生物样品前处理方法
干湿结合生物学研究方法
干湿结合生物学研究方法在生物学研究领域，干湿结合的方法已经成为一种高效、全面的研究策略，涵盖了从生物样品的前处理到测序与表达分析等多个步骤。
干湿结合生物学研究方法结合了湿法和干法两种技术，下面将详细介绍这些内容。
1、湿法生物样品前处理湿法生物样品前处理是一种常用的样品处理方法，主要利用液体介质进行样品破碎、细胞裂解和蛋白质、核酸等生物分子的提取。
湿法处理具有高效、温和的优点，适用于大部分生物样品的处理。
湿法生物样品前处理的主要步骤包括：样品收集、细胞破碎、细胞裂解、蛋白质变性、核酸提取等。
在操作过程中，需要注意保持无菌条件，避免样品污染，同时要尽量减少对生物分子的破坏，保持其天然活性。
2、干法生物样品前处理干法生物样品前处理主要利用干粉试剂或干式生化试剂进行样品破碎、细胞裂解和生物分子的提取。
干法处理具有简便、快速、无需特殊设备的优点，适用于一些不易获得的生物样品或需要快速处理的紧急样品。
干法生物样品前处理的主要步骤包括：样品收集、细胞破碎、细胞裂解、干燥、试剂添加等。
在操作过程中，需要注意避免样品污染，保证细胞的充分破碎和裂解，同时要保证生物分子的完整性。
3、蛋白质生物样品分离与纯化蛋白质生物样品分离与纯化是生物学研究中的重要步骤，其主要目的是将目标蛋白质与其他生物分子（如核酸、脂质等）进行有效分离，从而对其进行深入研究和应用。
蛋白质生物样品分离与纯化的主要方法包括：离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、电泳等。
这些方法各有特点，适用范围也不同，需要根据具体研究需求进行选择。
在操作过程中，需要注意保证样品的均一性和回收率，同时要尽量避免非特异性吸附和样品损失。
4、DNA生物样品提取与纯化DNA生物样品提取与纯化的目的是从生物样品中提取出高质量的DNA，去除其中的杂质和干扰物质，以便进行后续的基因组学研究。
DNA生物样品提取与纯化的主要方法包括：酚氯仿抽提法、硅胶膜吸附法、磁珠法等。
这些方法都能够高效地提取和纯化DNA，但操作过程和适用范围略有不同。
生物样品前处理方法
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生物样品前处理的考虑因素
▲药物的理化性质和存在形式 ▲待测药物的浓度范围 ▲选用的生物样品类型
▲样品预处理与分析技术的关系
▲药物测定的目的
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生物样品前处理-有机破坏法
▲湿法破坏
硝酸-高氯酸法、电热消化器法、电热板消化法、烘箱消化 法。
▲干法破坏
高温电阻炉灰化法、低温等离子灰化法。
中某些组分，再用适当溶剂冲出杂质。 然后用少量溶剂洗脱，从而达到分离、净化与浓缩的目 的。
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法适用范围
大多数液体生物样品的前处理（如血浆、尿等）。
固体、半固体样品经过处理后也可使用SPE进行分离。
▲固相萃取法操作步骤
活化：根据所选择固定相的类型使用相应的活化溶剂
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法简介
固相萃取技术（SPE）是从上世纪八十年代中期发展起
来的，广泛运用于医学、制药、环境、食品等领域。 固相萃取法（SPE）就是用固体物质作为萃取剂，采用 高效、高选择性的固定相，进行萃取的样品预处理技术。
▲固相萃取法原理
以吸附剂为固定相，当液体样品通过固定相时，保留其
▲ 沉淀蛋白法优点
操作简便易行
▲ 沉淀蛋白法缺点
此法仅除去了蛋白质，内源性杂质并没有除去。
运用此法处理后的样品浓度会被稀释，不利于检测。
。 此法所得样品不能用光谱法检测。
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生物样品前处理-液液萃取法
▲液液萃取法简介
多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水 相中的溶解度，而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性 的水溶性物质。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂 质。
生物样品前处理
[5]胡小刚,李攻科.分子印迹技术在样品前处理中的应用[J].分析化学.2006,(34)7: 1035-1041
[6]张丽华，肖国平，宋游.微波技术在生物样品预处理中的应用[J].基础和应用基础研究与放射化学与核化学:133
2.对于在常温下需要长时间反应的样品，可将准备好的样品放置过夜，第2天再放进消解炉消解。
3.对于预处理时间长的难处理样品，也可采用放过夜的方法，第2天再进行消解处理。样品经过处理后，若溶液体积小于5ml时，则必须补加水或酸，使其体积不小于5ml，然后再进行微波消解。
总之,生物样品的预处理因其多样、复杂而成为整个检测过程中的关键环节。所述各种处理方法各有其特点,根据化合物的物理化学性质选择合适的前处理方法是取得满意检测结果的必要条件。
[1]周婷婷,范国荣,吴玉田.超临界流体萃取法在生物样品前处理中的应用[J].药学学报.2004 ,39(4) :317 – 320
[2]张颖.生物样品预处理技术及应用进展[J].天津药学,2006, 18(1):56-58
[3]李向阳，杨梅，彭宝珠.固相微萃取在生物药物分析中的应用[J].2002,23(4):69-71
目前各类文献上报道的MIP制备方法基本上是非共价法。在此方法中,印迹分子与功能单体之间通过分子间的非共价作用预先自组装排列,以非共价键形成多重作用位点,这种分子间的相互作用通过交联聚合后保留下来。常用的非共价作用有:氢键、静电引力、金属螯合作用、电荷转移、疏水作用以及范德华力等,其中以氢键应用最为广泛[5]。
分子印迹聚合物(molecularly imp rinted polymer, MIP)制备简单,能够反复使用,机械强度较高,稳定性好。因此它非常适合用作SPE的填充剂或SPME的涂层材料来分离富集复杂样品中的分析物,以达到分离净化和富集的目的。
生物样品分析前处理技术
生物样品分析前处理技术生物样品的前处理涉及很多方面，但主要应考虑生物样品的种类，被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题。
样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型。
例如，血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出，当原型药物排泄在尿中时，可简单地用水稀释一定倍数后进行测定。
根据被测定药物的结构、理化及药理性质、存在形式、浓度范围等，采取相应的前处理方法。
例如，药物的酸碱性（pka）、溶解性质涉及到药物的提取手段；是否具有挥发性涉及到能否采用气相色谱法测定；药物的光谱特性及官能团性质涉及到分析仪器的选择、能否制成衍生物及应用特殊检测器的可能性。
药物在样品中的浓度相差很大，浓度大的样品，对前处理要求可稍低；浓度越低则样品前处理要求越高。
此外，药物在体内常产生许多代谢产物，其中一些代谢物仍具有药理活性，需要与原型药分别测定，因而也要了解药物的药理学性质和药物动力学特性。
样品于测定前是否需要纯化以及纯化到什么程度均与其后采用的测定方法的不同而不同。
即纯化程度与所用测定方法的专属性、分离能力、检测系统对不纯样品污染的耐受程度等密切相关。
一般说来，放射免疫测定法由于具有较高的灵敏度和选择性，因此当初步除去主要干扰物质之后即可直接测定微量样品；而对灵敏度和专属性较差的紫外分光光度法，分离要求就要相应高一些；至于常用的高效液相色谱法，为防止蛋白质等杂质沉积在色谱柱上，上柱前需对生物样品进行去蛋白，有时对被测组分进行提取、制备衍生物等前处理。
下图大致反映了检测方法与样品前处理要求的相三关系。
样品处理步骤与分析方法的选择—(一）去除蛋白质在测定血样时，首先应去除蛋白质。
去除蛋白质可使结合型的药物均出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能（如保护HPLC柱不被沾污），延长使用期限。
生物样品前处理、制备、分离
生物样品前处理、制备、分离及保存器材
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中国刑警学院法医系
1. 概 述 1.1 生物样品处理制备的主要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 ⑵许多生物样品在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 ⑶许多生物样品一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物样品提取制备最困难之处。 ⑷生物样品的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
样品置耐压的圆底烧瓶中，将瓶浸入干冰-乙醇混合物内，使瓶内物迅速冻结成硬块，然后连接高真空度的真空泵。
*
增加过滤推动力。常压、加压、减压。
加助滤剂。如硅藻土、活性炭、细砂等。
提高过滤时的温度。以减少溶液粘度，增大溶质的溶解度，但不适于热敏物质。 离心过滤法，利用离心力促使滤液通过过滤介质，适于分离小量组织样品。
加压和减压过滤在过滤介质的下面都必须有支持滤板，如强度较大的烧瓷滤板等。
3.2 超滤 超过滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。
滤渣：滤渣越厚，过滤速度越慢。
过滤液性状：过滤液中有沉淀、胶状物或其它可压缩的物质，均能造成滤膜孔堵塞，减慢过滤速度。
*
3.1.3 提高过滤速度的常用方法
选择适当的过滤介质 应考虑：①孔径大小应适于截流被分离的固体颗粒，孔径过大，则滤液不清，过小则滤速慢。②孔的数目多，孔道短且直，则滤速快，否则滤速慢。③耐酸碱，化学稳定性好。④有一定机械强度，易于回收。⑤使用寿命长，成本低。 过滤介质的材质： ①棉、麻、丝织品； 玻璃纤维、垂熔玻璃、石棉或烧瓷滤板、涤纶等； 滤纸（工业用和分析用，慢速、中速、快速），实验室里最常用。
药物分析中的生物样品前处理方法研究
药物分析中的生物样品前处理方法研究近年来，随着生物医药领域的快速发展，药物分析在疾病的诊断和治疗中扮演着至关重要的角色。
为了获得准确可靠的分析结果，生物样品的前处理方法显得尤为重要。
本文将探讨药物分析中常用的生物样品前处理方法的研究进展。
一、血液样品的前处理方法研究血液样品作为一种常见的生物样品，在药物分析中扮演着重要的角色。
然而，血液样品中存在着各种成分的干扰，如蛋白质、血红蛋白等。
因此，研究人员提出了多种前处理方法来解决这些问题。
1. 血浆/血清的蛋白质沉淀方法血浆/血清中的蛋白质是最常见的干扰物之一。
为了降低蛋白质对分析结果的影响，研究人员开发了各种蛋白质沉淀方法。
例如，酸沉淀法可以通过改变pH值使蛋白质凝聚沉淀，从而去除蛋白质干扰。
此外，还有醇沉淀法、有机溶剂沉淀法等。
2. 血浆/血清的固相萃取方法固相萃取方法是血液样品前处理中常用的技术之一。
其原理是利用吸附剂对目标化合物进行特异性吸附，从而去除干扰物。
通过选择合适的吸附剂，可以实现对特定成分的富集。
例如，固相萃取柱常用于血浆/血清样品中药物的富集与净化。
二、尿液样品的前处理方法研究尿液样品常用于药物代谢和排泄的研究，但由于其复杂的成分和高度变异性，前处理方法显得尤为重要。
1. 尿液样品的前处理方法选择尿液样品前处理的关键是选择合适的方法。
常见的前处理方法包括尿液蛋白质去除、有机溶剂浓缩、尿液稀释等。
根据具体的分析需求和目标物质的特性，选择恰当的前处理方法可以显著提高分析结果的准确性和灵敏度。
2. 尿液样品的固相萃取方法研究固相萃取也是尿液样品前处理中常用的技术之一。
通过选择适当的吸附剂和前处理条件，可以有效地去除尿液中的杂质，提高目标物质的测量灵敏度。
例如，固相萃取柱结合气相色谱-质谱联用技术可以用于尿液样品中药物代谢产物的研究。
三、其他生物样品的前处理方法研究除了血液和尿液样品，还有其他生物样品在药物分析中的应用。
例如，头发样品被广泛用于毒品滥用的检测。
化学分析方法的生物样品前处理技术
化学分析方法的生物样品前处理技术化学分析是现代科学研究和工业生产中不可或缺的一环。
为了获得准确和可靠的化学分析结果，对于生物样品的前处理技术至关重要。
本文将介绍几种常用的生物样品前处理技术，包括固相萃取、液液萃取、溶剂萃取和分离提纯技术。
一、固相萃取技术固相萃取（Solid-phase Extraction，简称SPE）是一种用于生物样品前处理的重要技术。
其原理是将待检样品与吸附剂接触或通过吸附剂时，目标分析物被吸附到吸附剂上，达到样品的富集和净化。
固相萃取技术具有以下优点：操作简单、灵敏度高、富集效果好、耗时短等。
在化学分析领域中被广泛应用。
二、液液萃取技术液液萃取（Liquid-Liquid Extraction，简称LLE）是一种通过溶剂与待检样品中目标分析物的选择性溶解度差异而发生分离的技术。
其原理是将待检样品与萃取溶剂进行充分混合搅拌后，静置，根据目标分析物在两种溶剂中的分配系数，使其转移到相应的溶剂层中。
液液萃取技术适用范围广泛，操作简单。
但其溶剂消耗大，使用过程中易产生有机溶剂挥发、环境危害等问题，因此在实际应用中需要加以控制和优化。
三、溶剂萃取技术溶剂萃取技术（Solvent Extraction）是指通过非挥发性溶剂将目标分析物从待测样品中提取出来。
它是一种在液液界面上基于物质间相互作用力原理进行的分离技术。
该技术广泛应用于生物样品的前处理中。
溶剂萃取技术不仅可以提取有机物，还能用于提取无机物，同时能实现溶液的浓缩和纯化。
在生物样品前处理中，该技术常与其他技术，如SPE技术结合使用，以实现样品更好的富集和净化效果。
四、分离提纯技术分离提纯技术在生物样品前处理过程中起到了至关重要的作用。
常见的分离提纯技术包括薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱等。
薄层色谱技术（Thin Layer Chromatography，简称TLC）是一种常用的分离化合物的方法。
它通过将待测样品在薄层色谱板上作用，根据各种成分的溶解度差异和物理化学性质等特点进行分离。
生物样品的预处理
蛋白酶抑制剂的添加
保护剂的添加(β-巯基乙醇、EDTA、辅酶等)
提取物缓冲液的选择(中性)
提取液的澄清( 高速离心、沉淀、吸附等)
匀浆化前的预处理(冷冻)
1.2 动物组织预处理注意事项
各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预处理方法的选择也有所不同。
01
大多数发酵产物存在于发酵液中，也有少数产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有。
螯合剂法
叁
贰
壹
酚类化合物的干扰及对策
牛血清白蛋白（BSA）法 原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会
丙酮法 用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料,可有效从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA
高速匀浆机
高速匀浆法为大规模细胞破碎的常用方法，设备由高压泵和匀浆阀组成。
研磨法与珠磨法 研磨法(实验室规模) 由陶瓷的研钵和研杆组成，加入少量研磨剂（如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土） 珠磨法(工业规模) 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英沙、氧化铝等研磨剂（直径<1 mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎,释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。 适用：微生物（细菌）与植物细胞
通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。
01
03
02
植物组织往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，较难将它们分开。含多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液，对RNA提取造成较大的干扰。
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生物样品前处理的重要性
▲进行体内药物分析时，除了极少数情况下只需将样 品进行简单处理就可以直接测定外，都要采取分离、 净化、浓缩、化学衍生化等预处理技术，为测定创 造良好的条件。
▲样品预处理是体内药物分析中极为重要的环节，也 是分析中最困难、最繁复的工作。
▲由于药物在体内存在形式不同、待测药物浓度低、 生物介质组分繁杂、待测药物类型众多、理化性质 各异等原因，所以样品前处理过程的好坏会直接影 响到样品的测定结果。
生物样品前处理方法
姓名：朱文兵 学号： 201312282995 专业：药剂学
生物样品前处理的目的
▲将药物从缀合物或结合物中释放出来，以测定药物 的总浓度。
▲将微量药物从复杂的介质中纯化、富集出来。 ▲为适应和符合分析方法所要求的专属性、灵敏度等。 ▲防止分析仪器的污染，提高测定灵敏度、准确度、
精密度和选择性等。
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生物样品前处理的考虑因素
▲药物的理化性质和存在形式 ▲待测药物的浓度范围 ▲选用的生物样品类型 ▲样品预处理与分析技术的关系 ▲药物测定的目的
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生物样品前处理-有机破坏法
▲湿法破坏
硝酸-高氯酸法、电热消化器法、电热板消化法、烘箱消化 法。
▲干法破坏
高温电阻炉灰化法、低温等离子灰化法。
▲ 常用蛋白沉淀的方法 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 离子型聚合物沉淀法
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生物样品前处理-沉淀蛋白法
▲ 甲醇、乙睛、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有机溶剂，中 性盐常用的有硫酸铵、氯化铵等。
当药物水溶性强时，一般使用甲醇和乙腈。 当对药物定量回收要求高时，一般使用三氯醋酸。 通常1体积的血浆加入1.5体积以上的乙腈或加入2体积以上的甲醇可
▲溶剂的选择原则
了解药物与溶剂的化学结构与性质，按相似相溶原则选用。 对药物的未电离分子可溶，而对电离形式的分子不溶。 沸点低、易挥发、浓集，与水不相混溶，无毒，不易燃烧。 不易形成乳化，具有较高的化学稳定性和惰性。
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生物样品前处理-液液萃取法
▲ 液-液萃取法优点
应用范围广 提取效率较高
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取发展趋势
改善填料性能，开发适用范围广的通用性填料。 与更多仪器实现在线联用。 使SPE小柱更加耐压且易于更换。
▲固相萃取新技术
固相微萃取技术 基质分散固相萃取技术 分子印迹固相萃取技术 磁力搅拌棒吸附萃取技术
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法简介
固相萃取技术（SPE）是从上世纪八十年代中期发展起 来的，广泛运用于医学、制药、环境、食品等领域。
固相萃取法（SPE）就是用固体物质作为萃取剂，采用 高效、高选择性的固定相，进行萃取的样品预处理技术。
▲固相萃取法原理
以吸附剂为固定相，当液体样品通过固定相时，保留其 中某些组分，再用适当溶剂冲出杂质。
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生物样品前处理-固相萃取法
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法优点
分析速度快，回收率高，自动化程度高。 溶剂用量少，不易产生乳化。
▲固相萃取法缺点
截面积小，流量低。 易堵塞，尤其是对生物样品。 易产生缝隙，降低提取效率。 重复性较差。
▲ 周丽华.体内药物分析测定前样品处理以及测定的基本程序 [J].内蒙古中医药,2013,10(1):116-118.
▲ 安彦.固相微萃取技术及其在药物分析中的应用[J].天津药 学,2009,21(6):52-55．
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▲ 液-液萃取法缺点
操作费时 有机溶剂用量大 易发生乳化现象
▲ 液பைடு நூலகம்液萃取新技术
液相微萃取（LPME）是在LLE基础上发展起来的，与LLE相比， LPME可以达到相同的灵敏度，同时所需的溶剂更少，比较适合于 生物样品中痕量、超痕量物质的测定。
LPME一般包括分散液相微萃取、单滴液相微萃取以及中空纤维液 相微萃取等。
主要参考文献
▲ 李章万,徐秀荣.色谱分析中生物样品的前处理方法[J].药物分 析杂志,1996,16(1):55-59.
▲ 刘松青,刘芳.药物色谱分析中生物样品的前处理方法[J].中国 医药用药评价与分析,2012,12(10):871-873.
▲ 戴国梁,居文政,谈恒山.生物样品前处理研究进展[J].中国医 院药学杂志,2013,33(6):484-487.
以除去98%以上的蛋白质。
▲ 沉淀蛋白法优点
操作简便易行
▲ 沉淀蛋白法缺点
此法仅除去了蛋白质，内源性杂质并没有除去。 运用此法处理后的样品浓度会被稀释，不利于检测。
此法所得样品不能用光。谱法检测。
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生物样品前处理-液液萃取法
▲液液萃取法简介
多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水 相中的溶解度，而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性 的水溶性物质。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂 质。
▲氧瓶燃烧法 ▲注意事项
有机破坏法均是破坏有机物，只能进行生物样品中的元素分 析。
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生物样品前处理-沉淀蛋白法
▲ 蛋白沉淀法简介 蛋白沉淀法一般是通过加入有机溶剂、酸碱盐等使蛋白质 变性而与待测组分分离。 适用于强极性药物或两性类药物，这些药物难以用有机溶 剂从血浆中提取。
然后用少量溶剂洗脱，从而达到分离、净化与浓缩的目 的。
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法适用范围
大多数液体生物样品的前处理（如血浆、尿等）。 固体、半固体样品经过处理后也可使用SPE进行分离。
▲固相萃取法操作步骤
活化：根据所选择固定相的类型使用相应的活化溶剂 上样：上样溶剂强度不宜过高 淋洗：中等强度溶剂冲去干扰杂质，同时使分析物保留 洗脱：选用离子强度较弱但能洗下待测物的洗脱溶剂