生物样品前处理

第四节 生物样品分析的前处理技术一般要在测定之前进行样品的前处理，即进行分离、纯化、浓集，必要时还需对待测组分进行化学衍生化，从而为测定创造良好的条件。

生物样品进行前处理的目的在于：1．药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体外。

在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物之外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙（glucuronides）、硫酸酯（sulphates）缀合物等多种形式存在，需要分离后测定药物及代谢物；2．生物样品的介质组成比较复杂。

如在血清中既含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物，也含有Na ＋、K＋、X-等无机化合物］。

其中影响最大的是蛋白质，若用HPLC法测定药物浓度时，蛋白质会沉积在色谱柱上发生堵塞，严重影响分离效果。

因此，为了保护仪器，提高测定的灵敏度，必须进行除蛋白等前处理。

一、常用样品的种类、采集和贮藏生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比较容易得到的血液（血浆、血清、金血）、尿液、唾液。

在一些特定的情况下选用乳汁、脊髓液、精液等。

（一）血样血浆（plasma）和血清（serum）是最常用的生物样品。

血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。

供测定的血样应能代表整个血药浓度，因而应待药物在血液中分布均匀后取样。

由采集的血液制取血浆或血清。

血浆的制备 将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝萦、草酸盐、拘橡酸盐、EDTA、氟化钠等）的试管中，混合后，以2500～3000rpm离心5min使与血细胞分离，分取上清液即为血浆。

血清的制备 将采取的血样在室温下至少放置30min到1h，待凝结出血饼后，用细竹捧或玻璃棒轻轻地剥去血饼，然后以2000～3000rpm离心分离5～10min，分取上清液．即为血清。

血浆比血清分离快，而且制取的量多，其量约为全血的一半。

血浆及血清中的药物浓度测定值通常是相同的。

基于上述原因，现在国外多采用“专用血清”来测定药物的浓度。

血样的采血时间间隔应随测定目的的不同而异。

如进行治疗药物浓度监测（therapeutic drug monitoring，TDM）时，则应在血中药物浓度达到稳态后才有意义。

但每种药物的半衰期不同，因此达到稳态的时间也不间，取样时间也随之不同。

采取血样后，应及时分离血浆或血清，并最好立即进行分析。

如不能立即测定时，应妥善储存。

血浆或血清样品不经蒸发、浓缩，必须置硬质玻璃试管中完全密塞后保存。

要注意采血后及时分离出血浆或血清再进行储存。

若不预先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时引起细胞溶解从而妨碍血浆或血清的分离或因溶血影响药物浓度变化。

（二）唾液唾液由腮腺、颌下腺、舌下腺和口腔粘膜内许多散在的小腺体分泌液混合组成的，平时所说的唾液就是指此混合液。

唾液的相对密度为1.003～1.008；pH值在6.2～7.6之间变动，分泌量增加时趋向碱性而接近血液的pH值；通常得到的唾液含有粘蛋白，其粘度是水的1.9倍。

唾液的采集应尽可能在剌激少的安静状态下进行。

一般在漱口后15min收集。

也可以采用物理的（如嚼石蜡块、橡胶、海绵）或化学的（如酒石酸）等方法剌激，使在短时间内得到大量的唾液。

唾液中含有粘蛋白，唾液的粘度由粘蛋白的含量多少而定。

用唾液作为样品测定药物浓度有几个优点：1．与采取血样不同，患者自己可以不受时间和地点的限制，很容易地反复采集；2．采集时无痛苦无危险；3．有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度（三）尿液采用尿样测定药物浓度的目的与血液、唾液样品不同。

尿药测定主要用于药物剂量回收研究、尿清除率、生物利用度的研究，并可推断患者是否违反医嘱用药，同时根据药物剂量回收研究可以预测药物的代谢过程及测定药物的代谢类型（代谢速率，MR）等。

尿液主要成分是水、含氮化合物（其中大部分是尿素）及盐类。

采集的尿是自然排尿。

尿包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。

测定尿中药物浓度时应采用时间尿，时间尿以外的尿不可能推断全尿中药物的排泄浓度和药物总量。

因此，测定尿中药物的总量时，将一定时间内（如8h、12h或24h等）排泄的尿液全部储在起来，并记录其体积，取其一部分测定药物浓度，然后乘以尿量求得排泄总量。

采集的尿样应立即测定。

若收集24h的尿液不能立即测定时，应加入防腐剂置冰箱中保存。

常用防腐剂有：甲苯、二甲苯、氯仿、麝香草酚以及醋酸、浓盐酸等。

利用甲苯等可以在尿液的表面形成薄膜，醋酸等可以改变尿液的酸碱性来抑制细菌的生长。

保存时间为24～36h，可置冰箱（40C）中，长时间保存时，应冰冻（－20C）。

二、生物祥品分析前处理技术（一）去除蛋白质在测定血样时，首先应去除蛋白质。

去除蛋白质可使结合型的药物均出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能（如保护HPLC柱不被沾污），延长使用期限。

去除蛋白法有以下几种。

1.加入与水相混溶的有机溶剂可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。

常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。

2.加入中性盐 加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化。

中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。

常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。

3.加入强酸当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。

此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶住盐而沉淀。

常用的强酸有：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5％偏磷酸等。

。

4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。

常用的沉淀剂有CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等。

离心分离后所得的上清液pH分别为5.7～7.3和6.5～7.5。

5.酶解法在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。

最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。

它不仅可使组织酶，并可使药物析出。

枯草菌溶素是一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在较宽的pH活圈（PH7.0～11.0）内使蛋白质的肽键降解，在50～60℃具有最大活力。

酶解法的优点是：可避兔某些药物在酸及高温下降解：对与蛋白质结合牢的药物（如保泰松、苯妥英纳），可显著改善回收率；可用有机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象生成，当采用HPLC法检测时，无需再进行过多的净化操作。

酶解法的主要问题是不适用于在碱性下易水解的药物。

（二）缀合物的水解尿中药物多数呈缀合状态。

一些含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸甙缀合物；还有一些含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。

由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取。

为了测定尿液中药物总量，无论是直接测定或萃取分离之前，都需要将缀合物中的药物释出。

有些药物仅需较温和条件即可使药物游离，有些则需较剧烈的方法，常用酸水解或酶水解的方法。

（三）分离、纯化与浓集提取法是应用最多的分离、纯化方法。

提取的目的是为了从大量共存物中分离出所需要的微量组分----药物及其代谢物，并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集。

提取法包括液-液提取法和液-固提取法。

1.液-液提取法（liquid-liquid extraction，LLE）多数药物是亲脂性的，在适当的溶剂中的溶解度大于水相中的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。

因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后作为分析用样品。

最常用的溶剂是乙醚和氯仿等。

液-液提取法的优点在于它的选择性，这是依赖于有机溶剂的选择；药物能与多数内源性物质分离；而且在使用非专属性的光谱法分析时，这是一个很大的优点。

液-液提取法的缺点在于乳化现象的产生。

乳化作用能引起药物的损失，从而导致较低的回收 。

２.液-固提取法（liquid-solidｅｘｔｒａｔｉｏｎ，ＬＥＳ）液－固提取法是近十几年来在纯化生物样品时被广泛采用的方法。

也可以认为是规模缩小的柱色谱法。

这种方法是应用液相色谱法原理处理样品。

最大的优点为处理样品速度快、并在室温下操作，尤其适用于处理挥发性及对热不稳定药物。

常用于填充柱的担体大致分为两类：第一类为亲水性的硅藻土等，第二类常用疏水性的活性炭、聚苯乙烯或Ｃ化学键硅胶等，它们可从样品中吸附亲脂性药物，然后用有机溶剂分离药物。

１８（四）化学衍生化分离前将药物进行化学衍生化的目的是：（１）使药物变成具有能被分离的性质；（２）提高检测灵敏度；（３）增强药物的稳定性；（４）提高对光学异构体分离的能力等。

、－ＮＨ 等。

药物分子中含有活泼Ｈ者均可被化学衍生化，如含有－ＣＯＯＨ、－ＯＨ、ＮＨ２、测定方法的效能指标任何一种分析测定方法，根据其使用的对象和要求，都应有相应的效能指标。

一般，常用的分析效能评价指标包括：精密度、准确度、检测限、定量限、选择性、线性与范围、重现性、耐用性等；对于生物样品中药物分析方法评价的标准与上述的评价指标相比较，有共同之点也有特殊的要求。

测定方法的效能指标可以作为对分析测定方法的评价尺度，也可以作为建立新的测定方法的实验研究依据。

下面分别作简要、介绍：一、精密度精密度（precision）系指用该法测定同一匀质样品的一组测量值彼此符合的程度。

它们越接近就越精密。

在药物分析中，常用标准差（S）或相对标准差（RSD）表示：1．标准（偏）差（standard deviation，SD或S）2．相对标准（偏）差（rdative standard deviation，RSD），也称变异系数（coefficient of variation，CV）。

生物样品分析时，常用RSD表示精密度，并可细分为批内（或日内）精密度及批间（或日间）精密度。

批内精密度（within－run precision）：是同一次测定的精密度。

通常采用高、中、低三种浓度的同一样品各7～10份，每种浓度的样品按所拟定的分析方法操作，一次开机后，一一测定。

计算每种浓度样品的SD值及RSD值。

批内精密度也可视为日内精密度（with－in－day precisiｏn）。

所得RSD应争取达到5％以内［17－181，但不能超过10％。

批间精密度（between-run precision）：是不同次测定的精密度。

通常采用高、中、低三种浓度的同一样品，每种浓度配制7～10份，置冰箱冷冻。

自配制样品之日开始，按所拟定的分析方法操作，每天取出一份测定，计算每种浓度样品的SD值及RSD值。