生物样品前处理方法
干湿结合生物学研究方法
干湿结合生物学研究方法在生物学研究领域，干湿结合的方法已经成为一种高效、全面的研究策略，涵盖了从生物样品的前处理到测序与表达分析等多个步骤。
干湿结合生物学研究方法结合了湿法和干法两种技术，下面将详细介绍这些内容。
1、湿法生物样品前处理湿法生物样品前处理是一种常用的样品处理方法，主要利用液体介质进行样品破碎、细胞裂解和蛋白质、核酸等生物分子的提取。
湿法处理具有高效、温和的优点，适用于大部分生物样品的处理。
湿法生物样品前处理的主要步骤包括：样品收集、细胞破碎、细胞裂解、蛋白质变性、核酸提取等。
在操作过程中，需要注意保持无菌条件，避免样品污染，同时要尽量减少对生物分子的破坏，保持其天然活性。
2、干法生物样品前处理干法生物样品前处理主要利用干粉试剂或干式生化试剂进行样品破碎、细胞裂解和生物分子的提取。
干法处理具有简便、快速、无需特殊设备的优点，适用于一些不易获得的生物样品或需要快速处理的紧急样品。
干法生物样品前处理的主要步骤包括：样品收集、细胞破碎、细胞裂解、干燥、试剂添加等。
在操作过程中，需要注意避免样品污染，保证细胞的充分破碎和裂解，同时要保证生物分子的完整性。
3、蛋白质生物样品分离与纯化蛋白质生物样品分离与纯化是生物学研究中的重要步骤，其主要目的是将目标蛋白质与其他生物分子（如核酸、脂质等）进行有效分离，从而对其进行深入研究和应用。
蛋白质生物样品分离与纯化的主要方法包括：离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、电泳等。
这些方法各有特点，适用范围也不同，需要根据具体研究需求进行选择。
在操作过程中，需要注意保证样品的均一性和回收率，同时要尽量避免非特异性吸附和样品损失。
4、DNA生物样品提取与纯化DNA生物样品提取与纯化的目的是从生物样品中提取出高质量的DNA，去除其中的杂质和干扰物质，以便进行后续的基因组学研究。
DNA生物样品提取与纯化的主要方法包括：酚氯仿抽提法、硅胶膜吸附法、磁珠法等。
这些方法都能够高效地提取和纯化DNA，但操作过程和适用范围略有不同。
生物样品前处理方法
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生物样品前处理的考虑因素
▲药物的理化性质和存在形式 ▲待测药物的浓度范围 ▲选用的生物样品类型
▲样品预处理与分析技术的关系
▲药物测定的目的
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生物样品前处理-有机破坏法
▲湿法破坏
硝酸-高氯酸法、电热消化器法、电热板消化法、烘箱消化 法。
▲干法破坏
高温电阻炉灰化法、低温等离子灰化法。
中某些组分，再用适当溶剂冲出杂质。 然后用少量溶剂洗脱，从而达到分离、净化与浓缩的目 的。
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法适用范围
大多数液体生物样品的前处理（如血浆、尿等）。
固体、半固体样品经过处理后也可使用SPE进行分离。
▲固相萃取法操作步骤
活化：根据所选择固定相的类型使用相应的活化溶剂
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法简介
固相萃取技术（SPE）是从上世纪八十年代中期发展起
来的，广泛运用于医学、制药、环境、食品等领域。 固相萃取法（SPE）就是用固体物质作为萃取剂，采用 高效、高选择性的固定相，进行萃取的样品预处理技术。
▲固相萃取法原理
以吸附剂为固定相，当液体样品通过固定相时，保留其
▲ 沉淀蛋白法优点
操作简便易行
▲ 沉淀蛋白法缺点
此法仅除去了蛋白质，内源性杂质并没有除去。
运用此法处理后的样品浓度会被稀释，不利于检测。
。 此法所得样品不能用光谱法检测。
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生物样品前处理-液液萃取法
▲液液萃取法简介
多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水 相中的溶解度，而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性 的水溶性物质。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂 质。
生物样品前处理
[5]胡小刚,李攻科.分子印迹技术在样品前处理中的应用[J].分析化学.2006,(34)7: 1035-1041
[6]张丽华，肖国平，宋游.微波技术在生物样品预处理中的应用[J].基础和应用基础研究与放射化学与核化学:133
2.对于在常温下需要长时间反应的样品，可将准备好的样品放置过夜，第2天再放进消解炉消解。
3.对于预处理时间长的难处理样品，也可采用放过夜的方法，第2天再进行消解处理。样品经过处理后，若溶液体积小于5ml时，则必须补加水或酸，使其体积不小于5ml，然后再进行微波消解。
总之,生物样品的预处理因其多样、复杂而成为整个检测过程中的关键环节。所述各种处理方法各有其特点,根据化合物的物理化学性质选择合适的前处理方法是取得满意检测结果的必要条件。
[1]周婷婷,范国荣,吴玉田.超临界流体萃取法在生物样品前处理中的应用[J].药学学报.2004 ,39(4) :317 – 320
[2]张颖.生物样品预处理技术及应用进展[J].天津药学,2006, 18(1):56-58
[3]李向阳，杨梅，彭宝珠.固相微萃取在生物药物分析中的应用[J].2002,23(4):69-71
目前各类文献上报道的MIP制备方法基本上是非共价法。在此方法中,印迹分子与功能单体之间通过分子间的非共价作用预先自组装排列,以非共价键形成多重作用位点,这种分子间的相互作用通过交联聚合后保留下来。常用的非共价作用有:氢键、静电引力、金属螯合作用、电荷转移、疏水作用以及范德华力等,其中以氢键应用最为广泛[5]。
分子印迹聚合物(molecularly imp rinted polymer, MIP)制备简单,能够反复使用,机械强度较高,稳定性好。因此它非常适合用作SPE的填充剂或SPME的涂层材料来分离富集复杂样品中的分析物,以达到分离净化和富集的目的。
生物样品前处理
Oasis HLB柱（聚合物基质）
离子交换与反相模式 混合的固相萃取
离子交换 反相作用
•强阳离子和反相双重保留基质 •常用于提取净化生物基质中的 弱碱性化合物 •酸性环境中含氮碱性基团与磺 酸基结合 •酸性药物呈分子状态发生反相 结合作用
离子交换与反相模式 混合的固相萃取
固相萃取法方法总结
SPE优点：
生物样品常用的处理方法
主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
固相萃取 (SPE)
固相萃取技术(SPE)
固相萃取(Solid Phase Extraction，简称SPE)是从
八十年代中期开始发展起来的一 项样品前处理技术。由液固萃取 和液相色谱技术相结合发展而来。 主要通过固相填料对样品组分的 选择性吸咐及解吸过程，实现对 样品的分离，纯化和富集。主要 目的在于降低样品基质干扰，提 高检测灵敏度
基质效应评价方法
柱后灌注法 提取后加入法（相对基质效应评价）
•MF：基质效应因子 •MF=Set 2/Set 1 •IS-normalized MF : 内标归一化基质效应因子
血浆
血浆
➢将采取的血液置含有抗凝剂 （如肝素、EDTA)的试管中，混 合后，3000-4000r/min离心，分 离红细胞，上清液即为血浆。 ➢测定血中药物浓度通常是指测 定血浆或血清中的药物浓度，而 不是指含有血细胞的全血中 的 药物浓度。
血清
血清
➢血清是采血后不加任何抗凝剂， 于室温下静置15-30min，待其自 然凝结后，离心，分离出上清液。 ➢血清较血浆颜色更浅，较血浆 少了大部分纤维蛋白，更易进行 处理，且血浆及血清中的药物浓 度测定值通常是相同的。
药物分析中的生物样品前处理方法研究
药物分析中的生物样品前处理方法研究近年来，随着生物医药领域的快速发展，药物分析在疾病的诊断和治疗中扮演着至关重要的角色。
为了获得准确可靠的分析结果，生物样品的前处理方法显得尤为重要。
本文将探讨药物分析中常用的生物样品前处理方法的研究进展。
一、血液样品的前处理方法研究血液样品作为一种常见的生物样品，在药物分析中扮演着重要的角色。
然而，血液样品中存在着各种成分的干扰，如蛋白质、血红蛋白等。
因此，研究人员提出了多种前处理方法来解决这些问题。
1. 血浆/血清的蛋白质沉淀方法血浆/血清中的蛋白质是最常见的干扰物之一。
为了降低蛋白质对分析结果的影响，研究人员开发了各种蛋白质沉淀方法。
例如，酸沉淀法可以通过改变pH值使蛋白质凝聚沉淀，从而去除蛋白质干扰。
此外，还有醇沉淀法、有机溶剂沉淀法等。
2. 血浆/血清的固相萃取方法固相萃取方法是血液样品前处理中常用的技术之一。
其原理是利用吸附剂对目标化合物进行特异性吸附，从而去除干扰物。
通过选择合适的吸附剂，可以实现对特定成分的富集。
例如，固相萃取柱常用于血浆/血清样品中药物的富集与净化。
二、尿液样品的前处理方法研究尿液样品常用于药物代谢和排泄的研究，但由于其复杂的成分和高度变异性，前处理方法显得尤为重要。
1. 尿液样品的前处理方法选择尿液样品前处理的关键是选择合适的方法。
常见的前处理方法包括尿液蛋白质去除、有机溶剂浓缩、尿液稀释等。
根据具体的分析需求和目标物质的特性，选择恰当的前处理方法可以显著提高分析结果的准确性和灵敏度。
2. 尿液样品的固相萃取方法研究固相萃取也是尿液样品前处理中常用的技术之一。
通过选择适当的吸附剂和前处理条件，可以有效地去除尿液中的杂质，提高目标物质的测量灵敏度。
例如，固相萃取柱结合气相色谱-质谱联用技术可以用于尿液样品中药物代谢产物的研究。
三、其他生物样品的前处理方法研究除了血液和尿液样品，还有其他生物样品在药物分析中的应用。
例如，头发样品被广泛用于毒品滥用的检测。
生物样品的预处理
蛋白酶抑制剂的添加
保护剂的添加(β-巯基乙醇、EDTA、辅酶等)
提取物缓冲液的选择(中性)
提取液的澄清( 高速离心、沉淀、吸附等)
匀浆化前的预处理(冷冻)
1.2 动物组织预处理注意事项
各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预处理方法的选择也有所不同。
01
大多数发酵产物存在于发酵液中，也有少数产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有。
螯合剂法
叁
贰
壹
酚类化合物的干扰及对策
牛血清白蛋白（BSA）法 原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会
丙酮法 用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料,可有效从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA
高速匀浆机
高速匀浆法为大规模细胞破碎的常用方法，设备由高压泵和匀浆阀组成。
研磨法与珠磨法 研磨法(实验室规模) 由陶瓷的研钵和研杆组成，加入少量研磨剂（如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土） 珠磨法(工业规模) 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英沙、氧化铝等研磨剂（直径<1 mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎,释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。 适用：微生物（细菌）与植物细胞
通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。
01
03
02
植物组织往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，较难将它们分开。含多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液，对RNA提取造成较大的干扰。
生物样本样品前处理
4
常用液液提取溶剂
溶剂名称 二氯甲烷 乙酸乙酯 氯代正丁烷
乙醚 戊烷 环己烷 正己烷 甲苯 异丙醇* 四氢呋喃* 乙腈* 正丁醇* 水*
分子量 84.9 88.1 92.6 74.1 72.2 84.2 86.2 92.2 60.1 72.1 41.1 74.1 18.0
注：“*”表示与水互溶
沸点（℃） 40
5、固相萃取法：可实现自动化，基质效应降低，同时完成样品的富
集与净化；但成本较高
3
液液提取法
利用目标化合物在生物基质和与水不互溶的有机溶剂中溶解度或分配 系数的不同，使化合物从生物基质中转移至有机相中。
➢两相的分离需借助两相的密度差来实现
➢原理：相似相溶
➢分配系数：kA=yA/xA yA和xA分别表示在萃取相和萃余相中的质量比率
常见表面活性剂：Triton-X-100，吐温等
Tips
1、表面活性剂需确立一个浓度范围而不是单一浓度。 2、样本已经采集，考虑将待测物从容器中解离出来。
14
讨论和问题
Thank you!
15
0.08 0.36 1.66 1.63 3.92 1.50 1.84
5
固相提取法
◇HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance Copolymer)材料的优点
△水可浸润 △反相保留 △PH1-14范围内稳定 △没有裸露硅羟基
6
固相提取法
7
固相提取法
8
固相提取法
改变化合物PH，酸性 保留，碱性洗脱
77.1 77
34.5 36.1 80.7
69 110.6 82.4
66 81.6 117 100
密度（g/mL) 1.33 0.90 0.89 0.71 0.63 0.78 0.66 0.87 0.79 0.89 0.78 1.00 1.00
透射电镜生物样品前处理步骤
电镜样品制备步骤1、取材：放入2.5%戊二醛溶液中固定2-4h(4℃可保存1-2周，冷冻可保存2年)注：不可用自来水冲洗，被钳、镊夹取造成机械损伤的组织不可部分可取较大面积，但厚度必须小于1mm（戊二醛固定能力小于0.5mm）2、漂洗：牙签取出样品至新的1.5ml离心管，用0.1M pH7.0磷酸缓冲液（PBS）漂洗样品三次（摇床），每次15min3、锇酸固定与再漂洗：1%锇酸溶液固定样品1-2h（临用前计算用量≤50ul/样，用0.1M PBS将2%锇酸稀释至1%，通风橱操作），吸出固定液，用0.1M pH7.0 PBS漂洗样品三次，每次15min注：漂洗以清除固定液，避免产生沉淀物干扰结构观察4、脱水剂梯度脱水：用梯度浓度（50%，70%，80%，90%和95%）乙醇溶液对样品进行脱水处理，每个浓度处理15min再用100%乙醇处理20min （乙醇细胞内抽提少，但与包埋剂相容性差）最后用纯丙酮处理20min（若包埋剂为Epon改用环氧乙烷置换）注：脱水以清除游离水以便包埋剂均匀渗透；脱水剂易吸收空气中水分，密封，置换时应该迅速由低到高逐级脱水而不能急剧脱水，更换溶液时应迅速，以免组织内外产生气泡。
5、包埋剂梯度渗透：①用包埋剂丙酮混合液（V/V=1/1）处理样品1h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)②用包埋剂丙酮混合液（V/V=3/1）处理样品3h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)③纯包埋剂渗透样品过夜：将样品移至干燥的新离心管中，常温过夜(所用器具均应干燥)注：样品周围不能有气泡6、加热聚合：牙签取出经渗透处理的样品至0.5ml干燥离心管（预先装入约300ul包埋剂），加热聚合仪70℃加热过夜。
7、莱卡EM UC 7超薄切片仪修快、切片（50-70nm）8、正染色：塑料包埋模具（刀划几道缝隙），染色时温度低影响染色效果，冬天空调醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液100ul染色（15min-1h），双蒸水冲洗柠檬酸铅100ul染色15min（极易吸收空气中CO2产生PbCO3,染色时毋对着说话、呼吸，同时放置数块NaOH）9、日立H-7650透射电镜观察spurr包埋剂配制：ERL 2.5gNSA 5.2 g 混合均匀后再加入催化剂DMAE，搅拌30min；低温干燥保存DER 2.5 gDMAE 0.1g宜新鲜配制但由于使用期限长(3-4天)，混合物可在使用前一天制备。
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▲溶剂的选择原则
了解药物与溶剂的化学结构与性质，按相似相溶原则选用。
对药物的未电离分子可溶，而对电离形式的分子不溶。
沸点低、易挥发、浓集，与水不相混溶，无毒，不易燃烧。 不易形成乳化，具有较高的化学稳定性和惰性。
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生物样品前处理-液液萃取法
▲ 液-液萃取法优点
中某些组分，再用适当溶剂冲出杂质。 然后用少量溶剂洗脱，从而达到分离、净化与浓缩的目 的。
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法适用范围
大多数液体生物样品的前处理（如血浆、尿等）。
固体、半固体样品经过处理后也可使用SPE进行分离。
▲固相萃取法操作步骤
活化：根据所选择固定相的类型使用相应的活化溶剂
生物样品前处理方法
姓名：朱文兵 学号：201312282995 专业：药剂学
生物样品前处理的目的
▲将药物从缀合物或结合物中释放出来，以测定药物 的总浓度。 ▲将微量药物从复杂的介质中纯化、富集出来。 ▲为适应和符合分析方法所要求的专属性、灵敏度等。
▲防止分析仪器的污染，提高测定灵敏度、准确度、 精密度和选择性等。
固相微萃取技术 基质分散固相萃取技术
分子印迹固相萃取技术
磁力搅拌棒吸附萃取技术
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主要参考文献
▲ 李章万,徐秀荣.色谱分析中生物样品的前处理方法[J].药物 分析杂志,1996,16(1):55-59. ▲ 刘松青,刘芳.药物色谱分析中生物样品的前处理方法[J].中 国医药用药评价与分析,2012,12(10):871-873. ▲ 戴国梁,居文政,谈恒山.生物样品前处理研究进展[J].中国医 院药学杂志,2013,33(6):484-487. ▲ 周丽华.体内药物分析测定前样品处理以及测定的基本程序 [J].内蒙古中医药,2013,10(1):116-118. ▲ 安彦.固相微萃取技术及其在药物分析中的应用[J].天津药 学,2009,21(6):52-55．
上样：上样溶剂强度不宜过高 淋洗：中等强度溶剂冲去干扰杂质，同时使分析物保留
洗脱：选用离子强度较弱但能洗下待测物的洗脱溶剂
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生物样品前处理-固相萃取法
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法优点
分析速度快，回收率高，自动化程度高。
溶剂用量少，不易产生乳化。
▲ 沉淀蛋白法优点
操作简便易行
▲ 沉淀蛋白法缺点
此法仅除去了蛋白质，内源性杂质并没有除去。
运用此法处理后的样品浓度会被稀释，不利于检测。
。 此法所得样品不能用光谱法检测。
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生物样品前处理-液液萃取法
▲液液萃取法简介
多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在 水相中的溶解度，而生物样品中的大多数内源性杂质是强极 性的水溶性物质。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分 杂质。
▲固相萃取法缺点
截面积小，流量低。
易堵塞，尤其是对生物样品。 易产生缝隙，降低提取效率。
重复性较差。
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取发展趋势
改善填料性能，开发适用范围广的通用性填料。
与更多仪器实Leabharlann 在线联用。 使SPE小柱更加耐压且易于更换。
▲固相萃取新技术
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生物样品前处理的考虑因素
▲药物的理化性质和存在形式 ▲待测药物的浓度范围 ▲选用的生物样品类型
▲样品预处理与分析技术的关系
▲药物测定的目的
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生物样品前处理-有机破坏法
▲湿法破坏
硝酸-高氯酸法、电热消化器法、电热板消化法、烘箱消化 法。
▲干法破坏
高温电阻炉灰化法、低温等离子灰化法。
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法简介
固相萃取技术（SPE）是从上世纪八十年代中期发展起
来的，广泛运用于医学、制药、环境、食品等领域。 固相萃取法（SPE）就是用固体物质作为萃取剂，采用 高效、高选择性的固定相，进行萃取的样品预处理技术。
▲固相萃取法原理
以吸附剂为固定相，当液体样品通过固定相时，保留其
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生物样品前处理的重要性
▲进行体内药物分析时，除了极少数情况下只需将样 品进行简单处理就可以直接测定外，都要采取分离 、净化、浓缩、化学衍生化等预处理技术，为测定 创造良好的条件。 ▲样品预处理是体内药物分析中极为重要的环节，也 是分析中最困难、最繁复的工作。 ▲由于药物在体内存在形式不同、待测药物浓度低、 生物介质组分繁杂、待测药物类型众多、理化性质 各异等原因，所以样品前处理过程的好坏会直接影 响到样品的测定结果。
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▲氧瓶燃烧法 ▲注意事项
有机破坏法均是破坏有机物，只能进行生物样品中的元素 分析。
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生物样品前处理-沉淀蛋白法
▲ 蛋白沉淀法简介 蛋白沉淀法一般是通过加入有机溶剂、酸碱盐等使蛋白质 变性而与待测组分分离。 适用于强极性药物或两性类药物，这些药物难以用有机溶 剂从血浆中提取。 ▲ 常用蛋白沉淀的方法 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 离子型聚合物沉淀法
应用范围广 提取效率较高
▲ 液-液萃取法缺点
操作费时 有机溶剂用量大 易发生乳化现象
▲ 液-液萃取新技术
液相微萃取（LPME）是在LLE基础上发展起来的，与LLE相比，LPME
可以达到相同的灵敏度，同时所需的溶剂更少，比较适合于生物样 品中痕量、超痕量物质的测定。 LPME一般包括分散液相微萃取、单滴液相微萃取以及中空纤维液相 微萃取等。
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生物样品前处理-沉淀蛋白法
▲ 甲醇、乙睛、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有机溶剂，中 性盐常用的有硫酸铵、氯化铵等。
当药物水溶性强时，一般使用甲醇和乙腈。
当对药物定量回收要求高时，一般使用三氯醋酸。
通常1体积的血浆加入1.5体积以上的乙腈或加入2体积以上的甲醇可
以除去98%以上的蛋白质。