离心，取上清液，血清静置，移走血饼，离心，取上清液。
处理方法有沉淀蛋白法、液液萃取法、固相萃取法。
2）尿样，用于药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度研究。
易收集，但易受生理情况影响。
方法：酸解或酶解可使药物从缀合物中游离出来。
3）唾液：易收集，采集后应立即出去泡沫部分的体积，放置后易分层，离心，取上清液。
4）组织：为药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程提供重要信息。
组织处理方法：匀浆化法，蛋白沉淀法，酸碱水解，酶水解5）头发：取样方便，无伤害，检样的掺伪可能性低，可测微量元素。
头发采集后需洗涤，处理方法有提取法，有机破坏法。
6）其他：乳汁，精液。
2、生物样品前处理方法及特点1）有机破坏法：包括湿法破坏、干法破坏和氧瓶燃烧法，适合人发样品的破坏破坏能力强，反应激烈。
2）直接沉淀法：将一定量生物样品加蛋白沉淀剂，涡旋，离心，取上清液进样。
当样品中待测物浓度较高，所用方法的特异性和灵敏度达到检测要求时可以考虑用直接沉淀法。
注意沉淀剂体积、沉淀剂的选择及对药物稳定性的影响（氧化、酸不稳定）。
可使接合型药物释放出来，缺点容易乳化。
3）液液萃取法：取一定量生物样品加有机提取溶剂，涡旋，离心，取有机层，氮气吹干，流动相溶样进样。
多数药物亲脂，在适当有机溶剂中溶解度大于水相，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性水溶性物质，液液萃取可除去大部分杂质，从大量样品中提取药物经浓集后用于分离。
注意水相pH值，提取溶剂以及有机相和水相的体积，优点在于选择性，这依赖于有机溶剂的选择。
药物能与多数内源性物质分离，缺点在于乳化现象的产生：有机溶剂易挥散、有毒性、对环保不利及不能自动化。
4）固相萃取法：将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附或分配或离子交换或其它亲和力作用时，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂洗出杂质，再用适当溶剂洗脱药物。
生物样品分析方法的基本要求
生物样品分析方法的基本要求目录一、内容概述 (2)1.1 目的与意义 (3)1.2 生物样品分析的重要性 (3)二、生物样品的采集与保存 (4)2.1 采样原则与方法 (5)2.2 样品类型及采集量 (6)三、生物样品的前处理 (8)3.1 提取与分离 (9)3.2 净化与富集 (10)3.3 样品制备过程中的注意事项 (12)四、分析方法的建立与验证 (13)4.1 分析方法的选择 (15)4.2 方法学考察 (15)4.3 确证实验设计与实施 (17)五、生物样品分析质量控制 (18)5.1 质量保证与控制体系 (19)5.2 检测方法的性能指标 (21)5.3 质量控制图的绘制与应用 (22)六、生物样品分析结果的报告与解释 (24)6.1 结果报告的内容与格式 (25)6.2 结果的解释与判断 (27)6.3 异常值的分析与处理 (28)七、生物样品分析方法的应用与发展趋势 (30)7.1 应用领域与案例分析 (32)7.2 新技术、新方法的发展趋势 (34)一、内容概述生物样品分析方法的基本要求是针对生物样本进行科学研究的基础工具与技术方法的具体规范，主要涉及到实验设计、样本采集、样本处理以及分析方法等内容。
本文内容概述将概述该分析方法的整体框架与核心内容。
本文将阐述生物样品分析的基本目的和意义，强调其对于生物科学研究的重要性。
会介绍分析方法的实验设计部分，包括实验对象的选取原则、实验设计的合理性和科学性等要求。
本文将详细介绍样本采集的要求，包括采样点的选择、采样时间的选择以及采样技术的标准化等。
本文将重点介绍样品处理过程，包括样品的保存、预处理以及化学或物理性质的调整等步骤，以确保样品的完整性和准确性。
本文将强调分析方法的建立与优化，包括实验技术的选择与应用、数据分析与解读等关键环节，以确保分析结果的准确性和可靠性。
生物样品分析方法的基本要求涵盖了实验设计、样本采集、样本处理和分析方法等多个方面，旨在确保生物样品分析的准确性和可靠性，为科学研究提供可靠的实验数据支撑。
生物样品的常用分析方法
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紫外分光光度法（UV）
原理同比色法。适用于测定具有紫外 吸收的药物。 体内药分中母体药物与代谢物的紫外 吸收光谱非常相似，易产生干扰。受灵敏 度和选择性的限制，其在体内药分中的应 用也呈下降趋势。
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荧光分析法 （Fluorescence method） 利用物质经光照射后能发射荧光的特性 进行分析的光学分析法。
参考文献：涡流色谱技术在生物样品分析中的应用 刘朋，周建良，安婧婧，李萍，Chinese Journal of Chromatography
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光谱法(Spectroscopy)
光谱法是基于检测能量（电磁辐射） 作用于待测物质后产生的辐射信号或所 引起的变化的分析方法。
特点
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薄层扫描法 (TLCS)
实例：薄层扫描色谱法检测血清中对乙酰氨基酚 采用TLCS法检测患者血清中对乙酰氨 基酚的浓度，为临床急诊中毒分析和血药浓 度监测提供了快速简便的方法。 该法板间测定误差小、回收率高、线 性范围宽，能准确测定患者血药浓度。与文 献报道的HPLC和GC法相比，具有简便快 速、样品用量少、费用低和不需要进行衍生 化等优点 。
体内药分专题之五—— 生物样品常见分析方法
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思考
1.在体内药物分析中所采用的生物 样品有哪些? 2.最常用的生物样品是什么? 3.药物分析中常见分析方法包括哪 些?哪些适用于体内药物分析?
生物样品的常用分析方法
体内药物分析是借助于现代化的仪器 与技术来分析药物在体内数量与质量的变 化，以获得药物在体内的各种药代动力学 参数、代谢方式、代谢途径等信息。目前， 用于生物样品分析的方法有很多，归纳起 来主要有以下几类：
第05章第四节生物样品分析方法的基本要求
第四节
Hale Waihona Puke 生物样品分析方法的 基本要求
二、样品的储存
血浆和血清都必须在采血后即时分离。否则，血凝 后冰冻保存，则因冰冻时引起细胞溶解，而阻碍血浆 或血清的分出，同时因溶血而影响药物浓度变化。 冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1~2d)
冷冻—冷柜(-20℃)或低温冷柜(-80℃) 中长期保存
尿样宜立即测定，否则应加入防腐剂或低温冷藏。
四、简述容量分析法的特点及计算公式？
五、紫外吸收光谱有什么特征？哪些特征和常数可作为 鉴定药物的定性定量指标？
思考题
六、简述紫外分光光度法在药品质量标准中的应 用。 七、简述HPLC法中系统适用性试验的意义与内容。 八、HPLC法定量的分析方法哪些？各人何特点？ 九、药物分析方法的选择原则？比较几种定量分 析方法的特点并指出适用范围。 十、简述准确度与精确度的定义以及它们之间的 关系？ 十一、什么叫有效数字？如何正确运用有效数字 的运算规则来表示分析结果？
加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一 定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用
第四节
(二)
生物样品分析方法的 基本要求
缀合物的水解
尿中药物多呈缀合状态。一些含-OH，COOH，-NH3，-SH的药物可与内源性物质葡 萄糖酸或硫酸形成葡糖酸苷或硫酸缀合物。
1）酸水解 2）酶水解
第四节
(三) 有机破坏
生物样品分析方法的 基本要求
习
题
十六、取维生素B2 20片,精密称得重量为 1.6011g，研细，精密称取片粉0.1518g， 置于１000ml量瓶中，溶解．于444nm波 长处测得吸收度为0.312,按C17H20N4O6的 吸光系数为323计算。求维生素Ｂ２的标 示百分含量（标示量５mg/ 片）．(101.9%)。
生物样品分析方法
生物样品分析方法生物样品分析是一项重要的实验技术，用于研究生物体内的成分、结构和功能。
为了获得准确的结果，需要采取适当的样品处理方法和分析技术。
以下将介绍几种常见的生物样品分析方法。
首先是DNA/RNA提取与分析。
DNA/RNA是生物体内遗传信息的载体，其提取与分析可用于研究基因的表达、变异和调控等。
DNA/RNA提取方法一般包括细胞溶解、裂解、蛋白酶处理、有机溶剂萃取和纯化等步骤。
分析方法主要包括凝胶电泳、PCR、RT-PCR和测序等。
其次是蛋白质提取与分析。
蛋白质是生物体内执行生物学功能的重要分子，其提取与分析可用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用。
常用的蛋白质提取方法包括细胞裂解、亲和层析、电泳分离和质谱分析等。
分析方法包括SDS-PAGE、Western blot、质谱分析和免疫共沉淀等。
另外是细胞及其器官提取与分析。
细胞是生物体的基本功能单位，其提取与分析可用于研究细胞结构、代谢和信号转导等。
细胞提取方法包括胰酶消化、细胞裂解和亚细胞分离等。
常用的细胞分析方法有细胞计数、流式细胞术、显微镜观察和细胞共培养等。
器官提取方法则与具体器官的特性相关，例如心脏、肝脏和肾脏等。
此外，还有组织提取与分析。
组织是生物体内多个细胞的集合体，其提取与分析可用于研究组织的结构、功能和病理过程等。
组织提取方法包括机械破碎、体外培养和酶消化等。
常用的组织分析方法有组织切片、组织染色、免疫组织化学和组织内分子分析等。
最后是体液样品提取与分析。
体液样品如血液、尿液和脑脊液等含有丰富的生物分子，其提取与分析可用于研究疾病的发病机制和诊断标志物等。
体液样品提取方法一般包括离心、沉淀和过滤等步骤。
常用的体液分析方法有生化分析、免疫分析、代谢分析和分子诊断等。
总之，生物样品分析方法在生命科学研究和临床诊断中起着重要作用。
通过采用适当的提取与分析技术，可以获得关于DNA、RNA、蛋白质、细胞、组织和体液样品的详细信息，从而推动生物医学研究和疾病治疗的进展。
第四节生物样品分析方法的基本要求在测定生物样品中药物
常用的烷基化试剂：碘庚烷、 叠氮甲烷、氢氧化三甲基苯胺 （TMAH）等； 常用的酰化试剂：乙酸酐、丙 酸酐等； 硅烷化试剂：三甲基氯硅烷 （咖CS）、双-三甲基硅烷乙酰胺 （BSA）、双-三甲基硅烷三氟乙酰 胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑 （IMTS）等。
具有光学异构体药物的分离 也可采用不对称试剂，使其生成 非对映异构体衍生物，然后用GC 法或HPLC法进行分析测定。常用 的不对称试剂有：（S）-N-三氟 乙酰脯氨酰氯、（S）-N-五氟乙 酰脯氨酰氯等。
1.取样： 供测定的血样应能代表整个血药 浓度，因而应待药物在血液中分布 均匀后取样。 动物实验时，可直接从动脉或 心脏取血。 对于病人，通常采取静脉血， 有时根据血药浓度和分析方法灵敏
度。也可用毛细管采血。
2.制备： 血浆的制备 将采取的血液置 含有抗凝剂（如：肝素、草酸盐等） 的试管中，混合后，离心，分离血 细胞，上清液即为血浆。
（三）尿液 尿药测定主要用于药物剂量回收研 究、尿清除率、生物利用度的研究。 体内药物清除主要是通过尿液排出， 药物可以原型（母体药物）或代谢物及 其缀合物（conjugates）等形式排出。 尿液主要成分是水、含氮化合物 （其中大部分是尿素）及盐类。
尿液中药物浓度较高，收集量
可以很大，也方便，但尿液浓度通
对于遇酸及受热不稳定的药物，
可以用酶水解法。常用葡萄糖醛酸
苷酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸苷酶
一硫酸酯ห้องสมุดไป่ตู้的混合酶。
（三）分离、纯化与浓集 1.液～液提取法（liquidliquid extraction; LLE)多数药物 是亲脂性的，在适当的有机溶剂中 的溶解度大于在水相中的溶解度， 而血样或尿样中含有的大多数内源 性杂质是强极性的水溶性物质。因 而用有机溶剂提取一次即可除去大 部分杂质。
临床生物化学检验-第5章 常用分析技术
(affinity chromatography)
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离子交换层析 (ion exchange chromatography, IEC)：是依据各种离子或离子 化合物与固定相离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的方法。
色谱技术 ，发现了液-液即分配色谱法
固定相-
流动相-
20世纪60年代高效液相色谱，high performance liquid chromatography即HPLC
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1. 按流动相种类分类
气相层析
液相层析
超临界流体 层析 电层析
气体
液体
超临界流体 缓冲溶液、 电场
挥发性有机物
可以溶于水或 有机溶剂中的 各种物资
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高效液相层析法 (high performance liquid chromatography，HPLC)： 是在经 典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。 由于高效固定相填料颗粒小而 均匀（1.7~10μm） ，会引起高阻力（小颗粒具有高柱效），因此采用高压输液泵输送 流动相 ，可大大加快分析速度 ，故又称高压液相层析法。
临床应用：作为参考方法测定钙、镁定值或建立新常规方法作比较试验。 优点： 灵敏度高、选择性好、分析速度快。 缺点：需校准物、分析条件要求高、操作较复杂、测定每一种元素需特 定的空心阴极灯、有些反应的显色剂本身的颜色会影响测定的专一性。
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1. 校准曲线法：以校准物浓度（系列浓度）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线 ，在相同条件 下测定待测样品 ，然后在标准曲线上查找待测物质浓度。影响因素较多 ，每次需绘制新标准曲线。
生物样品分析方法确证的SOP
生物样品分析方法确证的SOP1.专属性：应着重考察药物的代谢物、内源性物质和同时服用药物的干扰。
取6个个体空白样品，采用拟定的方法测定，所得结果与接近于定量限的被测物浓度的纯溶剂溶液所得的结果进行比较。
在药物、代谢物、内标物的保留时间处不应有大的干扰，任何有大干扰的样品应舍去，如果大于10%的空白样品有干扰，应另取一组空白样品重试，如果仍有大于10%的空白样品有干扰，则应改变拟定方法。
2.质控样品（QC样品）：系将已知量得待测药物加入到生物介质中配制的样品，用于质量控制。
3.线性范围：标准曲线由5 ～ 8个系列浓度标准溶液组成，包括LOQ，线性程度用加权最小二乘法处理，相关系数r不应低于0.99，同时必须符合一定的精密度和准确度。
线性范围浓度上限为实际样品最高浓度的120%，下限为实际样品最低浓度的80%。
要求LOQ偏离标准浓度（RSD）应小于等于20%，其他各点应小于等于15%。
截距与C max响应值之比应≤5.0%。
4.准确度：测得的样品浓度与真实浓度的接近程度，常用回收率表示。
a．绝对回收率（萃取回收率、提取回收率）萃取回收率(%)＝A测/A真×100%A测:取一定量的被测物标准品,加到空白血浆样品中,按方法处理,使最后溶液中药物标准品浓度为1μg·mL-1 ,测定峰面积,记为A测。
A真:取1μg·mL-1的药物标准品的纯溶剂溶液直接进样,测定峰面积,记为A。
真考察高、中、低三个浓度，低浓度选在定量限（LOQ）附近，高浓度在标准曲线上限的附近（上限的80%），中间选一个浓度。
每个浓度各3份样品，加入量一般在10-6～10-9g, 绝对回收率50%～80%。
（注：内标法中，药物与内标各自用外标法测得的绝对回收率应相近，两者相差应小于10%。
）b．方法回收率建立标准曲线后，取高、中、低药物标准品溶液加到空白血浆中，每个浓度至少平行测定5份，按标准曲线制备法同法制备，将所得值代入回归方程，求得测定值C测。
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临床生物样品分析技术组员：陈昆曹睿罗恒丽朱玲一. 常用临床生物样品常用生物样品的种类、特点与采集血浆(plasma)•血样——血清(serum)全血(whole blood)•尿液(urine)——用于药物剂量回收、药物肾清除率及生物利用度的研究※尿液药物浓度变化大，应测定一定时间内尿中药物总量。
※尿液与血液中药物的相关性差。
※尿中药物大多呈缀合状态。
•常用生物样品–常用生物样品的种类、特点与采集•唾液(saliva)——用于药物浓度监测和药代动力学研究•其他——动物脏器组织匀浆等–样本的代表性——力求取样条件标准化–样品的贮存•血样—离心，冷冻保存•尿液－立即测定，否则应冷藏或加防腐剂二.生物样品的常用分析技术体内药物分析是借助于现代化的仪器与技术来分析药物在体内数量与质量的变化，以获得药物在体内的各种药代动力学参数、代谢方式、代谢途径等信息。
目前，用于生物样品分析的技术有很多，归纳起来主要有以下几类方法：生物样品的常用分析方法1. 色谱分析法2. 光谱分析法3. 免疫分析法4. 微生物分析法5. 电化学分析法（一）色谱法(chromatography)一种物理或化学的分离分析方法，其分离原理主要是利用物质在流动相和固定相中的分配系数，或吸附能力的差异而达到分离。
包括薄层色谱(TLC)，纸色谱(PC)，凝胶色谱，气相色谱(GC)和液相色谱(LC)。
1.薄层色谱法（thin layer chromatography ）是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。
根据不同的分离机制，薄层色谱法可分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换薄层色谱和凝胶薄层色谱法等。
1.薄层色谱法（thin layer chromatography ）分离速度快优点检出灵敏度高选择性好显色方便等缺点：对生物高分子分离效果不甚理想。
2.薄层扫描法(TLCS)系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品的质量检查的方法。
与高效液相色谱法相比，具有多通道效应，可同时平行分离分析多个样品；流动相用量少且选择范围宽、更换方便；固定相为一次性使用，对样品的预处理要求不高等优点。
已成为薄层色谱常用的定量方法，在体内药物分析中广泛应用。
3.气相色谱法(gas chromatography，GC)定义：以气体为流动相的的色谱法称为气相色谱法。
分类：按固定相的聚集状态：GSC、GLC按分离原理：GSC属于吸附色谱、GLC 属于分配色谱按色谱操作形式：填充柱气相色谱、毛细管柱气相色谱。
3. 气相色谱法(gas chromatography ，GC)优点：1.效能高，n eff 可达103-106。
2.灵敏度高，检测限可达纳克级或更低。
3.选择性高，固定相对性质极为相似的组分，如烃类异构体等有较强的分离能力。
4.分析速度快，一般的气相色谱分析一次仅需几分钟。
5.应用范围广气相色谱法广泛应用于气体和易挥发性物质或可转化为易挥发性物质的生物样品的定性和定量分析。
3.气相色谱法(gas chromatography，GC)缺点：要求被测药物及其代谢物必须具有一定的挥发性和热稳定性。
解决方法：固定相发展和衍生化试剂的广泛使用，使生物样品不再受限制。
该方法简便、快速、准确，检出限低，适合中毒病人血液中溴氰菊酯含量的测定。
4.高效液相色谱法定义：以经典液相色谱为基础，以微粒型填料作固定相，采用高压送液泵和各种高灵敏度检测器。
分离效能高检测灵敏度高分析速度快选择性好优点4.高效液相色谱法有“柱外效应”。
在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。
高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。
缺点4.高效液相色谱法分类方法5.胶束电动毛细管色谱(MECC)在MECC体系中存在着以胶束形式存在的准固定相和作为载体的液体流动相，胶束带电荷在电场的作用下产生泳动，溶质中各组分依据其在水相和胶束相之间的分配差异及在电泳和电渗流驱动下出现淌度差异而分离。
优点：手性拆分常用的分离模式之一，只需在背景电解质中添加手性选择剂，构建手性环境，即可进行手性拆分，本法适用于拆分人体内的氨基酸。
6.涡流色谱技术(TFC)涡流色谱技术是利用大粒径填料使流动相在高流速下产生涡流状态，从而对生物样品进行净化与富集。
优点:可以在线处理生物样品，速度快、选择性好、灵敏度高，易于实现自动化，近年来在生物领域尤其是体内药物分析中得到了广泛的应用。
（二）光谱法(Spectroscopy)光谱法是基于检测能量（电磁辐射）作用于待测物质后产生的辐射信号或所引起的变化的分析方法。
特点应用于体内药物分析的光谱法：比色法（COL）紫外分光光度法（UV）荧光分析法（Fluorescence method）原子吸收分光光度法（AAS）1.比色法（COL）属于吸收光度法定量依据---Lambert-Beer定律A=ECL物质在一定波长处的吸收度与其浓度成正比。
比色法仅用于少数药物浓度高，干扰成分少的生物样品的测定。
比色法：主要用于药物监测和人群代谢分型的测定，逐渐被现代色谱分析方法所取代。
紫外分光光度法（UV）（略）2.荧光分析法（Fluorescence method）利用物质经光照射后能发射荧光的特性进行分析的光学分析法。
优点：1.灵敏度高。
检出限可达10-10g/ml~10-12g/ml。
2.选择性好。
按标记物的种类按是否加入分离剂放射法免疫分析酶免疫分析法化学发光酶免疫分析法荧光免疫分析法均相免疫分析---EMIT、FPIA 非均相免疫分析RIAEIACLIAFIA方法分类1.常规荧光分析法• 1.直接测定法•适于自身能产生荧光的物质，因荧光性质与溶液的pH有关，故荧光强度的测定须在适宜的pH介质中进行。
2.间接测定法将无荧光或弱荧光物质衍生化，测定衍生物荧光强度的方法。
2.胶束增溶增敏荧光分析法•利用胶束溶液对荧光物质的增溶、增敏和增稳作用，大大提高荧光分析法的灵敏度和稳定性。
用β-CD单分子胶束荧光技术检测秦艽中龙胆苦苷血药浓度。
龙胆苦苷嵌入β-CD的疏水空洞中，使其在胶束中溶解度增加和相互碰撞几率减少，荧光量子效率提高，从而提高检测灵敏度。
3.荧光探针分析法使用荧光探针从无荧光的药物制备有荧光的衍生物。
优点：•增强待分析物质的荧光响应，提高检测灵敏度和选择性。
•稳定分析物，尤其针对活泼的和有挥发性的化合物。
•有助于化合物基团的确证。
4.荧光淬灭分析法待分析的物质能使某种荧光化合物的荧光淬灭，通过测量荧光化合物荧光的下降，间接测量该分析物质。
按标记物的种类按是否加入分离剂放射法免疫分析酶免疫分析法化学发光酶免疫分析法荧光免疫分析法均相免疫分析---EMIT、FPIA 非均相免疫分析RIAEIACLIAFIA方法分类1.放射免疫分析法(radioimmunoassay)原理:放射性标记抗原和未标记抗原（待测物）与不足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。
优点：灵敏度高；特异性强、取样量少，适用于大批量样品的测定缺点：需要用放射性同位素标记抗原，其放射性对操作人员的健康、对环境的污染都会造成危害。
有时会出现交叉反应、假阳性反应。
需要有专用的同位素实验室及免疫测定仪器。
2.酶免疫分析法（enzyme Immunoassay）•酶免疫法分为：均相EIA；非均相EIA。
原理：将特异的抗原-抗体免疫学反应和酶催化反应相结合，以酶促反应的放大作用来显示初级免疫反应。
3.化学发光免疫分析（CLIA）是将高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，借以检测超微量物质的一种分析技术。
化学发光免疫分析包含两个部分，即化学发光系统和免疫反应分析系统。
化学发光分析系统：经催化剂的催化和氧化剂的氧化→激发态的中间体→光子→发光信号→光量子产额。
免疫反应系统：类似于抗原与抗体按发光剂不同分为:1.直接化学发光物质标记法（CLIA）发光剂直接标记抗体，多用吖啶酯类和苯酚类化合物。
2.化学发光酶免疫分析法（CLEIA）以催化反应的酶为标记物，抗原抗体结合后，其中的酶可对发光体系产生催化作用，产生发光效应。
多用的发光体系是HRP-鲁米诺。
3.电化学发光免疫分析法（ECLIA）电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量定性。
（四）微生物测定法（microbiologicalanalysis，MA）为生物检定法，它是利用药物（常为抗生素）对于微生物的抑制或杀灭作用，通过选择对药物敏感的试验菌，在适当的条件下，根据培养基上所产生的抑菌圈的大小来测定药物效价的方法。
通过研究抑菌圈直径与抗菌素浓度的关系来测定生物样品中药物浓度。
微生物测定法•微生物测定方法稀释法比浊法扩散法稀释法一般是在一系列的试管中用液体培养基逐管稀释，于每个试管中加入相同量的对该抗生素有高度敏感的试验菌液，培养后，观察能抑制细菌生长的最低抗生素浓度作为测定终点，再与同法测定的抗生素标准品的终点作比较，从而计算供试品的浓度。
稀释法将抗生素标准品的稀释液和供试品的稀释液分别加入试管中，加入已接种试验菌的液体培养基，根据抗生素的浓度不同，实验菌受抑制的程度也不同，因而产生不同程度的浑浊，从而计算出供试品的效价。
又叫琼脂扩散法，它是以琼脂作为固体培养基，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，将标准品溶液与供试品溶液加到接种了敏感菌的同一培养基上，恒温培养一定的时间，比较标准品与供试品对试验菌所产生的抑菌圈的大小，计算出供试品的浓度。
微生物测定方法•使用范围：一般用于抗生素，也可用于某些抗癌药物、维生素和氨基酸等的测定。
优点：具有灵敏度高、需样量较小、无需特殊设备的优点，不但适用于较纯的原料药物、制剂，也适用于经过简单提取分离的生物样品的分析。
缺点：操作步骤多、测定时间长、误差较大。
（五）电化学分析法是一类基于电池内发生电化学反应而建立的分析方法。
一般是根据待测物溶液的电化学性质，选择适当的电极组成化学电池，通过测定电信号强度或其变化对被测组分进行定性定量分析。
由于受到方法灵敏度和选择性的限制，在体内药物分析中应用不多。
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