生物样品的处理方法
生物样品预处理
生物样品预处理的应用与发 展趋势
第六章
生物样品预处理的应用领域
医学领域：用于疾病诊断、治疗和 药物研发
环境监测领域：用于水质、空气和 土壤等环境因素的监测
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
农业领域：用于农产品质量检测、 育种和病虫害防治
食品安全领域：用于食品添加剂、 农药残留和重金属等检测
生物样品预处理的发展趋势与展望
对于不同种类的生物样品，要分别 处理，避免交叉污染。
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
在操作过程中，要遵循无菌操作原 则，避免微生物、细菌等污染样品。
在处理过程中，要定期对操作台、 器具等进行清洁和消毒，保持清洁 卫生。
保证操作的安全性
生物样品具有潜在危险，操作时应佩戴个人防护装备 遵循实验室安全规定，确保工作环境安全 避免交叉污染，确保生物样品处理过程中的安全 正确使用和处理化学品，确保操作的安全性
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
实验要求：严格遵守操作规程，保 证实验结果的准确性和可靠性
实验步骤：按照操作规程进行实验， 记录实验数据并进行分析
检测方法与仪器
检测方法：生物样品预处理的方法应根 据检测目的和要求选择，常用的检测方 法包括光谱分析、色谱分析、质谱分析 等。
仪器选择：根据检测方法和生物样品的特 性，选择合适的仪器进行预处理，如离心 机、过滤器、萃取装置等。
仪器精度：仪器的精度对预处理结果的影 响较大，应选择精度高、稳定性好的仪器。
仪器维护：仪器的维护和保养也是影响 预处理效果的重要因素，应定期进行维 护和保养，确保仪器的正常运行和使用 效果。
操作人员技能与素质
生物样品预处理技术
取500g有代表性的猪肉可食部分，用组织捣碎机充 分捣碎均匀；
样品均匀化
取2g 捣碎样品，加入8ml乙酸钠缓冲液(pH=5.2)，再
• 固相萃取
• • • • • • • 操作： 活化 上样 淋洗 洗脱 收集 直接进样或者 浓缩后进样 与色谱理论相同
二、生物样品预处理方法
二、生物样品预处理方法
• 采用离心或者抽真空 的办法，以一定离心 力或者流速，进行上 样、淋洗和洗脱
二、生物样品预处理方法
• 固相萃取的优点：
• 无乳化现象 • 使用溶剂安全价格低廉
有机强酸
季铵碱、盐
有机酸、酚类
示例 不同生物样品中虎杖苷预处理方法
• A：虎杖苷标准对照品 由海王集团技术中心天然药物室提供 批号：03050803 • 3，4’，5-三羟基芪-3-β-D-葡萄糖苷 Mr390 • • B：二苯乙烯苷化学对照品 由中国药品生物制品检定所提供 • 2，3，5，4‘-四羟基二苯乙烯-β-D-葡萄糖苷 Mr406
• 萃取效率高
• 处理速度快，具有一定通量 • 易于同时萃取出目标药物及其代谢产物，包括极性 强的Ⅱ相代谢产物
• MCX固相萃取柱 • 反相作用和阳离子交换 作用
• 酸性环境中含氮碱性基 团与磺酸基结合 • 酸性药物呈分子状态发 生反相结合作用
对有机碱: 对有机酸、酚类 对有机强酸 对季铵碱、盐 pKa 2-8 pKa 2-10 pKa <1.0 pKa >10 选择 Oasis® MCX 选择 Oasis® WAX 选择 Oasis® WCX 选择 Oasis® MAX
• 储存条件
–20℃：大部分药物 –80℃：阿莫西林等抗生素 加稳定剂：卡托普利等
生物样品预处理的方法
生物样品预处理的方法一、生物样品预处理的重要性。
1.1 生物样品的复杂性。
生物样品那可是相当复杂的呀。
就拿血液来说吧，里面有各种各样的成分，像血细胞、血浆蛋白、各种离子、代谢产物等等。
这些成分混在一起就像一锅大杂烩，如果不进行预处理，想要准确分析其中特定的物质，那简直就是大海捞针，难上加难。
1.2 提高分析准确性。
预处理就像是给我们的分析工作打基础。
如果不把那些干扰的成分去除或者分离，分析仪器可能就会被误导。
比如说在检测血液中的某种药物成分时，如果血浆蛋白没有处理好，蛋白可能会包裹药物，导致检测到的药物含量比实际的少很多，这就会得出错误的结论。
所以预处理是让我们的分析结果更靠谱的关键一步。
二、常见的生物样品预处理方法。
2.1 蛋白质沉淀法。
这是一种比较简单粗暴但很有效的方法。
就像把混在沙子里的石子挑出来一样，我们通过加入一些试剂，像有机溶剂（如甲醇、乙腈）或者酸，让蛋白质沉淀下来。
这就好比给蛋白质使了个“定身术”，让它们从溶液里分离出来。
这样一来，那些被蛋白质包裹或者干扰的目标物质就能够更好地被检测到。
不过这种方法也有缺点，有时候会把一些小分子的目标物质也一起沉淀了，就像打扫卫生的时候不小心把有用的小物件也扫走了一样。
2.2 液液萃取法。
这就有点像油和水分离的感觉。
我们利用目标物质在两种互不相溶的溶剂中的溶解度差异，把目标物质从生物样品所在的溶剂中转移到另一种溶剂里。
比如说，我们要从血液的水溶液中提取一种脂溶性的药物，就可以加入一种有机溶剂，像氯仿，药物就会跑到氯仿层里，就像孩子找妈妈一样，然后我们把氯仿层分离出来，就得到了相对纯净的含有目标药物的溶液。
但是这个方法操作起来有点麻烦，就像走迷宫一样，要小心翼翼地确保每一步都准确。
2.3 固相萃取法。
这个方法可以说是比较高端大气上档次的。
我们把一种特殊的吸附剂装在一个小柱子里，然后让生物样品溶液通过这个柱子。
目标物质就像被磁石吸引一样，吸附在柱子里的吸附剂上，而那些杂质就流走了。
药物分析中的生物样品前处理方法研究
药物分析中的生物样品前处理方法研究近年来，随着生物医药领域的快速发展，药物分析在疾病的诊断和治疗中扮演着至关重要的角色。
为了获得准确可靠的分析结果，生物样品的前处理方法显得尤为重要。
本文将探讨药物分析中常用的生物样品前处理方法的研究进展。
一、血液样品的前处理方法研究血液样品作为一种常见的生物样品，在药物分析中扮演着重要的角色。
然而，血液样品中存在着各种成分的干扰，如蛋白质、血红蛋白等。
因此，研究人员提出了多种前处理方法来解决这些问题。
1. 血浆/血清的蛋白质沉淀方法血浆/血清中的蛋白质是最常见的干扰物之一。
为了降低蛋白质对分析结果的影响，研究人员开发了各种蛋白质沉淀方法。
例如，酸沉淀法可以通过改变pH值使蛋白质凝聚沉淀，从而去除蛋白质干扰。
此外，还有醇沉淀法、有机溶剂沉淀法等。
2. 血浆/血清的固相萃取方法固相萃取方法是血液样品前处理中常用的技术之一。
其原理是利用吸附剂对目标化合物进行特异性吸附，从而去除干扰物。
通过选择合适的吸附剂，可以实现对特定成分的富集。
例如，固相萃取柱常用于血浆/血清样品中药物的富集与净化。
二、尿液样品的前处理方法研究尿液样品常用于药物代谢和排泄的研究，但由于其复杂的成分和高度变异性，前处理方法显得尤为重要。
1. 尿液样品的前处理方法选择尿液样品前处理的关键是选择合适的方法。
常见的前处理方法包括尿液蛋白质去除、有机溶剂浓缩、尿液稀释等。
根据具体的分析需求和目标物质的特性，选择恰当的前处理方法可以显著提高分析结果的准确性和灵敏度。
2. 尿液样品的固相萃取方法研究固相萃取也是尿液样品前处理中常用的技术之一。
通过选择适当的吸附剂和前处理条件，可以有效地去除尿液中的杂质，提高目标物质的测量灵敏度。
例如，固相萃取柱结合气相色谱-质谱联用技术可以用于尿液样品中药物代谢产物的研究。
三、其他生物样品的前处理方法研究除了血液和尿液样品，还有其他生物样品在药物分析中的应用。
例如，头发样品被广泛用于毒品滥用的检测。
化学分析方法的生物样品前处理技术
化学分析方法的生物样品前处理技术化学分析是现代科学研究和工业生产中不可或缺的一环。
为了获得准确和可靠的化学分析结果，对于生物样品的前处理技术至关重要。
本文将介绍几种常用的生物样品前处理技术，包括固相萃取、液液萃取、溶剂萃取和分离提纯技术。
一、固相萃取技术固相萃取（Solid-phase Extraction，简称SPE）是一种用于生物样品前处理的重要技术。
其原理是将待检样品与吸附剂接触或通过吸附剂时，目标分析物被吸附到吸附剂上，达到样品的富集和净化。
固相萃取技术具有以下优点：操作简单、灵敏度高、富集效果好、耗时短等。
在化学分析领域中被广泛应用。
二、液液萃取技术液液萃取（Liquid-Liquid Extraction，简称LLE）是一种通过溶剂与待检样品中目标分析物的选择性溶解度差异而发生分离的技术。
其原理是将待检样品与萃取溶剂进行充分混合搅拌后，静置，根据目标分析物在两种溶剂中的分配系数，使其转移到相应的溶剂层中。
液液萃取技术适用范围广泛，操作简单。
但其溶剂消耗大，使用过程中易产生有机溶剂挥发、环境危害等问题，因此在实际应用中需要加以控制和优化。
三、溶剂萃取技术溶剂萃取技术（Solvent Extraction）是指通过非挥发性溶剂将目标分析物从待测样品中提取出来。
它是一种在液液界面上基于物质间相互作用力原理进行的分离技术。
该技术广泛应用于生物样品的前处理中。
溶剂萃取技术不仅可以提取有机物，还能用于提取无机物，同时能实现溶液的浓缩和纯化。
在生物样品前处理中，该技术常与其他技术，如SPE技术结合使用，以实现样品更好的富集和净化效果。
四、分离提纯技术分离提纯技术在生物样品前处理过程中起到了至关重要的作用。
常见的分离提纯技术包括薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱等。
薄层色谱技术（Thin Layer Chromatography，简称TLC）是一种常用的分离化合物的方法。
它通过将待测样品在薄层色谱板上作用，根据各种成分的溶解度差异和物理化学性质等特点进行分离。
生物样品的预处理
蛋白酶抑制剂的添加
保护剂的添加(β-巯基乙醇、EDTA、辅酶等)
提取物缓冲液的选择(中性)
提取液的澄清( 高速离心、沉淀、吸附等)
匀浆化前的预处理(冷冻)
1.2 动物组织预处理注意事项
各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预处理方法的选择也有所不同。
01
大多数发酵产物存在于发酵液中，也有少数产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有。
螯合剂法
叁
贰
壹
酚类化合物的干扰及对策
牛血清白蛋白（BSA）法 原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会
丙酮法 用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料,可有效从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA
高速匀浆机
高速匀浆法为大规模细胞破碎的常用方法，设备由高压泵和匀浆阀组成。
研磨法与珠磨法 研磨法(实验室规模) 由陶瓷的研钵和研杆组成，加入少量研磨剂（如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土） 珠磨法(工业规模) 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英沙、氧化铝等研磨剂（直径<1 mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎,释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。 适用：微生物（细菌）与植物细胞
通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。
01
03
02
植物组织往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，较难将它们分开。含多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液，对RNA提取造成较大的干扰。
生物样品预处理.
三、常用的处理方法-除蛋白法
2.酶解法
操作：先将被测组织加Tris-缓冲液pH 10.5及酶， 60℃培育1h，用玻璃棉过滤，得澄清滤液， 即可供药物提取用。 优点：可避免某些药物在酸及高温下降解；对与 蛋白质结合牢的药物（如保泰松、苯妥英钠）， 可显著改善回收率；可用有机溶剂直接提取 酶解液而无乳化现象生成，当采用HPLC法检 测时，无需再进行过多的净化操作。
二、指导原则-预处理应考虑问题
1.药物的理化性质和存在形式
B.药物在体内的存在形式及蛋白结合率：
a.结合蛋白率高: 首先去蛋白 b.多为代谢缀合物：缀合物水解 C.药物的光谱特性及官能团特性：涉及分析仪器 的选择以及是否需要衍生化和特殊检测器。 紫外吸收强弱：是否用UV检测器 含有-NO2 、-Cl等电负性基团：ECD检测器
三、常用的处理方法
常用方法
1.有机破坏法 2.除蛋白法 3.缀合物的水解 4.分离，纯化 与浓集 5.衍生化法
重点介绍
除蛋白法 液液萃取法
三、常用的处理Hale Waihona Puke 法-有机破坏法1.有机破坏法
特 点 样 品 1、硫酸作为分解剂（消化剂），加氧化剂 血、尿、 硝酸 — 高氯酸法 （硝酸、高氯酸、过氧化氢等）作辅助分解剂。 组织 2、破坏能力强，反应比较激烈，操作时， 电热消化器法 应在通风橱内进行。 3、先低温反应，再高温蒸发，以免发生爆 电热板消化法 炸； 人发 4、所得的无机金属离子，一般为高价态。 烘箱消化法 1、适用于卤素、硒、硫、磷等微量元素分 高温炽灼法 析的前处理 2、高温炽灼法：坩埚，先完全炭化，再灰 化，盐酸溶解定容。盐酸加无水碳酸钠或氧化 血、人 氧瓶燃烧法 镁等以助灰化。（高温电子炉、低温等离子） 发 3、氧瓶燃烧法：密闭的燃烧瓶中进行燃烧， 选择适当吸收液。 分 类
生物样本的处理方法
生物样本的处理方法生物样本的处理是生物学、医学、药学等领域中非常重要的一个环节，其目的是为了获得可靠的实验数据，为后续的研究和应用提供支持。
本文将介绍几种常见的生物样本处理方法。
1. 血液样本的处理血液样本处理是临床医学中常见的操作。
为了获得准确的结果，需要注意以下几点：（1）采血前应让被测者保持安静状态，避免运动和饮食过多。
（2）采血前应充分消毒，避免感染。
（3）采血时应选择正确的采血针头和采血管，避免对血液样本的影响。
（4）采血后应立即将血液样本送往实验室，避免时间过长影响结果。
2. 细胞样本的处理细胞样本处理是生物学和医学中常见的操作，常用于细胞培养和细胞分离。
为了获得可靠的结果，需要注意以下几点：（1）细胞培养前应准备好培养基和培养器具，避免污染和误操作。
（2）细胞分离时应选择正确的酶和处理时间，避免对细胞的损伤。
（3）细胞培养过程中应控制培养条件，包括温度、湿度、CO2浓度等。
（4）细胞培养后应及时进行细胞计数和鉴定，以保证实验数据的准确性。
3. 组织样本的处理组织样本处理是医学和生物学中常见的操作，常用于病理学和组织学研究。
为了获得可靠的结果，需要注意以下几点：（1）组织采集前应选择正确的工具和方法，避免对组织的破坏。
（2）组织采集后应立即进行固定和包埋，避免组织变性和脱落。
（3）切片时应选择适当的厚度和方法，避免切伤或切变组织。
（4）染色前应选择正确的染色剂和条件，避免染色不均或误判。
4. DNA/RNA样本的处理DNA/RNA样本处理是分子生物学和基因工程中常见的操作。
为了获得可靠的结果，需要注意以下几点：（1）DNA/RNA采集前应选择正确的采集方法和工具，避免对样本的污染和误操作。
（2）采集后应立即进行裂解和纯化，避免DNA/RNA的降解和污染。
（3）纯化后应进行质量和浓度的检测，以保证实验数据的准确性。
（4）DNA/RNA的储存应选择适当的方法和条件，避免降解和污染。
生物样本的处理方法直接影响实验结果的准确性和可靠性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
一、方法特异性
方法的特异性(specificity) ——又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用
——系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力
专属性——表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的 选择性 ——系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区 分(分离)的能力 特异性——涵盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性 考察一个分析方法是否具有特异性。
生 物 样 品 的 处 理 方 法
湿法破坏
常用试剂：硝酸或硝酸-高氯酸. 特点：破坏能力强、反应激烈，无机 金属离子为高价态. 应用：适用于血、尿、组织等生物样 品的破坏.
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
干法破坏
高温炉高温破坏
应用——适合人发样品的破坏
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
氧瓶燃烧法
应用——血浆、人发中卤素、硫、硒等 血浆：血浆1ml分次点于无灰滤纸上60℃ 烘干,按规定折叠后固定. 人发：洗净、干燥（60℃ ~ 80℃）剪碎, 称取0.1 ~ 0.3g置无灰滤纸,按规定 折叠固定.
第五章 药物定量分析与分析方法验证
②液-固提取法（固相萃取法）
原理： 将不同填料作为固定相装入微型小柱， 当含有药物的生物样品溶液通过时，由 于受到吸附、分配、离子交换或其它亲 和力作用，药物或杂质被保留在固定相 上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶 剂洗脱药物。
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
含羟基、羧基、氨基和巯基药物
+ 葡萄糖醛酸→葡萄糖醛酸苷缀合物
含酚羟基、芳胺和醇类药物
+ 硫酸→ 硫酸酯缀合物
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
常用方法:
酸水解:盐酸
酶水解: 葡萄糖醛酸苷酶
硫酸酯酶 葡萄糖醛酸苷酶-硫酸酯酶
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
空白血清在pH2、pH7和pH13缓冲液中乙 醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)测定，碱 性(pH13)下提取液的杂质峰最少
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
空白血清乙醚提取物的HPLC色谱图 生 物 样 品 的 处 理 方 法
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
(4)化学衍生化
化学衍生化目的 ①使药物变成具有能被分离的特性 ②提高对样品的检则灵敏度 ③增加药物的稳定性 ④提高对光学异构体的分离能力
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
（5）有机破坏
方法：湿法破坏
干法破坏
氧瓶燃烧法
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
（1）去除蛋白质(血样)
生 物 样 品 的 处 理 方 法
①加与水混溶的有机溶剂 —蛋白质分子内和分 子间氢键发生改变. (乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃) ②加中性盐—蛋白质脱水. (饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、
磷酸盐及枸橼酸盐等)
③加强酸 — 与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀
( 10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等)
④加含锌盐及铜盐的沉淀剂—与蛋白质阴离
子形成不溶性盐沉淀. (CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH) ⑤酶解法—枯草菌溶素.适用于酸不稳定及蛋白 结合牢固药物.
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
（2）缀合物的水解(尿样)
生物样品定量分析方法验证内容与基本要求 1．特异性——避免干扰 2．标准曲线与线性范围——覆盖所有浓度范围 3．准确度——与实际状况相符
4．精密度——结果可重现
5．定量限——达到峰浓度的1/10～1/20
6．稳定性——确保所有样品准确测定
7．提取回收率——确保准确度
第五章 药物定量分析与分析方法验证
18
第五章 药物定量分析与分析方法验证
二、标准曲线与线性范围
标准曲线（standard curve）—— calibration curve or working curve ——生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性（比例的程度）
——通常用回归分析方法所得的回归方程来评价
——除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式 ——回归分析法为最小二乘法（least squares） 或加权最小二乘法（weighted least squares） 线性范围（linear rang）——标准曲线的最高与最低浓度的区间 ——模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度
生 物 样 品 的 处 理 方 法
（3）分离纯化与富集
①液-液萃取法
水相pH值是萃取成功的关键 水相最佳pH值
碱性药物：高于pKa值12个pH单位
酸性药物：低于pKa值12个pH单位
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
但生物样品宜在碱性或近中性提取 ——生物基质中内源性物质多为酸性， 在碱性下不易萃取
第五章 药物定量分析与分析方法验证
第五章 药物定量分析与分析方法验证
第一节 定量分析样品的前处理方法
第二节 定量分析方法的特点 第三节 药品分析方法的验证
第四节 生物样品分析方法的基本要求
第五章 药物定量分析与分析方法验证
生物样品分析的特点
1．干扰物质多——生物样品中含有大量的内源性物，如质蛋白 质、脂肪等，以及代谢物、结合物等干扰分能重复取样——生物样品多数在特定条件下采
集，无法再次取样
3．被测成分浓度低——对分析方法的灵敏度及专属性要求较高
第五章 药物定量分析与分析方法验证
体内分析方法要求
1. 检测方法的高灵敏度—最低检测量10-9~10-7g或10-15~10-12g 2. 分离方法的高选择性、高专属性 为满足各项要求，最常用的分析方法有 1 ） 色 谱 法 ——GC 、 HPLC 、 HPCE （ highperformance capillary electrophoresis） 2）免疫分析法——RIA、EIA 3）联用技术——GC-MS、LC-MS